Cel mai bun serviciu de monitorizare a actelor publicate in Monitorul Oficial
W(r)= ─────────── x 100
m(1) - m(5)
unde:
W(r) = conţinutul total de substanta uscata în g/100g,
m(5) = masa, în grame, a placii şi a capacului (a se vedea 6.a.)
m(1) = masa, în grame, a placii, capacului şi a probei de lucru (6.b.)
m(2) = masa, în grame, a placii, capacului şi probei uscate de testat (6.c.5).
Valoarea obţinutã se rotunjeste cu o precizie de 0,01% (procent de masa).
b) Precizie
1. Repetabilitate (r): 0,10 g din totalul de substanta uscata/100 g produs.
2. Reproductibilitate (R): 0,20 g din totalul de substanta uscata/100 g produs.
CAP. 2
Determinarea conţinutului de grasime
1. Scopul şi domeniul de aplicare
Aceasta procedura precizeazã metoda de referinta pentru determinarea conţinutului de grasime din lapte crud, integral, lapte parţial smantanit şi lapte smantanit.
2. Definitie
Conţinutul de grasime a laptelui reprezintã toate substantele determinate prin metoda specifica. Acest conţinut este exprimat prin procente de masa.
3. Principiul metodei
Principiul metodei consta în extragerea grasimii dintr-o soluţie alcoolicã amoniacala din proba de lapte, cu dietil eter şi eter petrol, solventii se elimina prin distilare sau evaporare şi se determina masa substanţei extrase solubila în eter petrol. Procedura este cunoscutã uzual ca metoda Rose-Gottileb.
4. Reactivi
Toţi reactivii trebuie sa fie de o calitate analitica cunoscutã şi sa nu lase reziduuri apreciabile atunci când sunt supuşi testului blank.
Pentru a testa calitatea reactivilor, se efectueazã o determinare asa cum este specificat la punctul 6.c. din prezentul capitol. Se foloseşte o fiola goala, un pahar de laborator sau o placa de metal (5.h) pentru cantarire, pregãtite asa cum este specificat la pct. 6 lit. d. din prezentul capitol, ca o ţara - pentru a se permite corectarea efectelor asupra rezultatului cantaririi, cauzate de schimbãrile de condiţii atmosferice. Dacã reziduul corectat pentru aparenta schimbare a masei tarei este mai mare de 2,5 mg, se determina reziduul sau solventul separat, prin evaporarea a 100 ml dietil eter (4.d) şi respectiv a 100 ml eter petrol (4.e). Se foloseşte, de asemenea, o ţara pentru cantarire. Atunci când cantitatea de reziduu este mai mare de 2,5 mg, se elimina solventul prin intermediul distilarii sau aceasta se înlocuieşte.
Reactivii utilizaţi sunt:
a) Soluţia de amoniac, ce conţine aproximativ 25% (m/m) de NH(3). Poate fi folositã şi o soluţie mai concentrata de amoniac (conform pct. 6 lit. e pct. 1 din prezentul capitol şi pct. 5 lit. a) din "Apendix").
b) Etanol, de cel puţin 94% (v/v). Poate fi folosit etanolul denaturat prin metanol, cu condiţia sa fie sigur faptul ca nu sunt afectate rezultatele determinãrii.
c) Soluţie de roşu de Congo şi roşu crezol. Se dizolva în apa 1 g de roşu de Congo sau crezol şi se dilueaza la 100 ml.
Nota: Folosirea acestei soluţii ce permite ca suprafata de separaţie între solvent şi stratul apos sa fie vãzutã mai clar, este opţionalã (conform pct. 6.e.2.). Pot fi folosite şi alte soluţii apoase colorate, cu condiţia ca acestea sa nu afecteze rezultatul determinãrii.
d) Dietil eter fãrã peroxizi şi care nu conţine mai mult de 2 mg/kg de antioxidanti şi îndeplineşte cerinţele testului blank (6.c).
e) Eter petrol, având orice limita de fierbere între 30 şi 60ιC.
f) Solvent amestec, preparat cu scurt timp înainte de folosire prin amestecarea unor volume egale de dietil eter (4.d) şi eter petrol.
5. Aparatura şi sticlarie
Atentionare: Din moment ce determinarea implica folosirea unor solventi volatili inflamabili, orice aparat electric folosit trebuie sa fie în conformitate cu legislaţia referitoare la utilizarea unor astfel de solventi.
Echipament de laborator obişnuit, în special:
a) Balanţa analitica
b) Centrifuga, în care fiolele sau tuburile de extracţie a grasimii (5.f) se pot roti la o frecventa de rotaţie de 500-600 turatii/minut pentru a produce un camp gravitational de 80-90 g la capatul deschis al fiolelor sau tuburilor.
Nota: folosirea centrifugii este opţionalã (6.e.5).
c) Aparat de distilare sau evaporare, pentru a permite solventilor şi etanolului sa fie distilate din fiole sau sa fie evaporate din paharele gradate şi capsule (pct. 6 lit. e) pct. 12 şi pct. 6 lit. e) pct. 15) la o temperatura ce nu depãşeşte 100°C.
d) Etuva cu încãlzire electrica, cu usi de ventilaţie deschisã, ce poate fi reglata la o temperatura de 102 ± 3°C în tot spaţiul de lucru. Etuva trebuie sa fie prevãzutã cu un termometru corespunzãtor.
e) Baie de apa ce poate fi menţinutã la o temperatura de 35-40°C.
f) Fiole de extracţie a grasimii tip Molonnier
Nota: Este, de asemenea, posibil sa se foloseascã tuburi de extracţie a grasimii cu sifon sau dispozitiv de spalare dar atunci procedura este diferita şi este specificat în "Apendix".
Fiolele sau tuburile trebuie sa fie prevãzute cu dopuri de sticla, dopuri de pluta de buna calitate sau alte tipuri de dopuri ce nu sunt afectate de reactivii folosiţi. Dopurile de pluta trebuie sa fie supuse extragerii cu dietil eter (4.d), ţinute în apa la 60ιC sau mai mult, timp de cel puţin 15 minute şi apoi trebuie lãsate sa se raceasca în apa rece, astfel încât, în momentul folosirii, acestea sa fie impregnate.
g) Stativ pentru menţinerea fiolelor sau tuburilor de extracţie a grasimii (conform pct. 5.f).
h) Flacon de spalare corespunzãtor, pentru folosire cu solvent amestec (4.f). Nu trebuie sa fie folosite flacoane de spalare din plastic.
i) Recipiente pentru colectarea grasimii, de exemplu fiole de fierbere cu fund plat, fiole Erlenmeyer cu capacitate de 125-250 ml sau capsule metalice.
Dacã sunt folosite capsule metalice, acestea trebuie sa fie, de preferinta, din oţel inoxidabil, trebuie sa fie cu fund plat, preferabil cu tub şi trebuie sa aibã un diametru de 80-100 mm şi o înãlţime de aproximativ 50 mm.
j) Reglator de fierbere, degresat - din portelan neporos sau carbid silicon ori granule din sticla, optional în cazul capsulelor metalice.
k) Cilindrii de mãsurare, de capacitãţi de 5 şi 25 ml.
l) Pipete gradate de capacitate de 10 ml.
m) Clesti confectionati din metal corespunzatori, pentru preluarea fiolelor, paharelor sau capsulelor.
6. Procedura
Nota: Procedura alternativa ce foloseşte tuburi de extracţie a grasimii, cu sifon sau dispozitive de spalare a flaconului (conform notei de la punctul 5.f.) este descrisã în "Apendix".
a) Pregãtirea probei de testat
Este necesarã ajustarea temperaturii probei de laborator la aproximativ 35-40°C în 15 minute, prin intermediul unei bãi de apa. Proba se amesteca complet dar cu grija, rasturnand flaconul cu proba, fãrã a produce spuma sau a se separa untul şi se raceste rapid la aproximativ 20°C.
b) Proba de testat
Se amesteca proba de testat (6.a.) prin rãsturnarea cu grija a flaconului de trei sau patru ori şi se cantaresc imediat, cu o precizie de 0,1 mg, 10-11 g din proba de testat, direct sau prin diferenţa, într-unul dintre flacoanele de extracţie (5.f).
Proba de testat trebuie sa fie transferata, cat mai complet posibil în bulbul (mic) de extracţie al fiolei.
c) Testul blank
Testul blank se efectueazã simultan cu determinarea, folosindu-se aceeaşi procedura şi aceiaşi reactivi dar inlocuind proba de testat cu 10-11 ml de apa.
Schimbarea în masa aparenta a recipientului de colectare a grasimii, corectat pentru schimbarea aparenta în masa a recipientului de control, nu trebuie sa fie mai mare de 2,5 mg.
d) Pregãtirea recipientului de colectare a grasimii
Se usucã un recipient (5.i) împreunã cu putine reglatoare de fierbere (5.j) pentru a se realiza fierberea moderata pe durata eliminãrii ulterioare a solventului în etuva, (5.d) timp de o ora. Se lasa vasul sa se raceasca (nu în desicator, dar protejat de praf) la temperatura camerei de cantarire. Recipientele de sticla se lasa cel puţin o ora iar recipientele de metal se lasa cel puţin 30 minute. Se are grija sa se evite variatiile de temperatura, se folosesc clesti pentru punerea recipientului în balanţa şi se cantareste cu o precizie de 0,1 mg.
e) Determinarea
1. Se adauga 2 ml de soluţie de amoniac (4.a) sau un volum echivalent dintr-o soluţie mai concentrata de amoniac şi se amesteca complet cu proba de testat în bulbul mic al fiolei. Dupã adãugarea soluţiei de amoniac, se are grija sa se efectueze determinarea fãrã întârziere.
2. Se adauga 10 ml de etanol (4.b) şi se amesteca moderat dar incomplet, permitandu-se ca de fapt conţinutul fiolei sa migreze înainte şi înapoi între cei doi bulbi; Se evita scurgerea lichidului cãtre gatul fiolei. Dacã este necesar, se adauga doua picaturi de soluţie de roşu de Congo sau roşu crezol (4.c).
3. Se adauga 25 ml de dietil eter (4.d), se închide fiola cu un dop de pluta imbibat cu apa sau un dop umezit cu apa (vezi 5.f) şi se scutura fiola viguros dar nu excesiv, pentru evitarea formãrii unei emulsii persistente, timp de un minut cu fiola în poziţie orizontala cu bulbul mic în sus. Periodic, se lasa ca lichidul sa se scurgã din bulbul mare în bulbul mic. Dacã este necesar, fiola se raceste în apa de la robinet, apoi se indeparteaza cu grija dopul şi se spala aceasta şi gatul fiolei cu o cantitate mica din solventul amestec (4.f) folosind dispozitivul de spalare (5.h) astfel încât soluţia de spalare sa se scurgã în fiola.
4. Se adauga 25 ml de eter petrol (4.e), fiola se închide cu dopul reumezit prin cufundare în apa şi se agita moderat timp de 30 secunde, conform descrierii de la pct. 6.c.3.
5. Fiola închisã se centrifugheaza timp de 1-5 minute la o frecventa de rotaţie de 500-600 turatii/minut (5.b). Dacã nu este disponibilã o centrifuga (conform notei de la pct. 5.b.) se lasa fiola închisã pe stativ (5.g) timp de cel puţin 30 minute pana ce stratul de supernatant este limpede şi este clar separat de stratul apos. Dacã este necesar, fiola se raceste sub jet de apa de la robinet.
6. Se indeparteaza cu grija dopul de pluta sau dopul folosit şi se clateste acesta împreunã cu fata interioarã a gatului fiolei, cu o cantitate de solvent amestec (4.f), astfel încât lichidul de spalare sa se scurgã în fiola. Dacã suprafata de separaţie este sub baza gatului fiolei, aceasta se ridica uşor deasupra acestui nivel prin adaugare de apa, cu grija, în partea de jos a fiolei pentru a se facilita decantarea solventului.
7. Ţinând fiola de extracţie de bulbul mic se decanteaza, cu grija, cat mai mult posibil din stratul de supernatant, în recipientul de colectare a grasimii, deja pregãtit (6.d) şi care în cazul fiolelor conţine reglatoare de fierbere (5.j), optional în cazul capsulelor de metal, evitandu-se decantarea oricãrui tip de strat apos.
8. Se clateste partea exterioarã a gatului fiolei de extracţie cu o cantitate mica de solvent amestec (4.d) colectandu-se lichidul de spalare în recipientul de extracţie a grasimii şi avându-se grija ca solventul amestec sa nu se scurgã în afarã fiolei de extracţie. Dacã se doreşte, solventul sau o parte din solvent poate fi îndepãrtat prin distilare sau evaporare, asa cum este descris la pct. 6.c.1.
9. Se adauga 5 ml de etanol (4.b) la conţinutul fiolei de extracţie, folosindu-se etanolul pentru spalarea partii interioare a gatului fiolei, asa cum este descris la punctul 6.e.2.
10. Se efectueazã o extracţie secundarã prin repetarea operaţiunii descrise la pct. 6.e.3. şi 6.e.8. dar folosindu-se numai 15 ml de dietil eter (4.d) şi 15 ml de eter petrol (4.e); eterul se foloseşte pentru spalarea interiorului gatului fiolei de extracţie. Dacã este necesar, se ridica suprafata de separaţie la mijlocul trunchiului fiolei, pentru a permite ca decantarea finala a solventului sa fie cat mai completa posibil.
11. Se efectueazã o a treia extracţie, prin repetarea ulterioara a operaţiunilor descrise la pct. 6.e.3. şi 6.e.8., dar folosind numai 15 ml de dietil eter (4.d) şi 15 ml de eter petrol (4.e). Eterul se foloseşte pentru spalarea interiorului gatului fiolei de extracţie. Dacã este necesar, se ridica suprafata de separaţie la mijlocul trunchiului fiolei pentru a permite ca decantarea finala a solventului sa fie cat mai completa posibil.
În cazul laptelui ecremat, a treia extracţie poate fi omisa.
12. Se indeparteaza solventii, inclusiv etanolul, din paharul gradat sau din capsula, cat mai complet posibil din fiola de distilare, prin evaporare (5.c), clatind interiorul gatului fiolei, înainte de începerea distilarii cu o cantitate mica de solvent amestec (4.f).
13. Se incalzeste recipientul de colectare a grasimii, (cu fiola plasata pe aceeaşi parte pentru a permite degajarea vaporilor de solvent) timp de o ora, în etuva (5.d). Se indeparteaza recipientul de colectare a grasimii din etuva, se lasa sa se raceasca, nu în desicator dar protejat de praf, la temperatura camerei de cantarire (în cazul recipientelor de sticla se lasa cel puţin o ora, iar pentru capsulele de metal se lasa cel puţin 30 minute) şi se cantareste cu o precizie de 0,1 mg.
Nu trebuie sa se stearga recipientul imediat înainte de cantarire. Vasul se pune în balanţa folosind clestii şi se evita, în special, variatiile de temperatura.
14. Se repeta operaţiunile descrise la punctul 6.e.13 pana ce masa recipientului de colectare a grasimii descreste cu 0,5 mg sau mai puţin sau creste, între doua cantariri succesive. Se înregistreazã masa minima observata ca masa a recipientului de colectare a grasimii şi a substanţei extrase.
15. Se adauga 15 ml de eter petrol în recipientul de colectare a grasimii pentru a se verifica dacã substanta extrasa este sau nu solubila în totalitate. Se incalzeste cu grija şi se agita solventul pana ce se dizolva grasimea.
Dacã substanta extrasa este total solubila în eter petrol, se obţine masa grasimii ca diferenţa dintre masa finala a recipientului ce conţine substanta extrasa (6.5.14) şi masa iniţialã a acestuia (6.d).
16. Dacã substanta extrasa nu este total solubila în eter petrol sau în caz de dubiu, se extrage complet substanta din recipient, prin spalare repetatã cu eter petrol cald.
Se lasa sa se depunã orice urma de substanta insolubila şi se decanteaza cu grija eter petrolul, fãrã a se îndepãrta substanta insolubila. Se repeta aceasta operaţiune de încã trei ori, folosindu-se eter petrolul pentru spalarea suprafeţei interioare a gatului recipientului.
În final, se spala suprafata exterioarã superioarã a recipientului cu solvent amestec astfel încât solventul sa nu se imprastie în afarã recipientului. Se indeparteaza urmele uşoare de eter petrol din recipient, prin încãlzire timp de o ora în etuva, se lasa sa se raceasca şi se cantareste, asa cum este descris la pct. 6 lit. e) pct. 13 şi pct. 6 lit. e) pct. 14.
Se obţine masa grasimii, ca diferenţa între masa determinata la pct. 6 lit. e) pct. 14. şi masa finala.
7. Exprimarea rezultatelor
a) Calcul şi formula
Conţinutul de grasime se calculeazã ca un procent de masa prin:
[m(1) - m(2)] - [m(3) - m(4)]
F = ───────────────────────────── x 100
m(5)
unde:
F = conţinutul de grasime
m(5) = masa, în grame, a probei de testat (6.b.)
m(1) = masa, în grame, a recipientului de colectare a grasimii şi a substanţei extrase determinate la pct. 6.e.14.
m(2) = masa, în grame, a recipientului de colectare a grasimii pregãtit sau în cazul substanţelor nedizolvabile, masa recipientului de colectare a grasimii şi a reziduurilor nedizolvate determinate la pct. 6 lit. e) pct. 16.
m(3) = masa în grame a recipientului de colectare a grasimii folosit la testele blank (6.c) şi orice substanta extrasa, determinata la pct. 6 lit. e) pct. 14.
m(4) = masa în grame a recipientului pregãtit pentru colectarea grasimii (6.b.) folosite la testul blank (6.c.) sau în cazul substanţelor nedizolvate, masa recipientului de colectare a grasimii şi reziduurile insolubile determinata la pct. 6 lit. e) pct. 16.
Rezultatul se raporteazã cu o precizie de 0,01%.
b) Precizia
1. Repetabilitatea (r):
(i) pentru laptele integral sau laptele parţial ecremat: 0,02 g de grasime per 100 g produs,
(ii) pentru laptele degresat: 0,01 g de grasime per 100 g produs.
2. Reproductibilitatea (R):
(i) pentru laptele integral: 0,04 g de grasime per 100 g produs,
(ii) pentru laptele parţial ecremat: 0,03 g de grasime per 100 g produs,
(iii) pentru laptele degresat: 0,025 g de grasime per 100 g produs.
CAP. 3
Determinarea substanţei uscate negrase
1. Scopul şi domeniul de aplicare
Aceasta procedura precizeazã metoda de referinta pentru determinarea substanţei uscate negrase din laptele tratat termic.
2. Definitie şi calcul
Conţinutul de substanta uscata negrasa trebuie sa fie exprimat ca un procent de masa. Conţinutul de substanta uscata negrasa reprezintã diferenţa dintre substanta uscata totalã, conform cap. I din prezenta anexa, şi conţinutul de grasime, conform cap. II din prezenta anexa.
CAP. 4
Determinarea conţinutului total de azot
1. Scopul şi domeniu de aplicare
Aceasta procedura precizeazã metoda de referinta pentru determinarea conţinutului de azot total din lapte crud, lapte parţial ecremat şi lapte ecremat.
2. Definitie
Conţinutul total de azot al laptelui reprezintã conţinutul de azot, exprimat în procent de masa, determinat prin metoda specificatã Kjeldahl.
3. Principiu
O cantitate cantarita din proba de lapte este supusã digestiei cu acid sulfuric concentrat şi sulfat de potasiu şi sulfat de cupru (II) ca şi catalizator, pentru a transforma azotul din compusii organici în sulfat de amoniu. Amoniacul se elimina prin adãugarea soluţiei de hidroxid de sodiu şi apoi se distileaza şi se absoarbe într-o soluţie de acid boric. Aceasta este titrata apoi cu soluţie acida.
4. Reactivi
a) Sulfat de potasiu [K(2)SO(4)]
b) Soluţie de sulfat de cupru. Se dizolva într-un recipient volumetric 5,0 g de sulfat de cupru pentahidrat [CuSO(4), 5H(2)O] în apa şi se aduce la 100 ml (la 20°C).
c) Acid sulfuric, cel puţin 98,0% (m/m) H(2)SO(4)
d) Soluţie de hidroxid de sodiu, 47% (m/m) 704 g NaOH/l (20°C).
Nota: Poate fi folositã o soluţie de hidroxid de sodiu cu o concentraţie mai mica, de exemplu: 40% (m/m) 572 g/l, 20°C sau 30% (m/m) 399 g/l, 20°C.
e) Soluţie de acid boric. Se dizolva 40 g de acid boric [H(3)BO(3)] într-un litru de apa calda, se lasa sa se raceasca şi se pãstreazã într-o sticla din borosilicat.
f) Soluţie indicator. Se dizolva 0,01 g roşu metil, 0,02 g de albastru de bromtimol şi 0,06 g verde de bromcrezol în 100 ml de etanol. Soluţia se pãstreazã într-o sticla de culoare maro, închisã, într-un loc intunecos şi rece.
g) Soluţie volumetrica
c [1/2 H(2)SO(4)] sau c (HCl) = 0,1 mol/l standardizat cu o precizie de 0,0001 mol/l.
h) Zaharoza fãrã azot.
i) Sare de amoniu pura, ca oxalatul de amoniu [NH(4)](2)C(2)O(4), H(2)O] sau sulfatul de amoniu [NH(4)](2)SO(4).
j) Triptofan [C(11)H(12)N(2)O(2)], fenacetin [C(15)H(7)CH(2)CONH(2)] sau lizina mono- sau dihidroclorid [C(6)H(14)N(2)O(2) x HCl sau [C(6)H(14)N(2)O(2) x 2HCl).
Nota: Gradul de puritate a reactivilor de la pct. i) şi j) trebuie sa fie de o calitate superioarã fata de "calitatea analitica". Dacã este posibil, trebuie sa se foloseascã o soluţie de sare de amoniu certificatã (i).
5. Aparatura şi sticlarie
Echipament de laborator obişnuit şi în special:
a) Baloane Kjeldahl de 500 ml capacitate.
b) Reglatoare de fierbere corespunzãtoare, de exemplu, bile de sticla cu diametrul de aproximativ 5 mm, granule Hengar, piatra ponce.
c) Eprubeta gradata sau pipeta automatã ce depune 1,0 ml.
d) Cilindri gradati de mãsurare, din sticla, cu o capacitate de 50, 100 şi 250 ml.
e) Aparat de digestie, într-o poziţie inclinata (aproximativ 45°), cu incalzitor electric sau bec de gaz, ce nu incalzeste fiolele deasupra nivelului conţinutului acestora, cu sistem de extracţie a fumului.
f) Aparat de distilare confectionat din sticla de borosilicat, în care se poate instala balonul Kjeldahl (a.), constând într-un cap de stropire eficient conectat la un condensator cu tuburi interne drepte şi cu un tub de evacuare atasat la capatul inferior al acestuia. Tubulatura de conectare şi dopul (s) trebuie sa inchida etans şi preferabil sa fie din cauciuc neopren.
g) Pipete sau pipete automate, pentru a furniza 0,10 ml.
h) Fiole conice cu capacitate de 500 ml, gradate pana la 200 ml.
i) Eprubete gradate cu capacitate de 50 ml, gradate la 0,1 ml şi eroare maxima ± 0,05 ml.
j) Lupe pentru citirea eprubetei (5.9).
k) Ph-metru
l) Eprubete gradate automate.
6. Procedura
a) în balonul Kjeldahl (5.a) se adauga reglatoare de fierbere (5.b) (adicã trei bile de sticla), 15 g de sulfat de potasiu (4.a), 1,0 ml de soluţie de sulfat de cupru (4.b), aproximativ 5 g din proba de lapte (cantarita cu o precizie de 0,001 g) şi 25 ml acid sulfuric (4.c). Se foloseşte acid pentru spalarea oricãrei urme de soluţie de sulfat de cupru, sulfat de potasiu sau lapte de pe gatul balonului şi se amesteca cu grija conţinutul balonului.
Nota: Deoarece substantele organice consuma acidul sulfuric în timpul fierberii, se folosesc pentru digestie 30 ml de H(2)SO(4) (4.c) în loc de 25 de ml, dacã laptele conţine mai mult de 5,0% (m/m) grasime. Acest lucru trebuie, de asemenea aplicat la testul blank.
b) Fiecare balon Kjeldahl se incalzeste pe aparatul de digestie (5.e), la început uşor, astfel încât toatã spuma neagra sa rãmânã în balon. Atunci când spumarea iniţialã a încetat şi apar vapori albi abundenti, se fierbe puternic (vaporii de acid se vor condensa la jumãtatea gatului balonului) pana când nu mai rãmân particule negre şi pana ce conţinutul balonului devine limpede de culoare albastru-verzui pal. Se fierbe apoi uşor cel puţin 1,5 ore. Se reţin urmãtoarele cerinţe:
(i) timpul de limpezire a substanţei digerate nu trebuie sa fie mai mare de o ora, iar timpul total de digestie nu trebuie sa fie mai mic de 2,5 ore. Dacã este necesar mai mult de o ora pentru limpezire, timpul total de digestie trebuie sa se prelungeascã în consecinta.
(ii) sulfatul de potasiu adãugat favorizeazã digestia pe mãsura ce creste temperatura de fierbere a amestecului. Dacã volumul rezidual de H(2)SO(4) este mai mic de aproximativ 15 ml, la finalul timpului de digestie, azotul poate sa fi fost pierdut din cauza încãlzirii excesive. Dacã se incalzeste cu gaz, balonul se incalzeste pe un suport din material termoizolant, prevãzut cu o deschidere circulara cu un diametru ce permite ca flacara libera sa atinga doar partea balonului care este mai jos de suprafata conţinutului de lichid (5.5).
(iii) dacã unele particule negre intra pe gatul balonului şi nu sunt spalate sa între în balon de acidul care circula în timpul stadiului iniţial al perioadei de fierbere puternica (aceasta poate fi facilitata de rotirea balonului), se permite ca balonul sa se raceasca suficient şi se spala, cu grija, cu o cantitate minima de apa. Se continua digestia dupã aceea, asa cum este descris mai sus.
c) Atunci când baloanele Kjeldahl sunt racite, se adauga în fiecare dintre acestea 300 ml de apa (conform notei), astfel încât sa se spele cu grija gatul balonului şi se amesteca complet conţinutul, asigurându-se ca de fapt cristalele ce s-au separat sunt dizolvate. Se adauga câteva reglatoare de fierbere (5.b), pentru a se asigura o fierbere uniforma. Se adauga apoi, în fiecare balon 70 ml de soluţie de hidroxid de sodiu (4.d) (conform notei), turnandu-se incet soluţia pe gatul înclinat al balonului, pentru a se forma un strat pe fundul balonului. Nu trebuie sa se umezeasca capatul gatului cu soluţie de hidroxid de sodiu.
Nota: Este necesar ca volumul compus din apa şi soluţia de hidroxid de sodiu, în total 370 ml, sa facã posibila colectarea a aproximativ 150 ml de distilat, chiar înainte de a urma fierberea neregulata ("clocotirea"). Astfel, dacã se adauga un volum echivalent mai mare de soluţie de hidroxid de sodiu ce este de o concentraţie mai scãzutã de 47% (m/m), volumul de apa adãugatã trebuie sa fie, în consecinta, redus. De exemplu, dacã urmeazã sa fie adaugati 85 ml de soluţie de hidroxid de sodiu cu concentraţie 40% (m/m) sau 125 ml de concentraţie 30% (m/m), volumul de apa adãugat trebuie sa fie 285 ml sau respectiv 245 ml.
d) Fiecare balon Kjeldahl se conecteaza imediat la un aparat de distilare (5.f). Se asigura ca varful tubului de evacuare a condensatorului sa fie scufundat în 50 ml soluţie de acid boric (4.e) împreunã cu 0,20 ml (5-6 picaturi) de soluţie de indicator (4.f), toate acestea fiind conţinute de un balon conic (5.h). Se roteste conţinutul fiecãrui balon pentru a se amesteca bine şi se fierbe, iniţial incet, pentru a se preveni spumarea excesiva. Atunci când s-a colectat 100-125 ml de distilat, fiecare balon conic trebuie sa fie coborat pana ce varful tubului de evacuare a condensatorului este la aproximativ 40 mm deasupra semnului de 200 ml. Se continua fiecare distilare pana ce începe fierberea puternica ("clocotirea"), apoi se înceteazã brusc încãlzirea. Se deconecteaza fiecare balon Kjeldahl şi se spala varful fiecãrui tub de evacuare a condensatorului cu putina apa, colectand apa de spalare în baloanele conice. Se noteaza urmãtoarele cerinţe:
(i) rata de distilare trebuie sa fie astfel încât sa se colecteze aproximativ 150 ml de distilat, pana la începerea clocotirii, încât volumul conţinutului fiecãrui balon conic va fi aproximativ de 200 ml.
(ii) eficienta fiecãrui condensator trebuie sa fie astfel încât temperatura conţinutului fiecãrui balon conic sa nu depãşeascã 25°C pe toatã durata distilarii.
e) Se titreaza fiecare distilat cu soluţie volumetrica standard (4.g) pana ce pH-ul ajunge la 4,6 ± 0,1, folosindu-se un pH-metru şi dacã este necesar, o eprubeta gradata. Adãugarea unui indicator ajuta la faptul de a verifica dacã titrarea se efectueazã corect. Se ia fiecare eprubeta gradata şi se citeşte cu o precizie de 0,1 ml, cu ajutorul unei lupe (5.j) evitand erorile de paralaxa.
Titrarea poate fi efectuatã numai cu indicator. Se titreaza pana ce culoarea distilatului corespunde cu cea a soluţiei preparate recent, într-un balon conic (5.g) din 150 ml de apa la care s-a adãugat 50 ml de soluţie de acid boric şi 0,20 ml de indicator.
f) Se efectueazã un test blank, conform pct. 6.a. şi 6.b. inclusiv, utilizându-se 5 ml de apa distilata împreunã cu cca. 0,1 g zaharoza (4.h), prin procedura înlocuirii probei de lapte.
Nota: Titrarea distilatului blank va necesita numai un volum foarte mic de soluţie volumetrica standard (4.g).
g) Se verifica, în mod regulat, acuratetea procedurii, prin folosirea a doua încercãri de recuperare, urmandu-se procedura conform pct. 6.a. şi 6.b.
(i) Se verifica dacã nu a avut loc vreo pierdere de azot, ca rezultat al caldurii excesive sau a scurgerilor mecanice din timpul distilarii, prin folosirea unei probe de testat de 0,15 g de oxalat sau sulfat de amoniu (4.i) cantarita cu o precizie de 0,001 g, împreunã cu 0,1 g de zaharoza (4.h).
Procentul de azot recuperat trebuie sa fie între 99,0 şi 100,0%.
Rezultate mai scãzute sau mai ridicate vor indica greşeli de procedura şi/sau o concentraţie neprecisa a soluţiei standard (4.g).
(ii) Se verifica faptul ca procedura de digestie este suficienta pentru a elibera tot azotul proteic, prin folosirea unei probe de testat de 0,20 g de triptofan pur, 0,35 g de fenacetina sau 0,20 g de hidroclorid de lizina (4.j.). Toate cantaririle trebuie sa se facã cu o precizie de 0,001 g. Trebuie sa fie recuperat cel puţin 98-99% de azot.
7. Mãsuri de protecţie
a) Atunci când se lucreazã cu acid sulfuric şi hidroxid de sodiu concentrat şi atunci când se manipuleaza baloane Kjeldahl, se poarta întotdeauna îmbrãcãminte de laborator, ochelari de protecţie şi manusi rezistente la acizi.
b) În timpul distilarii niciodatã nu se lasa baloanele Kjeldahl nesupravegheate. Din cauza posibilitatii de pericol, se opreşte distilarea imediat ce conţinutul baloanelor "clocoteste" prea puternic. Dacã fierberea persista mai mult de doua-trei minute, se coboarã balonul de colectare astfel încât varful de distilare sa fie scos din lichid.
8. Exprimarea rezultatelor
a) Calcul şi formula
Se calculeazã conţinutul de azot (W(N)), exprimat în grame de azot pe 100 g de produs, prin:
1,40 [V-V(5)] c
W(N) = ─────────────
m
W(N) = conţinutul de azot
V = volumul, în mililitri, al soluţiei volumetrice standard de acid folositã la determinare.
V(5) = volumul, în mililitri, al soluţiei volumetrice standard de acid folositã la testul blank.
c = concentratia, exprimatã în moli/litri, al soluţiei volumetrice standard de acid (4.g).
m = masa, în grame, a probei de testat.
Rezultatul se rotunjeste cu o precizie de 0,001 g/100 g.
b) Precizie
1. Repetabilitate (r): 0,007 g/100 g
2. Reproductibilitate (R): 0,015 g/100 g
9. Proceduri modificate
a) Se foloseşte un aparat de digestie în bloc, prevãzut cu baloane cilindrice în locul aparatului de digestie şi a baloanelor Kjeldahl descrise la pct. 5.e. şi 5.a. În acest caz, pentru a se identifica potentialele probleme, fiecare loc trebuie sa fie verificat individual (6.g).
b) Se foloseşte distilarea cu vapori în locul baloanelor incalzite direct (6.d). Atunci când aparatul nu permite folosirea apei distilate, trebuie sa se aibã grija ca apa sa nu conţinã substanţe volatile acide sau alcaline.
c) Poate fi folositã, în loc de 5 g, (6.a) o proba de testat de 1 g de lapte (semi-macro Kjeldahl), cu condiţia ca:
1. în fapt, cantitatea de reactivi folosiţi pentru digestie (6.a): H(2)SO(4), CuSO(4) x 5H(2)O, K(2)SO(4) sa fie redusã în aceeaşi proporţie (1/5)
2. timpul total de digestie (6.b) sa se reducã la 75 minute
3. cantitatea de soluţie de hidroxid de sodiu (6.3) sa se reducã în aceeaşi proporţie (1/5).
4. trebuie sa fie folositã o soluţie standard acid (4.g) de o concentraţie mai scãzutã (0,02 la 0,03 moli/l)
Nota: Folosirea uneia sau a mai multora dintre aceste optiuni este acceptabilã numai în cazul în care valoarea repetabilitatii (8.b.1) şi rezultatele celor doua teste de acuratete (6.g) sunt în concordanta cu cerinţele acestei metode.
CAP. 5
Determinarea conţinutului de proteine
1. Scopul şi domeniul de aplicare
Aceasta procedura precizeazã metoda de referinta pentru determinarea conţinutului de proteine din lapte tratat termic.
2. Definitie
Conţinutul de proteine reprezintã valoarea obţinutã prin multiplicarea conţinutului de azot total, exprimat în procente de masa, determinat conform metodei descrise la cap. IV pct. 3, cu un factor corespunzãtor.
3. Calcul
Conţinutul de proteine al laptelui exprimat ca procent de masa reprezintã conţinutul total de azot al laptelui multiplicat cu factorul 6,38.
CAP. 6
Determinarea masei specifice
1. Scop şi domeniu de aplicare
Aceasta procedura precizeazã metoda de referinta pentru determinarea masei specifice a laptelui crud şi integral, a laptelui ecremat parţial şi a laptelui ecremat, la 20°C.
2. Definire
Masa specifica a laptelui reprezintã valoarea raportul între masa unui anumit volum de lapte la 20°C fata de masa aceluiaşi volum de apa la 20°C.
3. Principiu
Masa specifica la 20°C este determinata printr-un hidrometru.
4. Aparatura şi sticlarie
Echipament de laborator uzual şi în special.
a) Areometru (hidrometru)
Un areometru de masa specifica este un instrument ce consta într-un flotor de sticla ce este larg şi greu la capatul inferior al acestuia. Exista o bagheta de sticla de forma cilindrica, atasat de partea superioarã şi de flotor şi este orientata coaxial cãtre acesta. Partea superioarã a baghetei este închisã.
Flotorul de sticla conţine incarcatura (plumb, mercur, etc.), destinatã sa ajusteze masa areometrului. Bagheta include o scala gradata de la 1,025 la 1,035 g/ml.
Areometrul trebuie sa fie verificat printr-o metoda picnometrica, folosindu-se un picnometru de o capacitate de aproximativ 100 ml, prevãzut cu un termometru de precizie.
b) Cilindri de sticla sau oţel inoxidabil.
Dimensiunile minime trebuie sa fie:
(i) diametrul intern aproximativ 35 mm
(ii) înãlţime interna aproximativ 225 mm
c) Baie de apa, reglata la 20°C ± 0,1°C
d) Baie de apa, reglata la 40°C ± 2°C
e) Termometru, gradat la 0,5°C
5. Procedura
a) Se amesteca proba prin rasturnare pentru a dispersa grasimea şi pentru a se pune în baia de apa (4.d). Se lasa proba sa atinga o temperatura de 40°C şi se menţine la temperatura aceasta timp de cinci minute. Se amesteca proba prin rasturnare cu grija pentru a se asigura ca grasimea este distribuita în mod omogen. Se raceste la 20°C în cea de-a doua baie de apa (4.c).
b) Se amesteca proba prin rasturnare cu grija pentru a se evita includerea de aer. Se toarna laptele în cilindru (4.b), se tine înclinat astfel încât sa se evite formarea spumei sau a bulelor. Se foloseşte o proba de lapte suficienta pentru a se asigura ca o parte din aceasta se revarsa din cilindru în momentul în care se introduce areometrul. Se scufunda cu grija areometrul în lapte şi se lasa sa pluteasca liber pana ce ajunge la poziţia de echilibru. Cilindrul urmeazã a fi plasat vertical. Areometrul trebuie sa fie pozitionat în mijlocul coloanei de lichid şi nu trebuie sa atinga pereţii cilindrului.
c) Atunci când areometrul ajunge în echilibru, se citeşte gradatia de la varful meniscului.
d) Imediat dupã citirea areometrului se introduce termometrul (4.e) în proba şi se citeşte temperatura cu o precizie de 0,5°C. Temperatura nu trebuie sa varieze mai mult de ± 2°C de 20°C.
6. Corectarea temperaturii
Dacã temperatura probei de lapte nu este exact de 20°C, atunci când s-a efectuat mãsurarea masei specifice a acesteia, rezultatul obţinut trebuie sa fie corectat adaugand masei specifice determinate pentru fiecare grad Celsius peste 20°C sau scãzând pentru fiecare grad sub 20°C valoarea 0,0002. Aceasta corectare este valabilã numai dacã temperatura laptelui diferã cu cel mult 5°C de valoarea de 20°C.
7. Exprimarea rezultatelor
Metoda de calcul şi formula masei specifice a probei sunt exprimate în g/ml pentru laptele ecremat la 20°C, conform urmãtoarei formule:
1000 x mv - MG x mv 0,92 mv (1000 - MG)
─────────────────── = ───────────────────
MG x mv 920 - MG x mv
1000 - ───────
0,92
unde:
mv = masa specifica a probei cititã pe areometru (5.d) în g/l
MG = conţinutul de grasime al probei, în g/l
0,92 = densitatea grasimii
8. Precizie
a) Repetabilitate (r): 0,0003 g/ml.
b) Reproductibilitate (R): 0,0015 g/ml.
"APENDIX"
la Anexa nr. 2
Proceduri alternative ce folosesc tuburi de extracţie a grasimii cu sifon sau dispozitive de spalare
Procedura
1. Prepararea probei de testat - conform pct. 6 lit. a) din cap. II al anexei nr. 2
2. Proba de testat
Se procedeazã dupã cum este specificat la punctul 6.b. dar folosindu-se tuburi de extracţie a grasimii (conform pct. 5 lit. f) din cap. II al anexei nr. 2).
Proba de testat trebuie sa fie transferata cat mai complet posibil la fundul tuburilor de extracţie.
3. Testul blank - conform pct. 6 lit. c) din cap. II al anexei nr. 2.
4. Pregãtirea recipientului de colectare a grasimii - conform pct. 6 lit. d din cap. II al anexei nr. 2.
5. Determinarea
a) Se adauga 2 ml de soluţie de amoniac (pct. 4 lit. a) din cap. II al anexei nr. 2) sau un volum echivalent a unei soluţii de amoniac mai concentrata şi se amesteca cu proba de testat tratata în prealabil, în profunzime pe fundul tubului. Dupã adãugarea amoniacului, se efectueazã determinarea fãrã întârziere.
b) Se adauga 10 ml de etanol (pct. 4 lit. b) din cap. II al anexei nr. 2) şi se amesteca cu grija dar complet pe fundul tubului. Dacã este de dorit, se adauga doua picaturi de soluţie de roşu de Congo sau roşu crezol (pct. 4 lit. c) din cap. II al anexei nr. 2).
c) Se adauga 25 ml de dietil eter (pct. 4 lit. d) din cap II al anexei nr. 2), se închide tubul cu un dop de pluta imbibat cu apa sau cu un dop umezit cu apa (pct. 5 lit. f) din cap. II al anexei nr. 2) şi se agita tubul viguros dar nu excesiv, pentru a se evita formarea unei emulsii persistente, prin rasturnari repetate, timp de un minut. Dacã este necesar, se lasa tubul sa se raceasca la jet de apa, apoi se indeparteaza cu grija dopul de pluta şi se spala împreunã cu gatul tubului, cu o cantitate mica de solvent amestec (pct. 4 lit. f) din cap. II al anexei nr. 2) folosindu-se flaconul de spalare (pct. 5 lit. h) din cap. II al anexei nr. 2), astfel încât lichidul de spalare sa curgã înapoi în tub.
d) Se adauga 25 ml de eter petrol (pct. 4 lit. e) din cap. II al anexei nr. 2), se închide tubul cu dopul de pluta reumezit prin scufundare în apa şi se agita uşor timp de 30 de secunde asa cum este descris la pct. c.
e) Se centrifugheaza tubul închis, timp de 1-5 minute, la o frecventa de rotaţie de 500-600 de turatii/minut (pct. 5 lit. b) din cap. II al anexei nr. 2). Dacã nu este disponibilã centrifuga (conform pct. 5 lit. b) din cap. II al anexei nr. 2), se lasa tubul închis pe stativ (pct. 5 lit. g) din cap. II al anexei nr. 2) pentru cel puţin 30 de minute pana ce stratul supernatant se limpezeste şi se separa în mod distinctiv de stratul apos. Dacã este necesar, tubul se raceste la jet de apa.
f) Se indeparteaza cu grija dopul de pluta şi se spala împreunã cu gatul tubului, cu o cantitate mica de solvent amestec, astfel încât lichidul de spalare sa curgã înapoi în tub.
g) Se insera un sifon corespunzãtor sau un flacon de spalare ce trebuie sa între într-un tub şi se impinge în jos marginea interioarã mai lungã a instalaţiei pana ce tubul de intrare este la aproximativ 3 mm deasupra interfetei dintre straturi. Marginea interioarã a instalaţiei trebuie sa fie paralela cu axa tubului de extracţie.
Se transfera cu grija stratul supernatant al tubului într-un recipient de colectare a grasimii (pct. 6 lit. d) din cap. II al anexei nr. 2) ce conţine câteva reglatoare de fierbere (pct. 5 lit. j) din cap. II al anexei nr. 2) în cazul fiolelor (optional la capsulele de metal), evitandu-se transferul vreunuia dintre straturile apoase. Se spala tubul de evacuare al instalaţiei cu o cantitate mica de solvent amestec, colectandu-se lichidul de spalare în recipientul de colectare a grasimii.
h) Se desface dispozitivul de la gatul tubului, se ridica uşor instalatia şi se ridica partea inferioarã a marginii interioare mai lungi a acesteia, şi se spala cu o cantitate mica de solvent amestec. Se coboarã şi se reinsera instalatia şi se transfera lichidul de spalare în recipientul de colectare a grasimii. Se spala tubul de evacuare a instalaţiei cu o cantitate mica de solvent amestec, colectandu-se lichidul de spalare în recipient. Dacã este de dorit, solventul, sau o parte din solvent poate fi îndepãrtat din recipient prin distilare sau evaporare, asa cum este descris la pct. 6 lit. e) pct. 12 din cap. II al anexei nr. 2.
i) Se coboarã din nou instalatia de la nivelul gatului, se ridica uşor şi se adauga la conţinutului tubului 5 ml de etanol, folosindu-se etanol pentru ridicarea marginii interioare mai lungi a instalaţiei. Se amesteca dupã cum este descris la pct. 5 lit. b).
j) Se efectueazã o a doua extracţie prin repetarea operaţiunilor descrise la pct. 5 lit. c) - pct. 5 lit. h), dar folosindu-se numai 15 ml de dietil eter (pct. 4 lit. d) din cap. II al anexei nr. 2) şi 15 ml de eter petrol (pct. 4 lit. e) din cap. II al anexei nr. 2). Eterul se foloseşte pentru a se spala marginea interioarã mai lungã a instalaţiei, în timpul indepartarii instalaţiei din tub dupã extractia precedenta.
k) Se efectueazã o a treia extracţie, prin repetarea operaţiunilor descrise la lit. c) - lit. h), folosindu-se 15 ml de dietil eter şi 15 ml de eter petrol şi se spala marginea interioarã mai lungã a instalaţiei, dupã cum este descris la lit. j).
În cazul laptelui ecremat, a treia extracţie poate fi omisa.
l) Se procedeazã asa cum este descris la pct. 6 lit. e) pct. 12 - pct. 6 lit. e) pct. 16 din cap. II al anexei nr. 2.
