Comunica experienta
MonitorulJuridic.ro
Ţinând seama de prevederile Directivei Comisiei Europene 98/57 din 20 iulie 1998 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., în baza prevederilor Hotărârii Guvernului nr. 1.030/2001 pentru aprobarea Normelor metodologice de aplicare a Ordonanţei Guvernului nr. 136/2000 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantina dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România, în temeiul Hotărârii Guvernului nr. 362/2002 privind organizarea şi funcţionarea Ministerului Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor, cu modificările şi completările ulterioare, ministrul agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor emite următorul ordin: ART. 1 (1) Prezentul ordin se referă la măsurile care urmează să fie luate împotriva bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., cunoscută anterior sub denumirea de Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, denumita în continuare organism, cu privire la plantele-gazda ale organismului, prevăzute în anexa nr. I secţiunea I, denumite în continuare material de plantare, în scopul: a) localizării şi determinării distribuţiei; b) prevenirii apariţiei şi răspândirii; c) împiedicării răspândirii şi controlului în vederea eradicării, dacă a fost semnalată. (2) Direcţiile fitosanitare judeţene şi a municipiului Bucureşti vor fi denumite în continuare direcţii fitosanitare. (3) Atribuţiile Ministerului Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor, prevăzute în prezentul ordin, vor fi exercitate prin Direcţia fitosanitara din cadrul ministerului. ART. 2 (1) Direcţiile fitosanitare efectuează inspecţii sistematice anuale asupra materialului de plantare originar din raza lor de activitate. (2) În scopul identificării altor posibile surse de contaminare care ameninţa producţia materialului de plantare, direcţiile fitosanitare efectuează o evaluare a riscului şi, cu excepţia cazului în care în timpul evaluării nu se identifica un risc de răspândire a organismului, desfăşoară inspecţii în zonele de producţie a materialului de plantare pentru detectarea organismului asupra altor plante, altele decât materialul de plantare prevăzut la art. 1, inclusiv asupra plantelor-gazda solanacee sălbatice, precum şi asupra apei de suprafaţa, asupra deşeurilor lichide provenite din procesările industriale sau din locurile de ambalare a materialului de plantare, utilizate pentru irigarea sau stropirea materialului de plantare. (3) Direcţiile fitosanitare pot, de asemenea, să desfăşoare inspecţii pentru detectarea organismului pe materiale, cum ar fi medii de cultura, sol şi deşeuri solide rezultate din procesările industriale sau locurile de ambalare. ART. 3 (1) Inspecţiile prevăzute la art. 2 sunt efectuate: a) asupra materialului de plantare, în conformitate cu prevederile anexei nr. I secţiunea II pct. 1; b) asupra plantelor-gazda, altele decât materialul de plantare prevăzut la art. 1, şi asupra apei, inclusiv asupra deşeurilor lichide, şi, dacă este cazul, sunt prelevate probe şi sunt supuse testelor de laborator, în conformitate cu metodele corespunzătoare, la Laboratorul Central pentru Carantina Fitosanitara sau alte laboratoare aprobate de Ministerul Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor; c) după caz, asupra altor materiale, în conformitate cu metodele corespunzătoare. (2) Detaliile suplimentare cu privire la procedurile de inspecţie prevăzute la alin. (1), numărul, originea, stratificarea şi momentul prelevării probelor sunt elaborate de Laboratorul Central pentru Carantina Fitosantiara şi aprobate de Ministerul Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor, în baza principiilor ştiinţifice, statistice şi a biologiei organismului, luând în considerare sistemul particular de producţie a materialului de plantare şi, după caz, al altor plante-gazda ale organismului. ART. 4 (1) Direcţiile fitosanitare transmit Laboratorului Central pentru Carantina Fitosanitara, anual, până la data de 1 martie, rezultatele inspecţiilor prevăzute la art. 2, în conformitate cu prevederile anexei nr. I secţiunea II pct. 2. (2) Laboratorul Central pentru Carantina Fitosanitara transmite datele centralizate Ministerului Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor până la data de 15 mai. (3) Informarea prevăzută la alin. (2) este prezentată Comisiei Europene până la data de 1 iunie, cu excepţia datelor privind cartofii utilizaţi de persoanele fizice, precum şi cartofii de sămânţă pentru uz propriu, pentru care informarea este prezentată până la 1 septembrie. (4) Datele prevăzute în prezentul articol se referă la producţia anului precedent. ART. 5 Suspectarea apariţiei sau prezenta confirmată a organismului pe teritoriul României este comunicată Ministerului Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor. ART. 6 (1) În cazul suspectării apariţiei organismului, Laboratorul Central pentru Carantina Fitosanitară sau alte laboratoare aprobate de Ministerul Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor efectuează teste de laborator, utilizând pentru materialul de plantare metoda corespunzătoare, conform anexei nr. II şi în conformitate cu condiţiile prevăzute în anexa nr. III pct. 1, în scopul confirmării sau infirmării apariţiei suspecte a organismului. (2) În cazul confirmării prezentei organismului, se aplica prevederile anexei nr. III pct. 2. ART. 7 (1) Până la confirmarea sau infirmarea apariţiei organismului în conformitate cu art. 6, Ministerul Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor, prin direcţiile fitosanitare: a) interzice circulaţia plantelor şi tuberculilor din toate culturile, loturile sau transporturile din care s-au prelevat probe, cu excepţia celor care se afla sub control şi cu condiţia să se fi stabilit că nu exista vreun risc identificabil de răspândire a organismului; b) aplica măsuri de depistare a originii apariţiei suspectate a organismului; c) introduce măsuri de precauţie suplimentare, altele decât cele prevăzute la lit. a), bazate pe nivelul de risc estimat, în special în legătura cu producţia materialului de plantare şi cu circulaţia loturilor de cartofi de sămânţă produşi la locul de producţie de unde s-au prelevat probele prevăzute la lit. a), în scopul prevenirii oricărei raspandiri a organismului. (2) Prevederile alin. (1) se aplica în cazul apariţiilor suspectate ale organismului în care este îndeplinită una dintre condiţiile de mai jos: a) au fost constatate simptome ale bolii cauzate de organism şi s-a obţinut un rezultat pozitiv în testul/testele de selecţie rapida prevăzute în anexa nr. II secţiunea I pct. 1 şi secţiunea II; b) s-a obţinut un rezultat pozitiv în testul/testele de selecţie prevăzute în anexa nr. II secţiunea I pct. 2 şi secţiunea III. ART. 8 (1) În cazurile de apariţie suspectată a organismului, în care exista riscul contaminării materialului de plantare sau a apei de suprafaţa dintr-o regiune în alta, direcţia fitosanitara pe raza căreia a fost suspectată apariţia, informează Laboratorul Central pentru Carantina Fitosanitara despre riscul identificat. (2) Laboratorul Central pentru Carantina Fitosanitara notifica apariţia suspectată a organismului Ministerului Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor. (3) În cazul prevăzut la alin. (1) se aplica măsuri de precauţie în conformitate cu art. 7 alin. (1) lit. c) şi orice alte măsuri, în conformitate cu art. 6 şi 7. ART. 9 (1) Dacă în urma testelor de laborator efectuate în conformitate cu metodele prevăzute în anexa nr. II la materialul de plantare se confirma prezenta organismului într-o proba prelevată în conformitate cu prezentul ordin, având în vedere principii ştiinţifice fundamentate, biologia organismului şi producţia specifica, comercializarea şi sistemele de prelucrare a plantelor-gazda ale organismului, Ministerul Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor, prin direcţiile fitosanitare, dispune măsurile prevăzute mai jos. (2) În cazul materialului de plantare prevăzut la art. 1, direcţia fitosanitara: a) deschide o investigaţie pentru determinarea extinderii şi sursei sau surselor primare de contaminare, în conformitate cu prevederile anexei nr. IV, cu testări suplimentare în conformitate cu art. 6, cel puţin asupra stocurilor de cartofi de sămânţă înrudiţi prin clonare; b) desemnează, că fiind contaminate, materialul de plantare, transportul şi/sau locul din care s-a prelevat proba şi utilajele, vehiculul, vasul, depozitul şi orice alte obiecte, inclusiv materialul de ambalare care a venit în contact cu materialul de plantare din care a fost prelevată proba; c) desemnează ca fiind contaminate, dacă este cazul, câmpul sau câmpurile, unitatea sau unităţile de producţie de culturi protejate şi locul sau locurile de producţie de unde s-a recoltat materialul de plantare şi din care a fost prelevată proba; d) pentru acele probe prelevate în perioada de vegetaţie desemnează ca fiind contaminate câmpul sau câmpurile, locurile de producţie şi, dacă este cazul, unitatea sau unităţile de producţie de culturi protejate din care a fost prelevată proba; e) determina, în conformitate cu prevederile anexei nr. V pct. 1, extinderea contaminării probabile prin contact înainte sau după recoltare, prin legături de producţie, irigare sau stropire ori printr-o înrudire clonală; f) demarchează o zona pe baza desemnării contaminării în conformitate cu prevederile lit. b), c) şi d), a determinării extinderii contaminării probabile în conformitate cu lit. e) şi a răspândirii posibile a organismului în conformitate cu prevederile anexei nr. V pct. 2 lit. i). (3) În cazul culturilor de plante-gazda, altele decât cele prevăzute la art. 1, la care producţia de material de plantare este identificată ca risc, direcţia fitosanitara: a) deschide o investigaţie în conformitate cu alin. (2) lit. a); b) desemnează ca fiind contaminate plantele-gazda ale organismului de la care a fost prelevată proba; c) determina contaminarea probabilă şi demarchează o zona în conformitate cu alin. (2) lit. e), şi respectiv, lit. f), în legătura cu producţia de material de plantare. (4) În cazul apelor de suprafaţa, inclusiv al deşeurilor lichide provenite din procesările industriale sau din locurile de ambalare a materialului de plantare, şi pentru plantele-gazda solanacee sălbatice asociate acesteia, acolo unde producţia de material de plantare este identificată ca risc prin irigaţie, stropire sau inundare cu apa de suprafaţa: a) stabileşte o investigaţie, inclusiv o inspecţie în perioade corespunzătoare, asupra probelor prelevate din apele de suprafaţa şi, dacă este cazul, asupra plantelor-gazda solanacee sălbatice, pentru stabilirea extinderii contaminării; b) desemnează ca fiind contaminată apa de suprafaţa din care a fost prelevată proba sau probele, corespunzător extinderii contaminării şi în baza investigaţiilor efectuate în conformitate cu lit. a); c) determina contaminarea probabilă şi demarchează o zona pe baza stabilirii contaminării în conformitate cu lit. b) şi a posibilei raspandiri a organismului, ţinând seama de prevederile anexei nr. V pct. 1 şi pct. 2 (ii). ART. 10 Direcţiile fitosanitare informează imediat Laboratorul Central pentru Carantina Fitosanitara, în conformitate cu prevederile anexei nr. V pct. 3, cu privire la orice contaminare stabilită conform art. 9 alin. (2) lit. b), c) şi d) şi alin. (4) lit. b) şi la detaliile zonei demarcate conform art. 9 alin. (2) lit. f) şi, dacă este cazul, conform art. 9 alin. (4) lit. c). ART. 11 Direcţiile fitosanitare transmit Laboratorului Central pentru Carantina Fitosanitara notificarea suplimentară prevăzută în anexa nr. V pct. 4. ART. 12 În urma notificării în conformitate cu art. 10 şi 11 şi a elementelor menţionate în acestea, celelalte direcţii fitosanitare vizate în notificare deschid o investigaţie în conformitate cu art. 9 alin. (2) lit. a) şi, dacă este cazul, cu art. 9 alin. (4) lit. a) şi iau măsuri suplimentare după caz, în conformitate cu art. 9, 10 şi 11. ART. 13 Materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat conform art. 9 alin. (2) lit. b), c) şi d) nu poate fi plantat şi este supus uneia dintre dispoziţiile anexei nr. VI pct. 1, astfel încât să nu existe nici un risc identificabil de răspândire a organismului. ART. 14 Materialul de plantare desemnat ca fiind probabil contaminat conform art. 9 alin. (2) lit. e) şi alin. (4) lit. c), inclusiv materialul de plantare pentru care a fost identificat un risc, produs în locuri de producţie determinate ca probabil contaminate în conformitate cu prevederile art. 9 alin. (2) lit. e), nu va fi plantat şi va fi utilizat sau eliminat în conformitate cu prevederile anexei nr. VI pct. 2, astfel încât să nu existe nici un risc identificabil de răspândire a organismului. ART. 15 (1) Orice utilaj, vehicul, vas, depozit şi orice alte obiecte, inclusiv materialul de ambalare desemnat ca fiind contaminat conform art. 9 alin. (2) lit. b), c) şi d) sau desemnat ca fiind probabil contaminat în conformitate cu prevederile art. 9 alin. (2) lit. e) şi alin. (4) lit. c), este decontaminat sau distrus, utilizându-se metodele prevăzute în anexa nr. VI pct. 3. (2) După decontaminare nici un astfel de obiect nu mai este considerat ca fiind contaminat. ART. 16 În zona demarcata conform art. 9 alin. (2) lit. f) şi alin. (4) lit. c) se introduce o serie de măsuri conform prevederilor anexei nr. VI pct. 4.1 şi 4.2, fără a se încalca măsurile stabilite la art. 13-15. ART. 17 (1) Cartofii de sămânţă trebuie să provină, în linie directa, dintr-un material obţinut în cadrul unui program aprobat oficial, găsit liber de organism în urma testelor de laborator, utilizându-se metoda corespunzătoare prevăzută în anexa nr. II, şi să îndeplinească prevederile Hotărârii Guvernului nr. 1.030/2001 pentru aprobarea Normelor metodologice de aplicare a Ordonanţei Guvernului nr. 136/2000 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantina dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România. (2) Testarea prevăzută la alin. (1) este efectuată de Laboratorul Central pentru Carantina Fitosanitara sau de alte laboratoare aprobate de Ministerul Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor. ART. 18 În cazul în care a fost confirmată prezenta organismului în producţia de cartofi de sămânţă, se testează: a) materialul timpuriu de propagare, inclusiv clonele selectate iniţial, şi clonele de baza de cartofi de sămânţă; b) toate clonele de baza de cartofi de sămânţă sau materialul timpuriu de propagare, inclusiv clonele selectate iniţial, în cazurile în care s-a stabilit ca nu exista nici o relaţie clonală; c) fiecare planta obţinută din clonele selectate iniţial sau eşantioanele reprezentative de cartofi de sămânţă de baza ori materialul timpuriu de propagare, în alte cazuri. ART. 19 Deţinerea şi manipularea organismului sunt interzise. ART. 20 Ministerul Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor poate aproba derogări de la măsurile prevăzute la art. 13-16 şi 19, pentru testări sau în scopuri ştiinţifice şi pentru lucrări pe selecţii varietale, cu respectarea prevederilor Hotărârii Guvernului nr. 1.030/2001. ART. 21 Laboratorul Central pentru Carantina Fitosanitara prelucrează toate datele primite de la direcţiile fitosanitare şi informează imediat Ministerul Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor. ART. 22 Anexele nr. I-VII fac parte integrantă din prezentul ordin. ART. 23 Prezentul ordin va fi publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, şi va intra în vigoare la data de 1 ianuarie 2004, cu excepţia art. 4 alin. (3) care va intra în vigoare la data de 1 ianuarie 2007. Ministrul agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor, Ilie Sârbu Bucureşti, 19 decembrie 2002. Nr. 632. ANEXA I SECŢIUNEA I Lista plantelor - gazda ale bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. prevăzute la art. 1 Plante (inclusiv tuberculi), altele decât seminţele propriu-zise de Solanum tuberosum L. (cartof). Plante, altele decât fructele şi seminţele de Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw. (tomate). SECŢIUNEA II Inspecţii 1. Inspecţiile prevăzute la art. 3 alin. (1) lit. a) din ordin, se bazează pe biologia organismului şi pe sistemele de producţie proprii: (i) în cazul cartofului: - în perioade corespunzătoare, inspecţia vizuala a culturii şi/sau prelevarea de probe atât de cartofi de samânta, cât şi de alte tipuri de cartofi în perioada de vegetaţie sau în perioada de depozitare. Aceste probe sunt supuse unei inspecţii vizuale prin sectionarea tuberculilor; şi - în cazul cartofilor de samânta şi, dacă este cazul, pentru alte tipuri de cartofi se efectuează teste de laborator oficiale sau avizate oficial, utilizându-se metoda stabilită în anexa nr. II; (ii) în cazul tomatelor: - inspecţie vizuala, în perioade corespunzătoare, cel puţin în perioada de vegetaţie a plantelor destinate replantarii în scop profesional. 2. Notificarea inspecţiilor prevăzute la art. 4 include: (i) în cazul inspecţiilor asupra cartofilor: - suprafaţa totală estimată cultivată, în hectare, a cartofilor de samânta şi a altor tipuri de cartofi; - stratificarea după categorie a cartofilor de samânta şi de consum şi, după caz, pe regiune; - numărul şi perioada de prelevare a probelor pentru testare; - numărul inspecţiilor vizuale din câmp; - numărul de inspecţii vizuale asupra tuberculilor şi dimensiunea probei; (ii) în cazul inspecţiilor la plantele de tomate destinate replantarii în scop profesional, în perioada de vegetaţie: - numărul total estimat de plante; - numărul inspecţiilor vizuale; (iii) în cazul inspecţiilor asupra plantelor gazda, altele decât cartofi şi tomate, inclusiv plante-gazda solanacee sălbatice: - speciile; - numărul şi perioada prelevării probelor; - zona/râul de unde au fost prelevate probele, acolo unde este cazul; - metoda de analiza; (iv) în cazul inspecţiilor asupra apei şi deşeurilor lichide deversate din procesarea industriala sau din locurile de ambalare: - numărul şi perioada prelevării probelor, - zona/râul/locul de prelevare a probelor, acolo unde este cazul, - metoda de analiza. ANEXA II PROTOCOL DE TESTARE PENTRU DIAGNOZA, DETECŢIA ŞI IDENTIFICAREA BACTERIEI RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. SCOPUL PROTOCOLULUI DE TESTARE Protocolul prezentat descrie diversele proceduri implicate în: (i) diagnosticarea putregaiului brun al tuberculilor de cartof şi a vestejirii bacteriene la plantele de cartof şi tomate; (ii) detectarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probele de tuberculi de cartof; (iii) identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum. În apendice se oferă detalii cu privire la prepararea materialelor de testare, de exemplu medii de cultura, tampoanele, soluţiile, reactivii. SCHEMA DE TESTARE: SECŢIUNEA I: Aplicarea protocolului de testare 1. Diagnosticarea putregaiului brun al tuberculilor de cartof şi a vestejirii bacteriene la cartof şi tomate 2. Detectarea şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probele de tuberculi de cartof SECŢIUNEA II: Diagnoza putregaiului brun al tuberculilor de cartof şi a vestejirii bacteriene la cartof şi tomate 1. Simptome 2. Test(e) de selecţie rapida 3. Metoda de izolare 4. Test(e) de confirmare SECŢIUNEA III: Detectarea şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probele de tuberculi de cartof 1. Pregătirea probelor pentru testare 2. Test de imunofluorescenta (IF) 3. Test de imunoadsorbtie cu anticorpi marcaţi enzimatic (ELISA) 4. Testul de amplificare a catenelor de ADN (PCR^(TM)) 5. Testul de însămânţare pe medii 6. Testul biologic 7. Teste de îmbogăţire 8. Testul de patogenitate Apendice 1 Medii nutritive pentru izolarea şi cultivarea bacteriei Ralstonia solanacearum Apendice 2 Materiale pentru pregătirea probei Apendice 3 Materiale pentru testul IF Apendice 4 Determinarea nivelului de contaminare în testul IF Apendice 5 Materiale pentru testul ELISA Apendice 6 Materiale pentru testul PCR Apendice 7 Materiale pentru testul(ele) de însămânţare pe medii selective şi de îmbogăţire Bibliografie recomandată pentru modul de efectuare a testelor prevăzute în prezenta anexa SECŢIUNEA I APLICAREA PROTOCOLULUI DE TESTARE 1. Diagnoza putregaiului brun al tuberculilor de cartof şi a vestejirii bacteriene la plantele de cartof şi tomate Protocolul de testare este destinat tuberculilor de cartof cu simptome tipice sau tuberculilor suspecţi de putregai brun şi, în cazul plantelor de cartof şi tomate protocolul de testare este destinat plantelor cu simptome tipice sau plantelor suspecte de vestejire bacteriană. El presupune un test rapid de selecţie, izolarea agentului patogen din ţesutul vascular infectat pe medii de diagnostic şi, în cazul unui rezultat pozitiv, identificarea culturii de Ralstonia solanacearum.
Prezentarea diagramei
┌───────────────────────────────────────────────────────────────────┐
│Plante de cartof sau tomate sau tuberculii de cartof cu simptome*1)│
└─────────────────────────────────┬─────────────────────────────────┘
v
┌─────────────────────────────┐
│Testele de selecţie rapida*2)│
└──────────────┬──────────────┘
v
┌───────┐
│Izolare│
└───┬───┘
v
┌──────────────────────────────────────────────┐
│ Colonii cu morfologie tipica │
└──┬───────────────────────────────────────┬───┘
v v
┌─────┐ ┌─────┐
│ DA │ │NU*3)│
└──┬──┘ └──┬──┘
v │
┌──────────────────────────────────┐ │
│ TEST DE CONFIRMARE │ │
│Identificarea*4) unei culturi pure│ │
│ ca fiind o cultura de │ │
│ Ralstonia solanacearum │ │
│ plus testul patogenitatii*4) │ │
└──┬────────────────────────────┬──┘ │
v v v
┌────┐ ┌────┐ ┌────────────────────────┐
│ DA │ │ NU ├─────────>│Plante şi/sau tuberculii│
└──┬─┘ └────┘ │neinfectati cu Ralstonia│
│ │solanacearum │
v └────────────────────────┘
┌──────────────────────────────────┐
│Plante şi/sau tuberculii infectaţi│
│cu Ralstonia solanacearum │
└──────────────────────────────────┘
------------- Referinţe la diagrama: *1) Descrierea simptomelor este oferită în secţiunea II pct. 1. *2) Testele rapide de selecţie facilitează diagnosticul prezumtiv. Testele corespunzătoare sunt: - testul de eliminare a exudatului din ţesutul vascular al tulpinii (secţiunea II pct. 2), - testul pentru granulele de poli-beta-hidroxibutirat (secţiunea II.2), - testul IF (secţiunea III pct. 2), - testul ELISA (secţiunea III pct. 3), - testul PCR (secţiunea III pct. 4). *3) Cu toate ca izolarea agentului patogen din materialul vegetal cu simptome tipice prin însamântarea pe medii este avantajoasă, ea poate esua datorită stadiului avansat de infecţie. Bacteriile saprofite care cresc în tesuturile bolnave pot domina agentul patogen sau îl pot inhiba pe mediul de izolare. Dacă testul de izolare este negativ, dar simptomele bolii sunt tipice, atunci izolarea trebuie repetată, de preferinţa printr-un test de însămânţare pe plăci selective. *4) Identificarea unei culturi pure de Ralstonia solanacearum este obţinută prin cel puţin unul dintre testele enumerate în secţiunea II pct. 4.1, în combinaţie cu un test de patogenitate (secţiunea II pct. 4.3). Caracterizarea tulpinilor este opţională, dar este recomandată pentru fiecare situaţie noua. 2. Detectarea şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probele de tuberculi de cartof Protocolul este destinat detectării infecţiilor latente în tuberculii de cartof printr-unul sau, de preferinţa, mai multe teste de selecţie care, dacă sunt pozitive, sunt suplimentate prin izolarea agentului patogen; urmat de identificarea unei culturi pure de Ralstonia solanacearum, în cazul izolării unor colonii tipice.
Prezentarea diagramei
┌───────────────────────────────┐
│proba cu tuberculi de cartof*1)│
└───────────────┬───────────────┘
v
┌────────────────────────────────────────────┐
│ TEST(E) DE SELECŢIE*2) │
│ │ │
│ v │
│testul IF*3) şi/sau pe plăci selective*4) cu│
│ completarea testelor facultative: │
│ testul ELISA*5) │
│ testul PCR*6) │
│ test(e) de îmbogăţire*7) │
└┬────────────────────┬──────────────────────┘
v v
┌───────────────┐ ┌─────────────┐ ┌─────────────────┐
│ cel puţin │ │toate testele│ │proba neinfectata│
│un test pozitiv│ │ negative ├───>│ cu Ralstonia │
│ │ │ │ │ solanacearum │
└───────┬───────┘ └─────────────┘ └─────────────────┘
v
┌───────────────────────────────────────┐
│ TEST(E) DE IZOLARE │
│ însămânţare şi/sau testul │
│pe plăci selective biologic*8)│
└─────────────────┬─────────────────────┘
v
┌────────────────────────────┐
│Colonii cu morfologie tipica│
└─┬───────────────────────┬──┘
v v
┌────┐ ┌────┐ ┌─────────────────────────┐
│ DA │ │ NU ├─────────>│ proba neinfectata │
└─┬──┘ └────┘ │cu Ralstonia solanacearum│
v └─────────────────────────┘
┌───────────────────────────────────────────┐
│ TESTE DE CONFIRMARE │
│identificarea*9) în cultura a lui Ralstonia│
│ solanacearum plus testul patogenitatii*9) │
└──────┬───────────────────────┬────────────┘
v v
┌────┐ ┌────┐ ┌──────────────────────┐
│ DA │ │ NU ├─────────>│ proba neinfectata cu │
└─┬──┘ └────┘ │Ralstonia solanacearum│
v └──────────────────────┘
┌─────────────────────────────────────────┐
│proba infectata cu Ralstonia solanacearum│
└─────────────────────────────────────────┘
------------ Referinţe la diagrama *1) Dimensiunea probei Dimensiunea standard este de 200 de tuberculi. Cu toate acestea, protocolul poate fi aplicat şi probelor cu mai puţin de 200 de tuberculi. *2) Test(e) de selecţie Un singur test poate să nu fie suficient de sensibil sau de sigur pentru detectarea bacteriei Ralstonia solanacearum dintr-o proba. Din acest motiv se recomanda mai mult de un test, iar aceste teste ar fi de preferat să se bazeze pe diferite principii biologice. *3) Test de imunofluorescenta (IF) Testul de IF este un test bun de selecţie. Acesta reprezintă un avantaj fata de alte teste care nu sunt înca complet dezvoltate sau validate. Testul este folosit pentru multe alte bacterii reglementate, de exemplu, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Datorită parametrilor de citire specificaţi în aceasta metoda, este un test sensibil (pragul de sensibilitate de 10^3-10^4 celule/ml de extract de cartof). Factorul critic pentru siguranţa rezultatelor acestui test este calitatea antiserului. Doar un antiser cu un titru superior (minimum 2000 pentru antiserul brut) este acceptabil şi toate testele trebuie efectuate la titrul antiserului sau o diluţie sub titru. Este preferata metoda indirecta. Metoda directa se poate aplica dacă testul are un nivel de sensibilitate şi specificitate echivalent cu cel al metodei indirecte. Testul IF are avantajul interpretării subiective a morfologiei celulelor colorate şi intensităţii fluorescentei, care oferă informaţii asupra specificităţii reacţiei. Sunt comune reacţiile încrucişate cu bacterii înrudite serologic, din sol sau asociate cu tesuturile de cartof, cu morfologia celulara asemănătoare cu cea a bacteriei Ralstonia solanacearum. Testul IF poate fi utilizat ca test unic de selecţie, deşi în cazurile în care sunt suspectate reacţii încrucişate ar trebui făcut un test de selecţie suplimentar bazat pe diferite principii biologice. În asemenea cazuri cel mai recomandat test este însamântarea pe medii selective. *4) Însamântarea pe medii selective Împreuna cu mediul SMSA modificat şi cu metodologia de testare specificată în aceasta metoda, acesta este un test sensibil şi selectiv pentru Ralstonia solanacearum. Rezultatul este disponibil după 3-6 zile de la însamântarea probei. Agentul patogen este obţinut direct în cultura şi poate fi identificat uşor. Pentru exploatarea completa a potenţialului sau, testul cere o pregătire atenta a conurilor pentru a nu permite ca bacteriile secundare asociate cu tuberculii de cartof care sunt în competiţie cu Ralstonia solanacearum pe mediu să afecteze evidenţierea agentului patogen. Unele tulpini se pot dezvolta insuficient, deoarece componentele mediului pot afecta organismul tinta. De asemenea, se cere atenţie la diferenţierea bacteriei Ralstonia solanacearum de celelalte bacterii care se pot dezvolta pe mediu. Însamantarea pe medii selective poate fi utilizata ca test unic de selecţie, cu condiţia ca, în cazurile în care se bănuieşte inhibiţia bacteriei Ralstonia solanacearum de alte bacterii pe mediu şi se obţine un rezultat negativ al testului, proba să fie retestata, utilizându-se diferite teste pentru a confirma sau a infirma diagnosticul. În asemenea cazuri cel mai recomandat test este testul IF. *5) Testul ELISA Testul ELISA este în general mai puţin sensibil decât testul IF (prag de sensibilitate 10^4-10^5 celule/ml extract de cartof). Testul este ieftin şi rapid, dar, în general, mai vulnerabil la false rezultate pozitive (reacţii încrucişate) şi false rezultate negative (inhibarea de către moleculele fenolice din extractul de cartof). Cerinţele de specificitate a antiserului sunt extrem de mari. Testul ELISA nu poate fi folosit ca test unic de selecţie. *6) Testul PCR PCR are potenţialul unei detectari foarte sensibile, deşi testul este uşor inhibat de componente ale plantei sau ale extractului de cartof, ducând la un fals rezultat negativ. Unii cultivari de cartof conţin mai mulţi inhibitori decât alţii. De aceea este necesară îndepărtarea acestor inhibitori. Inhibiţia se poate reduce prin diluare, dar se diluează şi populaţia de Ralstonia solanacearum. Trebuie acordată multă atenţie etapelor de pregătire a probei şi testului propiu-zis, pentru a împiedica contaminarea care ar duce la false teste pozitive. False rezultate pozitive pot să apara şi datorită omologiei de secvenţe cu alte organisme. Din aceste motive testul direct PCR nu poate fi folosit ca test unic de selecţie. *7) Testul de îmbogăţire Incubarea depozitului obţinut în urma centrifugarii extractului de cartof în bulion semiselectiv, ca de exemplu, bulion SMSA modificat, permite multiplicarea bacteriei Ralstonia solanacearum. Poate mult mai important este faptul ca diluează potenţialii inhibitori ai testelor ELISA sau PCR. Astfel bacteria Ralstonia solanacearum în mediu nutritiv îmbogăţit poate fi detectata prin următoarele teste: IF, ELISA şi PCR. Nu se recomanda însamântarea directa făcuta din bulion îmbogăţit. Aceste metode de îmbogăţire nu au fost verificate şi testate complet. Ele sunt incluse aici deoarece au un potenţial bun. Cu toate acestea, datorită relativei lipse de experienţa în lucrul cu ele, nu pot fi utilizate ca metode unice de detectare. *8) Testul biologic Testul biologic este folosit pentru izolarea bacteriei Ralstonia solanacearum din depozitul extractului de cartof prin îmbogăţire selectiva într-o planta gazda şi se poate efectua pe plante de tomate sau vinete. Testul solicita condiţii optime de incubare, ce sunt specificate în aceasta metoda. Bacteriile ce inhiba bacteria Ralstonia solanacearum pe mediul SMSA, probabil, nu vor interfera în acest test. *9) Test(e) de confirmare Identificarea certa a unei culturi pure de Ralstonia solanacearum se obţine prin cel puţin unul dintre testele enumerate în secţiunea II pct. 4.1, în combinaţie cu un test de patogenitate (secţiunea II pct. 4.3). Caracterizarea tulpinilor este opţională, dar este recomandată pentru fiecare caz nou. SECŢIUNEA II DIAGNOZA PUTREGAIULUI BRUN AL TUBERCULILOR DE CARTOFI ŞI A VESTEJIRII BACTERIENE LA PLANTELE DE CARTOFI ŞI TOMATE 1. Simptome 1.1. Simptome la cartof Pe plante. Stadiul incipient al infecţiei este reprezentat de vestejirea frunzelor înspre vârful plantei în timpul temperaturilor diurne ridicate, şi de revenirea acestora în timpul nopţii. Vestejirea devine repede ireversibila şi duce la moartea plantei. Ţesutul vascular, în secţiune transversala prin tulpina plantelor ofilite, poate deveni brun şi un exudat laptos poate să apara spontan la suprafaţa secţiunii sau prin presare uşoară. Dacă, tulpina sectionata se aseaza în poziţie verticala în apa, din ţesutul vascular se elimina un exudat vâscos asemănător unui firicel. Pe tuberculi. Se secţionează transversal tuberculii de cartofi, în apropierea stolonului. În stadiul incipient al infecţiei apare o decolorare galben-sticlos spre brun-deschis a inelului vascular din care se elimina în mod spontan după câteva minute un exudat crem pal sau dacă se preseaza uşor suprafaţa taiata. Mai târziu decolorarea vasculara devine de un brun mai distinct, iar necroza se poate extinde şi la ţesutul parenchimatos. În stadii avansate infecţia se manifesta şi la nivelul stolonilor şi al ochilor şi poate duce la leziuni de culoare brun-roscat uşor adâncite ale cojii, din care se elimina bacterii, ce permit aderarea particulelor de sol. 1.2. Simptome la tomate Pe plante. Primul simptom vizibil este vestejirea aparenta a frunzelor ţinere. În condiţii favorabile de mediu (temperatura solului circa 25°C, umiditate mare), în câteva zile apare epinastia şi ofilirea unei părţi sau a întregii plante, ce duc la colapsul total al plantei. În condiţii mai puţin favorabile (temperatura solului sub 21°C) se pot dezvolta un număr mare de rădăcini adventive. Este posibil să se observe o banda subţire unsuroasa de-a lungul tulpinii ce dovedeşte necroza sistemului vascular. Dacă tulpina se secţionează transversal, din ţesutul vascular brunificat al tulpinii se elimina picături albe galbui de exudat bacterian. 2. Teste de selecţie rapida Testele de selecţie rapida usureaza diagnosticul prezumtiv. Se foloseşte unul sau mai multe dintre următoarele teste: Testul eliminării exudatului bacterian din tulpina Prezenta bacteriei Ralstonia solanacearum în tulpini ofilite de cartof sau tomate poate fi evidenţiată prin următorul test prezumtiv: Se taie tulpina deasupra nivelului solului. Se pune suprafaţa taiata într-un pahar cu apa. Imediat după aceea, fire de exudat bacterian se elimina spontan din fasciculele vasculare. Nici o alta bacterie care produce infecţii vasculare la cartofi sau tomate nu va prezenta acest fenomen. Detectarea granulelor de poli-beta-hidroxibutirat (PHB) Granulele de PHB din celulele de Ralstonia solanocearum sunt vizualizate prin colorarea cu albastru de Nil A sau cu negru de Sudan B. Se prepara un frotiu din exudatul bacterian sau din ţesutul în suspensie pe o lama de microscop sau se prepara un frotiu dintr-o cultura de 48 de ore pe mediu YPGA sau SPA. (apendicele 1). Se prepara şi frotiuri cu martori pozitivi din tulpina biovar 2/rasa 3 şi, dacă se considera necesar, un frotiu cu martor negativ dintr-o tulpina eterogenă. Se lasa la uscat. Se trece rapid partea inferioară a lamei de câteva ori prin flacara, pâna la fixarea frotiului. Testul cu albastru de Nil 1. Frotiul fixat se scufunda într-o soluţie apoasă 1% de albastru de Nil A. Se incubeaza 10 minute la 55°C. 2. Se usucă soluţia coloranta. Se spala rapid cu apa de la robinet. Excesul de apa se îndepărtează cu sugativa. 3. Frotiul se scufunda într-o soluţie apoasă 8% de acid acetic. Se incubeaza un minut la temperatura camerei. 4. Se spala uşor cu apa de la robinet. Se usucă cu sugativa. 5. Se umezeste cu o picatura de apa. Se aplica o lamela de acoperire. 6. Se examinează frotiul colorat la un microscop cu epifluorescenta la 450 nm, sub imersie în ulei, la o mărire de 1000 de ori. Se observa fluorescenta portocalie strălucitoare a granulelor PHB. De asemenea, se observa în lumina normală pentru a avea certitudinea ca granulele sunt intracelulare şi ca morfologia celulei este tipica pentru Ralstonia solanacearum. Testul cu negru de Sudan 1. Frotiul fixat se scufunda într-o soluţie de 0,3% negru de Sudan B în 70% etanol. Se incubeaza 10 minute la temperatura camerei. 2. Se usucă soluţia coloranta. Se spala rapid cu apa de la robinet. Se îndepărtează excesul de apa cu sugativa. 3. Frotiul se înmoaie puţin în xilen. Se usucă cu sugativa. Atenţie! Xilenul este un produs dăunător. Se lucrează la o nisa de eliminare a substanţelor toxice. 4. Se scufunda frotiul în soluţie apoasă 0,5% (w/v) de safranin şi se lasa 10 secunde la temperatura camerei. Atenţie! Safraninul este un produs dăunător. Se lucrează la o nisa de eliminare a substanţelor toxice 5. Se spala uşor cu apa de la robinet. Se usucă cu sugativa. Se aplica o lamela de acoperire. 6. Se examinează frotiul colorat la un microscop optic, utilizând lumina transmisă, sub imersie în ulei, la o mărire de 1000 de ori. Granulele de PHB din celulele de Ralstonia solanacearum se coloreaza în albastru-negricios. Membrana celulara se coloreaza în roz. Alte teste Alte teste de selecţie corespunzătoare sunt testul IF (secţiunea III pct. 2), testul ELISA (secţiunea III pct. 3) şi testul PCR (secţiunea III pct. 4). 3. Procedura de izolare 3.1. Se prelevează exudatul sau secţiuni de ţesut decolorat din inelul vascular al tuberculului de cartof sau din vasele conducătoare ale tulpinii plantei de cartof sau tomata. Se efectuează o suspensie într-un volum mic de apa distilata sterila sau un tampon fosfat de 500 mM. Se lasa 5-10 minute. 3.2. Se prepara o serie de diluţii zecimale ale suspensiei, de exemplu, 1/10 şi 1/100 sau mai multe dacă se considera necesar. 3.3. Se transfera un volum standard de suspensie şi de diluţii pe un mediu nutritiv comun (NA, YPGA şi SPA, apendicele 1) şi/sau pe mediu cu tetrazoliu Kelman (apendicele 1) şi/sau în mediul selectiv SMSA. (apendicele 7). Se însamânteaza printr-o tehnica corespunzătoare de însămânţare a dilutiilor. Dacă se considera necesar, se însamânteaza pe fiecare mediu o suspensie de celule diluata din tulpina virulenta biovar 2/rasa 3 de Ralstonia solanacearum, drept control pozitiv. 3.4. Se incubeaza plăcile timp de trei zile la 28°C. Incubarea poate fi prelungită la şase zile dacă creşterea este lenta, dar coloniile de pe mediu SMSA devin deseori atipice şi mor. Pe mediile nutritive generale, izolatele virulente de Ralstonia solanacearum dezvolta colonii de culoare albe-perlat, plate, neregulate şi fluide, deseori cu verticile caracteristice. Pe mediu cu tetrazoliu Kelman coloniile tipice ale izolatelor virulente de Ralstonia solanacearum sunt de culoare crem, plate, neregulate şi fluide cu verticile roşii-sângerii în centru. Formele avirulente de Ralstonia solanacearum dezvolta colonii butiroase de culoare roşie intensa. Pe mediul SMSA, coloniile tipice ale izolatelor virulente de Ralstonia solanacearum sunt de culoare alb-laptos, plate, neregulate şi fluide cu coloraţie roşu-sângeriu în centru. Formele avirulente de Ralstonia solanacearum dezvolta colonii mai puţin fluide, care sunt în întregime de culoare roz pâna la roşu în mediul SMSA. 3.5. Se purifica coloniile cu morfologie caracteristica prin subcultura într-un mediu nutritiv general. Se evita subcultura repetată care poate duce la pierderea virulentei. 4. Test(e) de confirmare 4.1. Identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum Culturile pure de Ralstonia solanacearum se identifica prin cel puţin una dintre procedurile următoare: Teste enzimatice şi de nutriţie NOTA: În fiecare test folosit se includ tulpinile de control corespunzătoare. Următoarele proprietăţi fenotipice ale bacteriei Ralstonia solanacearum sunt universal prezente sau absente:
Pigment fluorescent -
Incluziuni PHB +
Test de oxidare/fermentare (O/F) O+/F-
Catalaza +
Oxidaza Kovacs +
Reducerea nitraţilor +
───────────────────────────────────────────────
Utilizarea citratului +
Creştere la 40°C -
───────────────────────────────────────────────
Creştere în 1% NaCl +
Creştere în 2% NaCl -
Arginina dihidrolaza -
Lichefierea gelatinei -
Hidroliza amidonului -
Hidroliza esculinei -
Producţie de levan -
Mediile şi metodele se găsesc în Lelliott & Stead (1987) Testul IF Se prepara o suspensie de 10^6 celule/ml din cultura şi din tulpina sau tulpinile-martor. Se prepara o serie de diluţii duble de antiser. Se aplica procedura IF (secţiunea III pct. 2). Titrul IF al culturii trebuie să fie echivalent cu cel al controlului pozitiv. Testul ELISA Se prepara o suspensie de > 10^6 celule/ml din cultura şi din tulpina sau tulpinile martor. Se aplica procedura ELISA (secţiunea III pct. 3). Valoarea ELISA a culturii trebuie să fie echivalenta cu cea a controlului pozitiv. Testul PCR Se prepara o suspensie de 10^6 celule/ml din cultura şi din tulpina sau tulpinile martor. Se aplica procedura PCR (secţiunea III pct. 4). Produsul PCR al culturii trebuie să aibă aceeaşi dimensiune şi acelaşi profil al analizei enzimatice restrictive (REA) cu cel al controlului pozitiv. Hibridizare fluorescenta insitu (FISH) Se prepara o suspensie de 10^6 celule/ml din cultura şi din tulpina sau tulpinile-martor. Se aplica procedura FISH (van Beuningen et al, 1995) cu primerii OLI-1 PCR (Seal et al, 1993). Cultura trebuie să prezinte aceeaşi reacţie ca şi controlul pozitiv. Profilul proteic Proteinele celulelor întregi denaturate se separa prin electroforeza în gel de poliacrilamida - PAGE (Stead, 1992a). Profilul acizilor graşi (FAP) Se creşte cultura şi o tulpina martor pozitiv timp de 48 de ore la 28°C în mediu tripticaz-soia-agar şi se aplica procedura FAP (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead, 1992b). Profilul culturii trebuie să fie identic cu cel al controlului pozitiv. În condiţiile specificate, acizii graşi caracteristici sunt 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH şi 18:1 2OH. 4.2. Caracterizarea tulpinilor Caracterizarea unei tulpini este opţională, dar este recomandată pentru fiecare caz nou folosindu-se cel puţin una dintre următoarele determinări: Determinarea biovarului Ralstonia solanacearum se separa pe biovari în baza capacităţii de a produce acid din trei hexoze alcoolice şi trei zaharuri (Hayward, 1964 & 1994):
┌────────────────────┬───────────────────────────────────────┐
│ │ Biovar │
│ Utilizarea: ├───────┬───────┬───────┬───────┬───────┤
│ │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │
├────────────────────┼───────┼───────┼───────┼───────┼───────┤
│- maltozei │ - │ + │ + │ - │ + │
├────────────────────┼───────┼───────┼───────┼───────┼───────┤
│- lactozei │ - │ + │ + │ - │ + │
├────────────────────┼───────┼───────┼───────┼───────┼───────┤
│- celobiozei │ - │ + │ + │ - │ + │
├────────────────────┼───────┼───────┼───────┼───────┼───────┤
│- manitolului │ - │ - │ + │ + │ + │
├────────────────────┼───────┼───────┼───────┼───────┼───────┤
│- sorbitei │ - │ - │ + │ + │ - │
├────────────────────┼───────┼───────┼───────┼───────┼───────┤
│- dulcitolului │ - │ - │ + │ + │ - │
└────────────────────┴───────┴───────┴───────┴───────┴───────┘
Testele suplimentare diferenţiază biovarul 2 în subfenotipuri (Hayward, 1994):
┌────────────────────────────┬──────────┬────────────┬────────────┐
│ │ Biovar 2 │ Biovar 2-A │ Biovar 2-T │
├────────────────────────────┼──────────┼────────────┼────────────┤
│Utilizarea trehalozei │ - │ + │ + │
├────────────────────────────┼──────────┼────────────┼────────────┤
│Utilizarea inozitei │ + │ - │ + │
├────────────────────────────┼──────────┼────────────┼────────────┤
│Utilizarea D-ribozei │ - │ - │ + │
├────────────────────────────┼──────────┼────────────┼────────────┤
│Activitate pectolitica │ Scăzută │ Scăzută │ Ridicată │
└────────────────────────────┴──────────┴────────────┴────────────┘
Determinarea rasei Rasa se poate determina (Buddenhagen et al., 1962) în baza testelor de patogenitate la plante de tomate sau vinete şi la plante de tutun şi printr-un test de hipersensibilitate (HR) la frunzele de tutun (Lozano şi Sequeira, 1970):
┌──────────────────────────┬───────────────────────────────────────────────────┐
│ │ Rasa* │
│ Reacţia la: ├─────────────────────┬──────────────┬──────────────┤
│ │ 1 │ 2 │ 3 │
├──────────────────────────┼─────────────────────┼──────────────┼──────────────┤
│- plante de tomate/vinete │ Ofilire │Nici o reacţie│ Ofilire │
├──────────────────────────┼─────────────────────┼──────────────┼──────────────┤
│- plante de tutun │ Ofilire │Nici o reacţie│Nici o reacţie│
├──────────────────────────┼─────────────────────┼──────────────┼──────────────┤
│- frunze de tutun │ Necroza (48 de ore) │ HR (12 - 24 │ Cloroza │
│ │şi ofilire (7-8 zile)│ ore) │ (2-8 zile) │
├──────────────────────────┴─────────────────────┴──────────────┴──────────────┤
│* rasa 4 (patogena pe ghimbir şi alte câteva plante gazda) şi rasa 5 (patogena│
│doar pe dud) nu sunt incluse. │
└──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘
Caracterizarea raselor prin testul de patogenitate sau prin testul de hipersensibilitate la tutun poate să nu fie foarte exactă dar, în schimb, pot fi deduse din biovar şi gazda naturala de origine. Cultura poate fi caracterizată în continuare prin: Amprenta genomica Diferenţierea moleculara a tulpinilor din complexul Ralstonia solanacearum se poate face prin: Analiza RFLP (Cook et al., 1989) Repetarea secvenţelor PCR [REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al, 1995; Smith et al, 1995)] 4.3. Testul de patogenitate Acesta este un test pentru confirmarea diagnosticului de Ralstonia solanacearum şi pentru stabilirea virulentei culturilor identificate de Ralstonia solanacearum. Se prepara un inocul de 10^6 celule/ml din cultura şi din tulpina martor pozitiv. Se inoculeaza 5-10 plante de tomate sau vinete, preferabil la nivelul celei de a treia frunze adevărate sau mai batrâne (secţiunea III pct. 6.). Se incubeaza pâna la doua săptămâni la 22°C-28°C şi umiditate relativă mare, udându-le zilnic. Se observa vestejirea şi/sau epinastia, cloroza, piticirea. Se izoleaza din plantele cu simptome, astfel: - se prelevează o secţiune de ţesut din tulpina, la 2 cm deasupra punctului inocularii. - se marunteste şi se suspenda într-un volum mic de apa distilata sterila sau de tampon fosfat de 50 mM. Se însamânteaza pe placa, se incubeaza şi se verifica existenta coloniilor tipice de Ralstonia solanacearum. SECŢIUNEA III DETECTAREA ŞI IDENTIFICAREA BACTERIEI RALSTONIA SOLANACEARUM ÎN PROBELE DE TUBERCULI DE CARTOFI NOTA: Mărimea standard a unei probe este de 200 de tuberculi. Cu toate acestea, procedura se poate aplica în mod convenabil probelor cu mai puţin de 200 de tuberculi. 1. Pregătirea probei pentru testare NOTA: Extractul final de cartof (depozitul obţinut în urma centrifugarii) obţinut în aceasta procedura poate fi utilizat, de asemenea, pentru detectarea bacteriei Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Opţiuni de pretestare, dacă se considera necesar: (i) se incubeaza proba la 25-30°C pâna la doua săptămâni, pentru a favoriza multiplicarea populaţiilor mici de Ralstonia solanacearum; (ii) se spala tuberculii sub jet de apa cu dezinfectanţi şi detergenţi corespunzători. Tuberculii se usucă la aer. 1.1. Cu un bisturiu curat şi dezinfectat se îndepărtează coaja de la nivelul hilului tuberculului, astfel încât să fie vizibile tesuturile vasculare. Se taie cu atenţie un miez conic mic (3-5 mm diametru) de ţesut vascular de la nivelul hilului. Cantitatea de ţesut nevascular trebuie redusă la minimum. Se prelucrează fiecare tubercul din proba. NOTA: În aceasta etapa se poate efectua examinarea vizuala a tuberculilor (secţiunea II pct. 1). Se separa orice tubercul cu simptome sau cu putrezire severă şi se testează separat (secţiunea II) 1.2. Se colectează conurile într-un container închis. Este preferabil ca acestea să fie prelucrate imediat. Dacă nu este posibil, se depozitează, pentru cel mult 24 de ore sau, la 4°C, pentru nu mai mult de 72 de ore. 1.3. Se pregătesc conurile prin una din următoarele proceduri: (i) Se transfera conurile într-un recipient corespunzător. Se adauga un volum suficient de tampon de macerare pentru a acoperi conurile (apendicele 2). Conurile se maruntesc într-un malaxor de tip Waring Blender sau Ultra Thurrax pâna la omogenizarea completa. Se evita omogenizarea excesiva. Se lasa maceratul să se înmoaie timp de 15-30 de minute. (ii) Se transfera conurile într-un recipient corespunzător. Se adauga un volum suficient de tampon de macerare pentru a acoperi conurile. Se plasează recipientul într-un agitator rotativ. Se incubeaza la 50-100 rpm timp de 4 ore la 20°C-22°C sau timp de 16-24 de ore la 4°C. (iii) Se transfera conurile într-o punga de macerare rezistenta, de unica folosinţa (de exemplu, sacul Stomacher cu dimensiunile 105 mm x 150 mm, sterilizat prin radiaţii). Conurile se zdrobesc cu atenţie cu un instrument corespunzător, de exemplu, un ciocan, pâna la realizarea omogenizării complete. Se adauga un volum suficient de tampon de macerare pentru a acoperi conurile Se lasa maceratul să se limpezeasca timp de 15 - 3 de minute. 1.4. Bacteriile se extrag din conuri prin una dintre următoarele proceduri: (i) Maceratul se filtreaza încet într-un tub de centrifugare, lasându-se resturile în recipient sau în punga. Dacă maceratul filtrat este tulbure, se centrifugheaza timp de 10 minute la cel mult 180 g la o temperatura sub 10°C. Se centrifugheaza maceratul filtrat sau supernatantul din prima etapa de centrifugare la 7000 g timp de 15 minute sau la 10000 g timp de 10 minute, la o temperatura sub 10°C. Se îndepărtează supernatantul fără a deranja depozitul. (ii) Se filtreaza maceratul printr-un sistem de filtrare cu mărimea porilor de 40-100 мm. Se accelerează filtrarea utilizându-se o pompa cu vid. Se colectează filtratul într-un tub de centrifugare. Se spala filtrul cu tamponul de macerare. Se centrifugheaza filtratul la 7000 g timp de 15 minute sau la 10000 g timp de 10 minute, la o temperatura sub 10°C. Se îndepărtează supernatantul fără a deranja depozitul. 1.5. Depozitul se suspenda în 1 ml de tampon de macerare (apendicele 2). Se împarte în doua părţi egale şi se transfera fiecare parte în câte o microfiola. Una dintre microfiole se foloseşte pentru testare. Restul extractului se conserva pe perioada testelor la temperatura de 4°C. Se adauga 10-25% (v/v) glicerol steril în cealaltă microfiola. Se agita. Se depozitează la -18°C (săptămâni) sau la -70°C (luni). 2. Testul IF Se foloseşte antiserul pentru Ralstonia solanacearum, preferabil rasa 3/biovar 2. Se determina titrul unei suspensii de 10^6 celule/ml din tulpina omoloagă de Ralstonia solanacearum cu o diluţie corespunzătoare de antiser conjugat cu izotiocianat de fluoresceina (FITC), în conformitate cu recomandările producătorului. Antiserul brut ar trebui să aibă o valoare IF de minimum 1:2000. Se utilizează lame microscopice cu mai multe godeuri, de preferinţa cu 10 godeuri de minim 6 mm diametru. Pe fiecare lama de testare se include câte un control cu FITC conjugat. Testul ar trebui repetat cu includerea unui control cu PBS, dacă este observata o celula pozitiva în controlul cu FITC. Se prepara separat lame cu control pozitiv cu o suspensie de 10^6 celule/ml dintr-o tulpina corespunzătoare de rasa/biovar de Ralstonia solanacearum. Se utilizează câte o lama la fiecare set de teste. 2.1. Lamele de testare se prepara prin una dintre următoarele proceduri: (i) pentru depozitele cu amidon relativ puţin: Se pipeteaza un volum standard (15 мl este adecvat unui godeu de 6 mm diametru - volumul se măreşte pentru godeuri mai mari) din depozitul resuspendat într-un şir de godeuri. Şirul rămas poate fi folosit ca duplicat sau pentru o a doua proba, după cum se prezintă în figura 1. (ii) pentru alte depozite concentrate: Se pregătesc diluţii zecimale de 1/10, 1/100 şi 1/1000 din depozitul resuspendat în tamponul de macerare. Se pipeteaza un volum standard (15 мl corespund unui godeu de 6 mm diametru - volumul se măreşte pentru godeurile mai mari) din depozitul resuspendat şi fiecare diluţie într-un şir de godeuri. Şirul rămas poate fi folosit ca duplicat sau pentru o a doua proba, după cum se prezintă în figura 2. 2.2. Se lasa picaturile să se usuce. Celulele bacteriene se fixează pe lama prin încălzire, flambare prin flacara sau cu 95% etanol. 2.3. Procedura IF (i) În conformitate cu pregătirea lamei de testare de la pct. 2.1 (i): se prepara un set de diluţii duble ale antiserului în tampon IF (apendicele 3): 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) şi de doua ori titrul (2T). (ii) În conformitate cu pregătirea lamei de testare de la pct. 2.1 (ii): se prepara diluţia de lucru (working dilution) a antiserului în tampon IF. Diluţia de lucru este diluţia cu antiser cu specificitate optima şi are de obicei jumătate din titru. Figura 1 Nota C.T.C.E. PIATRA-NEAMŢ -------------------------- Figura se găseşte în Monitorul Oficial al României, Partea I, Nr. 327 bis din data de 14.05.2003. Pregătirea lamei de testare în conformitate cu pct. 2.1 (i) şi pct. 2.3. (i)
Diluţie standard a depozitului resuspendat
T = titru
FITC T/4 T/2 T 2T => dilutiile duble
ale antiserului
┌───────────────────────┬───────┬───────┬───────┬───────┬───────┐
│Proba 1 │ c 1 │ c 2 │ c 3 │ c 4 │ c 5 │
├───────────────────────┼───────┼───────┼───────┼───────┼───────┤
│Duplicatul probei 1 │ c 6 │ c 7 │ c 8 │ c 9 │ c 10 │
│sau al probei 2 │ │ │ │ │ │
└───────────────────────┴───────┴───────┴───────┴───────┴───────┘
Figura 2 NOTA C.T.C.E. PIATRA-NEAMŢ -------------------------- Figura se găseşte în Monitorul Oficial al României, Partea I, Nr. 327 bis din data de 14.05.2003. Pregătirea lamei de testare în conformitate cu pct. 2.1 (ii) şi pct. 2.3 (ii)
FITC Diluţie standard a antiserului
pur pur 1/10 1/100 1/1000 => Dilutiile decimale
ale depozitului
resuspendat
┌───────────────────┬───────┬───────┬───────┬───────┬───────┐
│Proba 1 │ c 1 │ c 2 │ c 3 │ c 4 │ c 5 │
├───────────────────┼───────┼───────┼───────┼───────┼───────┤
│Duplicatul probei 1│ c 6 │ c 7 │ c 8 │ c 9 │ c 10 │
│sau al probei 2 │ │ │ │ │ │
└───────────────────┴───────┴───────┴───────┴───────┴───────┘
2.3.1. Se aranjează lamele pe hârtie de filtru umeda Se acoperă godeurile de testare cu diluţie sau dilutiile antiserului. În godeurile cu FITC se aplica PBS. Volumul antiserului aplicat în godeuri trebuie să fie echivalent cu volumul extractului aplicat. 2.3.2. Se incubeaza acoperit timp de 30 de minute la temperatura camerei. 2.3.3. Se agita picaturile de antiser de pe lama şi se clatesc lamele cu atenţie, cu un tampon IF. Se spala timp de 5 minute în soluţie tampon IF - Tween şi apoi 5 minute în tampon IF (apendicele 3). Excesul de umiditate se îndepărtează cu grija. 2.3.4. Se aranjează lamele pe hârtie de filtru umeda. Se acoperă godeurile de testare şi godeurile FITC cu diluţia conjugatului FITC utilizat pentru determinarea titrului. Volumul conjugatului aplicat în godeuri trebuie să fie echivalent cu volumul antiserului aplicat. 2.3.5. Se incubeaza acoperit timp de 30 de minute la temperatura camerei. 2.3.6. Se agita picaturile de conjugat de pe lama. Se clatesc şi se spala conform pct. 2.3.3. Se îndepărtează cu grija excesul de umiditate. 2.3.7. Se pipeteaza 5-10 мl glicerol - tampon fosfat 0,1 M (apendicele 3) sau ceva similar în fiecare godeu şi se acoperă. 2.4. Citirea testului IF Se examinează lamele de testare la un microscop cu epifluorescenta, cu filtre compatibile pentru excitarea FITC, sub imersie în ulei, la o mărire de 500-1000 de ori. Se examinează godeurile de-a lungul a doua diametre în unghi drept şi de-a lungul perimetrului. Se verifica mai întâi lama de control pozitiv. Celulele trebuie să fie intens fluorescente şi complet colorate. NOTA: Testul trebuie repetat dacă apare o coloraţie anormala. Se citesc lamele de testare. Se observa mai întâi absenta celulelor fluorescente în godeurile de control cu FITC. Celulele fluorescente din controlul cu FITC indica legături nespecifice ale conjugatului, autofluorescenta sau contaminare. NOTA: Dacă se observa acestea, testul trebuie repetat. Se observa celule intens fluorescente cu o morfologie caracteristica bacteriei Ralstonia solanacearum în godeurile de testare. Intensitatea fluorescentei trebuie să fie echivalenta cu cea a tulpinii de control pozitiv, la aceeaşi diluţie a antiserului. Celulele cu o coloraţie incompleta sau cu o fluorescenta slaba nu trebuie luate în considerare dacă nu sunt în număr mare (vezi interpretarea rezultatului testului IF). Interpretarea rezultatului testului IF: (i) Dacă nu sunt descoperite celule intens fluorescente cu morfologie caracteristica, testul IF este negativ. (ii) Dacă sunt descoperite celule intens fluorescente cu morfologie caracteristica, se determina numărul mediu de celule pe câmp microscopic şi se calculează numărul de celule (N)/ml de depozit resuspendat (apendicele 4). O populaţie de aproximativ 10^3 celule/ml de depozit resuspendat este considerată a fi limita de sensibilitate pentru testul IF: - pentru probele cu N > 10^3 celule/ml de depozit resuspendat, testul IF este considerat pozitiv; pentru probele cu N < 10^3 celule/ml de depozit resuspendat, testul IF poate fi considerat pozitiv; (iii) Dacă se observa un număr mare (> 10^5 celule/ml) de celule incomplet sau slab fluorescente în titrul antiserului, trebuie efectuat un al doilea test: - un test bazat pe un principiu biologic diferit; sau - o repetare a testului IF, cu un al doilea antiser sau cu o diluţie de zece ori a depozitului. 3. Testul ELISA În baza Robinson - Smith et al., 1995 Se foloseşte antiser pentru Ralstonia solanacearum, preferabil rasa 3/biovar 2. Se determina titrul suspensiei de 10^6 celule/ml din tulpina omoloagă de Ralstonia solanacearum. Se recomanda folosirea plăcilor de microtitrare NUNC - Polysorb. Se include un control negativ de extract de cartof şi un control dintr-o soluţie tampon de fosfat salin (PBS). Se foloseşte o suspensie de > 10^6 celule/ml dintr-o tulpina corespunzătoare de rasa/biovar de Ralstonia solanacearum, drept control pozitiv. Se testează în mod identic cu proba sau probele, dar separat de probele de pe placa de microtitrare. 3.1. Se pipeteaza 100 - 20 мl din depozitul resuspendat într-o microfiola. Se încălzeşte timp de 4 minute la 100°C. Se pune microfiola la gheaţa. 3.2. Se adauga un volum egal de tampon de căptuşire ce conţine carbonat dublu concentrat (apendicele 5). Se agita. 3.3. Se aplica 100 мl în fiecare dintre cele doua repetiţii (minimum doua repetiţii) de pe plăcile de microtitrare. Se incubeaza o ora la 37°C sau peste noapte la 4°C. 3.4. Se îndepărtează extractele din godeuri. Se spala godeurile de trei ori cu PBS - Tween (apendicele 5), lasându-se ultima soluţie de spălare cel puţin 5 minute în godeuri 3.5. Se prepara diluţia corespunzătoare a antiserului de Ralstonia solanacearum în tampon de blocare (apendicele 5). Se pipeteaza 100 мl diluţie de antiser în godeuri. Se incubeaza timp de o ora la 37°C. 3.6. Se îndepărtează antiserul din godeuri. Se spala conform pct. 3.4. 3.7. Se prepara diluţia corespunzătoare de conjugat ce conţine fosfataza alcalină în tampon de blocare. Se aplica 100 мl de diluţie conjugata în godeuri. Se incubeaza timp de o ora la 37°C. 3.8. Se îndepărtează conjugatul din godeuri. Godeurile se spala conform pct. 3.4 şi 3.6. 3.9. Se prepara soluţia de substrat ce conţine fosfataza alcalină (apendicele 5). Se pipeteaza 100 мl în godeuri. Se incubeaza timp de 30 de minute pâna la o ora, în întuneric, la temperatura camerei. 3.10. Se citeşte absorbanta la 409 nm. Interpretarea testului ELISA: Testul ELTSA este negativ dacă densitatea optica (DO) a probei este < 2 x DO a controlului negativ. Testul ELISA este pozitiv dacă densitatea optica (DO) a probei este > 2 x DO a controlului negativ. 4. Testul PCR Bazat Seal et al., 1993 Nota: În timpul tuturor etapelor de pregătire a probelor şi a altor manipulări ce implica PCR trebuie folosite pipete cu filtru. Se prepara o suspensie de 10^6 celule/ml dintr-o tulpina din rasa 3/biovar 2 de Ralstonia solanacearum drept control pozitiv. Se testează în mod identic cu proba sau probele. 4.1. Se pipeteaza 100 мl din depozitul resuspendat într-o microfiola. În mod alternativ se transfera 90 мl din depozitul resuspendat într-o microfiola conţinând 10 мl de 0,5 M de NaOH. Se amesteca întorcându-se în mod repetat microfiola. 4.2. Se încălzeşte timp de 4 minute la 100°C. Se pune imediat microfiola la gheaţa. 4.3. Se prepara cel puţin doua diluţii decimale, de exemplu, 1/10 şi 1/100 sau mai multe, dacă se considera util, în apa distilata sterila sau ultrapura (AUP) 4.4. Se prepara amestecul de reacţie PCR (apendicele 6) într-o fiola sterila, prin adăugarea următoarelor componente în ordinea următoare: Pentru un volum de reacţie de 50 мl:
┌──────────────────────────────────────────────┬───────────┬───────────────────┐
│ Component │ Cantitate │Concentraţie finala│
├──────────────────────────────────────────────┼───────────┼───────────────────┤
│Apa distilata sterila sau AUP 30,8 мl-33,8 мl │ │ │
├──────────────────────────────────────────────┼───────────┼───────────────────┤
│Tampon PCR L 10 │ 5,0 мl │ 1 L │
├──────────────────────────────────────────────┼───────────┼───────────────────┤
│d-ATP │ 1,0 мl │ 0,2 mM │
├──────────────────────────────────────────────┼───────────┼───────────────────┤
│d-CTP │ 1,0 мl │ 0,2 mM │
├──────────────────────────────────────────────┼───────────┼───────────────────┤
│d-GTP │ 1,0 мl │ 0,2 mM │
├──────────────────────────────────────────────┼───────────┼───────────────────┤
│d-TTP │ 1,0 мl │ 0,2 mM │
├──────────────────────────────────────────────┼───────────┼───────────────────┤
│Primer OLI - 1 (20 мM) │ 2,5 мl │ 1 мM │
├──────────────────────────────────────────────┼───────────┼───────────────────┤
│Primer Y - 2 (20 мM) │ 1,0 мl │ 1 мM │
├──────────────────────────────────────────────┼───────────┼───────────────────┤
│Polimerizare taq (5 U/мl) │ 0,2 мl │ 1,0 U │
├──────────────────────────────────────────────┼───────────┼───────────────────┤
│Volum total │45 мl-48 мl│ │
└──────────────────────────────────────────────┴───────────┴───────────────────┘
Pentru mai multe reacţii: Se calculează cantitatea fiecărui component pentru numărul de reatii necesare. Se amesteca aceste componente şi se transfera 45 мl - 48 мl din amestec în fiole PCR sterile. Fiolele cu amestecul de reacţie PCR se păstrează la gheaţa. Pentru volume de reacţie de 25 мl: Se diminuează corespunzător componentele. 4.5. Amplificarea PCR 4.5.1. Opţional: se centrifugheaza ritmic fiolele cu o proba fiarta şi cu un martor pozitiv. Se adauga în fiolele cu amestecul de reacţie PCR, în ordinea specificată, 2-5 мl din proba sau probele, apa martor şi controlul pozitiv. Se pun fiolele în blocul de încălzire al termociclului de ADN. 4.5.2. Se ruleaza următorul program: 1 ciclu de: (i) 2 minute la 96°C: denaturarea catenei 50 cicluri de: (ii) 20 de secunde la 94°C: denaturare (iii) 20 de secunde la 68°C: recombinarea primerilor (iv) 20 de secunde la 72°C: extensia copiei 1 ciclu de: (v) 10 minute la 72°C: extensie continua 1 ciclu de: (vi) menţinere la 4°C NOTA: Aceşti parametri sunt pentru Perkin Elmer 9600. Alte termocicluri pot necesita un strat de ulei mineral în fiolele de reacţie PCR şi/sau modificarea duratei etapelor de la (ii), (iii) şi (iv) din etapa de amplificare. 4.5.3. Se scot fiolele din termociclu. Se analizează produsul PCR. Dacă analiza se efectuează în aceeaşi zi, fiolele se păstrează la 4°C, iar dacă se efectuează după o perioada mai mare de timp, ele se stochează la -18°C. 4.6. Analiza produsului PCR Fragmentele PCR se detecteaza prin electroforeza în gel de agaroza şi colorare cu bromura de etidiu. 4.6.1. Se prepara un gel corespunzător de agaroza aducându-se încet agaroza la fierbere, în tampon de triacetat-electroforeza (TAE). 4.6.2. Se raceste agaroza topita la 50-60°C, se toarna în cuva electroforezei şi se introduce pieptenul. Soluţia se lasa să se solidifice. 4.6.3. Se îndepărtează pieptenul. Gelul se introduce în TAE astfel încât să fie acoperit cu 2-3 mm de tampon. 4.6.4. Se pun 3 мl de picături de tampon de încărcare pe parafilm. Se adauga 12 мl din produsul PCR din proba, din controlul pozitiv sau din controlul de apa şi se amesteca prin aspirarea uşoară în vârful pipetei înainte de încărcare. Volumele date pot fi modificate pentru a corespunde capacităţii godeurilor din gelul agarizat. 4.6.5. Crodeurile se încarca atent cu gel. Pentru referinţa se include un marker de ADN corespunzător în cel puţin unul dintre godeuri. 4.6.6. Se conectează firele de alimentare şi cele ale echipamentului pentru electroforeza. Gelul este pus sub tensiune la 5 - 8 V/cm pâna când partea din fata a indicatorului de urmărire este la 1 cm de capătul gelului. 4.6.7. Se opreşte alimentarea. Se deconecteaza cablurile de electroforeza de la curent. Gelul se îndepărtează cu atenţie. Se înmoaie în soluţie de bromura de etidiu timp de 30 - 40 de minute. NOTA: Se poarta mănuşi de unica folosire pe toată perioada manipulării bromurii de etidiu deoarece aceasta este un mutagen puternic! 4.6.8. Se decoloreaza în apa distilata timp de 10 - 15 minute. 4.6.9. Fragmentul sau fragmentele de ADN amplificate se vizualizeaza prin iluminare ultravioleta. Produsul PCR de Ralstonia solanacearum cu primeri OLI-1 şi Y-2 are lungimea de 288 bp. Se compara cu markerul de ADN şi cu controlul pozitiv. NOTA: Apa-martor trebuie să fie negativa în toate cazurile. Dacă este pozitiva, testul se repeta. 4.6.10. Dacă este necesară o înregistrare permanenta, se fotografiaza gelul. 4.6.11. Autenticitatea fragmentului amplificat este confirmată prin analiza cu enzime de restricţie (REA). 4.7. Analiza cu enzime de restricţie (REA) 4.7.1. Se transfera 8,5 мl din produsul PCR de la pct. 4.5.3 într-o alta micro fiola. Se adauga 1 мl din tamponul enzimatic X10 şi 0,5 мl din enzima de restricţie Ava II. 4.7.2. Se amesteca prin aspirarea uşoară în vârful pipetei. Dacă ramân picături pe pereţii fiolei, se centrifugheaza într-o microcentrifuga. Se incubeaza o ora la 37°C. 4.7.3. Fragmentul PCR se analizează prin electroforeza în gel de agaroza conform pct. 4.6. Interpretarea rezultatelor testului PCR Testul PCR este negativ dacă nu este detectat fragmentul caracteristic de 288 bp şi este detectat numai fragmentul pentru tulpina de control pozitiv de Ralstonia solanacearum. Testul PCR este pozitiv dacă este detectat fragmentul caracteristic de 288 bp şi analiza REA a fragmentului amplificat este identică cu tulpina de control pozitiv de Ralstonia solanacearum. 5. Testul de însămânţare pe medii selective În baza Elphinstone et al., 1996 5.1. Testul se efectuează printr-o tehnica corespunzătoare de însămânţare a dilutiilor, astfel: (i) Se prepara cel puţin doua diluţii zecimale, 1/10 мl 1/100 sau mai multe, dacă se considera util, din depozitul resuspendat în tamponul de depozitare. Se pipeteaza un volum standard măsurat (50-100 мl) din depozitul resuspendat din fiecare diluţie pe un mediu selectiv SMSA, modificat (apendicele 7) şi împrăştierea se efectuează cu o bagheta de sticla pe toată suprafaţa mediului. Dacă se considera necesar, se efectuează o însămânţare cu 10 мl din depozitul resuspendat. Ansa se trece prin flacara între însămânţări. (ii) Se transfera un volum standard măsurat (50-100 мl) din depozitul resuspendat pe mediu selectiv SMSA modificat şi se împrăştie cu o bagheta de sticla pe toată suprafaţa mediului. Se însamânteaza cel puţin alte doua plăci cu mediu SMSA modificat, fără a se flamba bagheta. 5.2. Prin aceeaşi tehnica de însămânţare a dilutiilor, se aplica o suspensie de 10^6 celule/ml dintr-o tulpina virulenta din rasa 3/biovar 2 de Ralstonia solanacearum drept control pozitiv, pe un set de plăci cu mediu SMSA modificat. 5.3. Plăcile se incubeaza la 28°C. Citirea plăcilor se face după trei zile. Dacă sunt negative, se mai incubeaza pâna la 6 zile. Coloniile din izolate virulente de Ralstonia solanacearum sunt de culoare alb-laptos, plate, neregulate şi fluide cu o coloraţie roşu-sângeriu în centru şi prezentând verticile sau dungi interne. 5.4. Coloniile cu morfologie caracteristica se pot purifica prin subcultura pe un mediu nutritiv comun (apendicele 1). 5.5. Se identifica culturile pure (secţiunea II pct. 4.1) şi confirmarea culturilor de Ralstonia solanacearum se face printr-un test de patogenitate (secţiunea II pct. 4.3). Interpretarea rezultatului testului de însămânţare pe plăci selective. Testul plăcilor selective este negativ dacă după 6 zile nu sunt izolate colonii bacteriene sau dacă nu sunt izolate colonii caracteristice de Ralstonia solanacearum, cu condiţia să nu fie bănuita o inhibiţie din cauza coloniilor unei alte bacterii şi cu condiţia ca, coloniile caracteristice de Ralstonia solanacearum să apara în controalele pozitive. Testul de însămânţare pe plăci selective este pozitiv dacă sunt izolate colonii caracteristice de Ralstonia solanacearum. 6. Testul biologic În baza Janse, 1988. 6.1. Se utilizează pâna la 10 plante test, rasad de tomate sau de vinete în stadiul celei de-a treia frunze adevărate pentru fiecare proba. Plantele test nu se uda cu 24 de ore înaintea inocularii. 6.2. Se distribuie 100 мl de depozit resuspendat între plantele test. Se inoculeaza în tulpina între cotiledoane şi în unul sau mai multe alte locuri. 6.3. Prin aceeaşi tehnica se inoculeaza 10 răsaduri cu o suspensie de 10^6 celule/ml dintr-o tulpina virulenta din biovar 2/rasa 3 de Ralstonia solanacearum drept control pozitiv şi cu un tampon de depozit drept control negativ. Se separa plantele inoculate cu martorul pozitiv de celelalte plante pentru a evita contaminarea încrucisata. 6.4. Plantele test se cresc în continuare pâna la patru săptămâni la 22°C-28°C şi umiditate relativ mare, udându-le zilnic. Se observa vestejirea, epinastia, cloroza şi/sau piticirea. 6.5. Se izoleaza din plantele infectate (secţiunea II). Se identifica culturile pure cu morfologie caracteristica (secţiunea II pct. 4.1) şi se confirma culturile de Ralstonia solanacearum printr-un test de patogenitate (secţiunea II pct. 4.3). 6.6. Dacă se considera necesar, se verifica absenta infecţiei în loturile de plante-test care nu prezintă simptome. Din fiecare planta test se prelevează o secţiune de 1 cm de tulpina, provenită de la 2 cm deasupra punctului de inoculare. Se omogenizează tesuturile într-un tampon de macerare. Se însamânteaza pe plăci (secţiunea III pct. 5.1) Dacă este pozitiva, se identifica culturile pure cu morfologie caracteristica (secţiunea II pct. 4.1) şi se confirma culturile de Ralstonia solanacearum printr-un test de patogenitate (secţiunea II pct. 4.3). Interpretarea rezultatelor testului biologic Testul biologic este negativ dacă plantele test nu sunt infectate cu Ralstonia solanacearum şi cu condiţia ca Ralstonia solanacearum să fie detectata în controalele pozitive. Testul biologic este pozitiv dacă plantele test sunt infectate cu Ralstonia solanacearum. 7. Teste de îmbogăţire După Elphinstone et al., 1996 7.1. Se transfera 100 мl de depozit resuspendat în 3 ml de bulion SMSA, modificat (apendicele 7). 7.2. Se incubeaza timp de 48 de ore şi în nici un caz mai mult de 72 de ore la temperatura de 28°C, fără a închide ermetic dopul eprubetei, pentru a permite aerisirea. 7.3. Se fixează dopul şi se agita. Se utilizează acestea pentru testul IF prevăzut la pct. 2, testul ELISA prevăzut la pct. 3 şi/sau testul PCR prevăzut la pct. 4. 8. Testul de patogenitate A se vedea secţiunea II pct. 4.3. Apendice 1 Medii nutritive pentru izolarea şi cultura de Ralstonia solanacearum
Agar nutritiv (AN)
Agar nutritiv (Difco) 23 g
Apa distilata 1 l
Se prepara câte 1/2 l de mediu în flacoane de 1 l.
Se dizolva ingredientele.
Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute.
Se raceste la 50°C. Se toarna pe plăci.
Mediu drojdie - peptona - glucoza - agar (YPGA)
Extract de levura (Difco) 5 g
Bacto-peptona (Difco) 5 g
D(+) glucoza (monohidrat) 10 g
Bacto-geloza (Difco) 15 g
Apa distilata 1 l
Se prepara câte 1/2 l de mediu în flacoane de 1 l.
Se dizolva ingredientele.
Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute.
Se raceste la 50°C. Se toarna pe plăci.
Mediu zaharoza - peptona - agar (SPA)
Zaharoza 20 g
Peptona 5 g
K(2)HPO(4) 0,5 g
MgSO(4) 7H(2)O 0,25 g
Bacto-geloza (Difco) 15 g
Apa distilata 1 l
Se prepara câte 1/2 l de mediu în flacoane de 1 l.
Se dizolva ingredientele. Se ajustează la pH 7,2-7,4, dacă este necesar.
Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute.
Se raceste la 50°C. Se toarna pe plăci.
Mediul de tetrazoliu Kelman
Acizi casaminici (Difco) 1 g
Bacto-peptona (Difco) 10 g
Dextroza 5 g
Bacto-geloza (Difco) 15 g
Apa distilata 1 l
Se prepară câte 1/2 l de mediu în flacoane de 1 l. Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute. Se răceşte la 50°C. Se adaugă o soluţie apoasă sterilizata prin filtrare de clorura de trifeniltetrazoliu (Sigma) pentru obţinerea concentraţiei finale de 50 mg la litru. Se toarnă pe plăci. Apendice 2 Materiale pentru pregătirea probelor Tampon de macerare: 50 mM tampon fosfat, pH 7,0 Acest tampon este utilizat la macerarea ţesuturilor.
Na(2)HPO(4) - 4,26 g
KH(2)PO(4) - 2,72 g
Apa distilata - 1 l
Se dizolva ingredientele şi se verifica pH-ul. Se repartizează corespunzător. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute. Este recomandată adăugarea de 5% polivinilpirolidona - 40000 MWT (PVP-40) la efectuarea testului PCR direct, pentru a reduce incidenta inhibitiei etapei amplificării datorate moleculelor aromatice din extract. Este recomandată adăugarea unui defloculant, a unui agent antispumant sau a unui antioxidant la folosirea procedurii de omogenizare cu ajutorul malaxorului de tip Waring Blender sau Ultra Turrax pentru, macerarea conurilor de cartof.
Fulgi de Lubrol - 0,5 g/l
Silicon antispumant DC - 1,0 ml/l
Pirofosfat tetrasodic - 1,0 g/l
Se autoclaveaza separat. Se adauga pâna la concentraţia dorita. Tampon pentru depozit: 10 mM tampon fosfat, pH 7,2 Acest tampon este utilizat pentru resuspendarea şi diluţia hilului şi depozitului de cartof.
Na(2)HPO(4) 12H(2)O - 2,7 g
Na(2)HPO(4) 2H(2)O - 0,4 g
Apa distilata - 1 l
Se dizolva ingredientele şi se verifica pH-ul. Se repartizează corespunzător. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute. Apendice 3 Materiale pentru testul IF Tampon IF: 10 mM tampon salin fosfat (PBS) pH 7,2 Acest tampon este utilizat pentru diluarea antiserurilor.
Na(2)HPO(4) 12H(2)O - 2,7 g
Na(2)HPO(4) 2H(2)O - 0,4 g
NaCl - 8,0 g
Apa distilata - 1 l
Se dizolva ingredientele şi se verifica pH-ul. Se repartizează corespunzător Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute. Tampon IF - Tween Acest tampon este utilizat pentru spălarea lamelor. Se adauga 0,1% Tween 20 la tamponul IF. 0,1 M tampon glicerol - fosfat pH 7,6 Acest tampon este utilizat pentru intensificarea fluorescentei.
Na(2)HPO(4) 12H(2)O - 3,2 g
NaH(2)PO(4) 2H(2)O - 0,15 g
Glicerol - 50 ml
Apa distilata - 100 ml
Apendice 4 Determinarea nivelului de contaminare în testul IF Suprafaţa (S) godeului a unei lame cu multe godeuri:
pi*D^2
S = ────── (1)
4
în care:
D este diametrul godeului
Suprafaţa (s) câmpului obiectivului:
pi*d^2
s = ────── (2)
4
în care
d este diametrul câmpului
Se calculează "d" fie prin măsurare directa sau din următoarele formule:
pi*i^2
s = ──────────, (3)
G^2K^2 x 4
în care
i = coeficientul de câmp (depinde de tipul ocularului şi variaza de la 8
la 24),
K = coeficientul tubului (1 sau 1,25),
M = mărirea obiectivului de 100 de ori, 40 de ori etc.
din formula (2):
4s
d = radical din ── ,
pi
din formula (3)
pi*i^2
4 x ────────
G^2K^2 x 4 i
d = radical din ─────────────── = ──
pi GK
Se calculează numărul de celule fluorescente tipice pe câmp (c).
Se calculează numărul de celule fluorescente tipice pe godeu (C).
S
C = c * ───
s
Se calculează numărul de celule fluorescente tipice/ml de depozit
resuspendat (N).
1000
N = C x ──── x F,
y
în care
y = volumul de depozit pe godeu,
F = factorul de diluţie al depozitului.
Apendice 5
Materiale pentru testul ELISA
Tampon de căptuşire, ce conţine carbonat dublu concentrat, pH 9,6
Na(2)CO(3) - 6,36 g
NaHCO(3) - 11,72 g
Apa distilata - 1 l
Se dizolva ingredientele şi se verifica pH-ul. Se repartizează corespunzător Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute. Poate fi adăugat sulfit de sodiu la o concentraţie finala de 0,2% ca antioxidant, dacă extractul conţine un procent ridicat de molecule aromatice. 10 x tampon salin - fosfat (PBS), pH 7,4
NaCl - 80 g
KH(2)PO(4) - 2 g
Na(2)HPO(4) 12H(2)O - 29 g
KCl - 2 g
Apa distilata - 1 l
Se dizolva ingredientele şi se verifica pH-ul. Se repartizează corespunzător Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute. Tampon salin - fosfat - Tween (PBS-T)
10 x PBS - 100 ml
10% Tween 20 - 5 ml
Apa distilata - 895 ml
Tampon de blocare (anticorpi) (trebuie preparat proaspăt)
10 \'bc PBS - 10 ml
Polivinilpirolidona-4000 MWT 2,0 g
(PVP-44)
10% Tween 20 - 0,5 g
Lapte praf - 0,5 g
Apa distilata - până la 100 ml
Soluţie de substrat ce conţine fosfataza alcalină pH 9,8
Dietanolamina - 97 ml
Apa distilata - 800 ml
Se amesteca şi se ajustează la pH 9,8 cu HCl concentrat. Se adauga apa distilata pâna la 1 l. Se adauga 0,2 g MgCl(2). Se dizolva doua tablete de 5 mg de substrat, ce conţin fosfataza (Sigma) la 15 ml de soluţie. Apendice 6 Materiale pentru testul PCR
Secventa de primeri ce conţin oligonucleotide
Primer OLI-1 -5' -GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-3'
Primer Y-2 -5' -CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'
Pentru materiale, a se vedea Seal et al., (1993).
Apendice 7 Materiale pentru testele de însămânţare pe medii selective şi de îmbogăţire Mediu selectiv SMSA (Engelbrecht, 1994 modificat de Elphinstone et al., 1996) dar se elimina geloza şi sărurile de tetrazoliu. Mediu de baza
Acizi casaminici (Difco) - 1 g
Bacto-peptona (Difco) - 10 g
Glicerol - 5 ml
Geloza (Difco) - 15 g
Apa distilata - 1 l
Se prepara 1/2 l de medru în flacoane de 1 l. Se dizolva ingredientele şi se verifica pH-ul. Se ajustează pH-ul, dacă este necesar, la 6,5 înainte de autoclavare. Ralstonia solanacearum nu se dezvolta bine într-un mediu cu pH > 7,0. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute. Se raceste la 50C°. Se adauga următoarele ingrediente (toate de la Sigma) pentru a obţine concentraţiile finale specificate:
Violet cristalizat - 5 mg la litru
Sulfat de polimixina B 100 mg la litru (circa unităţi) 600 000 Sigma P-1004
Bacitracina*) 25 mg la litru (circa unităţi) 1 250 Sigma B-0125
Cloramfenicol 5 mg la litru Sigma C-3175
Penicilina-G 0,5 mg la litru (circa 825 unităţi) Sigma -3032
Săruri de tetrazoliu 50 mg la litru
----------- *) Dacă se considera necesare mărirea concentraţiei de bacitracin la 300 ppm poate reduce contaminarea cu bacterii saprofite fără a reduce recuperarea de Ralstonia solanacearum. Se dizolva ingredientele în 70% etanol la concentraţiile date pentru volumul de mediu preparat. Unele ingrediente ca polimixina B şi cloramfenicolul necesita o uşoară încălzire şi agitare. Mediu nutritiv SMSA (Elphinstone et al., 1996). Se prepara ca şi pentru mediul selectiv SMSA., dar se elimina geloza. Se repartizează câte 3 ml în tuburi Universal de 30 ml, de unica folosinţa. Bibliografie recomandată pentru modul de efectuare a testelor, prevăzute în prezenta anexa. Buddenhagen, I.W.; Sequeira, L. and Kelman, A. 1962. Description of races în Pseudomonas solanacearum. Phytopathology 52, 726. Cook, D.; Elizabeth B. and Sequeira L., 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphism with DNA probes that specify virulence and hypersensitive respons. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 113-121. Dinesen I.G. and DeBoer, S.H. 1995. Extraction of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus from composite samples of potato tubers. American Potato Journal 72, 133-142. Elphinstone, J.G.; Hennessy, J.; Wilson, J. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of different methods for the detection of Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith în potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26. Engelbrecht, M.C. 1994. Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. ACIAR Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27, 265-277. Hayward, A.C. 1994. Systematic and phylogeny of Pseuedomonas solanacearum and related bacteria. În: Bacterial Wilt: the disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum (eds. A.C. Hayward and G.L. Hartman) CAB Internaţional Oxford, 127-135. Janse, J.D. 1988. A detection method for Pseudomonas solanacearum în symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. EPPO Bulletin 18, 343-351. Janse, J.D. 1991. Infra- and intraspecific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14, 335-345. Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity în Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 64, 293-695. Lelliot, R.A. and Stead, D.E., 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. (T.F. Preece ed.) Blackwell Scientific Publicationes, Oxford. 216 pp. Louws, F.J.; Fulbright, D.W.; Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR. fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85, 528-536. Lozano, J.C. and Sequeira, L., 1970. Differentiation of races of Pseudomonas solanacearum by a leaf infiltration technique. Phytopathology 60, 838. Mirza, M.S.; Rademalcer, J.W.L.; Janse, J.D. and Akkermans, A.D.L. 1993, Specific 16S ribosomal RNA targeted oligonucleotide probe against Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Canadian Journal of Microbiology 39, 1029-1034. Robinson-Smith, A.; Jones, P.; Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D., 1995. Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79. Seal, S.E.; Jackson, L.A.; Young, J.P.W. and Daniels, M.J., 1993. Differentiation of Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, P. picketti and the blood disease bacterium by parţial 16S rRNA. sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology 139, 1587-1594. Smith, J.J.; Offord, L.C.; Holderness, M. and Saddler, G.S., 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 în Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61, 4262-4268. Stead, D.E., 1992a. Techniques for detecting and identifying plant pathogenic bacteria. In: Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds. J.M. Duncan and L. Torrance). Blackwell Scientific Publications, Oxford, 76-111. Stead, D.E., 1992b. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty acid profiles. Internaţional Journal of Systematic Bacteriology 42, 281-295. Van Beuningen, A.; Derks, H. and Janse J.ID., 1995. Detection and identification of Clavibacter michiganensis sufosp. sepedonicus with special attention to fluorescent in-situ hybridisation (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Zuchtunegsforschung 2, 266-269. ANEXA III 1. Pentru fiecare apariţie suspectată, pentru care a fost identificat un rezultat pozitiv în testul sau testele de selecţie, în conformitate cu metoda corespunzătoare stabilită în anexa nr. II, pentru, materialul de plantare sau, în toate celelalte cazuri, orice alta metoda aprobată, şi pentru care este asteptata confirmarea sau infirmarea prin finalizarea respectivei metode, ar trebui să se păstreze şi să se conserve în mod corespunzător: - lotul sau o parte din acesta (din care au fost prelevate probele) în ambalajul original etichetat, ori de câte ori este posibil; - contraproba, ori de câte ori este posibil; - orice extract rămas şi material preparat suplimentar pentru testul sau testele de selecţie, de exemplu, lamele de imuno fluorescenta; şi - toată documentaţia corespunzătoare; pâna la finalizarea respectivei metode. 2. În cazul confirmării organismului, ar trebui să se păstreze şi să se conserve în condiţii corespunzătoare: - materialul prevăzut la art. 1 din ordin, şi - o proba de tomate sau vinete infectate prin inoculare cu extract din plante sau tuberculi, dacă este cazul; şi - cultura izolata a organismului, pâna cel puţin o luna după notificarea prevăzută la art. 10 şi 11 din ordin. ANEXA IV Elementele din investigaţia prevăzută la art. 9 alin. (2) lit. a) din ordin includ, acolo unde este cazul: (i) locurile de producţie: - în care se cultiva sau au fost cultivati cartofi care sunt înrudiţi prin clonare cu cartofii depistaţi ca fiind infectaţi cu acest organism; - în care se cultiva sau au fost cultivate tomate care sunt din aceeaşi sursa cu tomatele depistate ca fiind infectate cu acest organism; - în care se cultiva sau au fost cultivati cartofi sau tomate care au fost puse sub control, datorită apariţiei suspectate a organismului; - în care se cultiva sau au fost cultivati cartofi care sunt înrudiţi prin clonare cu cartofi care au fost cultivati în locurile de producţie depistate ca fiind infectate cu acest organism; - în care se cultiva cartofi sau tomate şi care sunt situate în vecinătatea unor locuri de producţie infectate, inclusiv acele locuri care partajeaza echipamente de producţie şi instalaţiile direct sau printr-un contractant comun; - care utilizează apa de suprafaţa pentru irigare sau stropire din orice sursa confirmată sau suspectată a fi infectata cu acest organism; - care utilizează apa de suprafaţa pentru irigare sau stropire dintr-o sursa folosită în comun cu locuri de producţie confirmate sau suspectate a fi infectate cu acest organism; - sunt sau au fost inundate cu apa de suprafaţa suspectată de a fi infectata cu acest organism sau a carei infecţie a fost confirmată; şi (ii) apa de suprafaţa utilizata la irigare sau stropire ori care a inundat unul sau mai multe câmpuri sau locuri de producţie confirmate ca fiind infectate cu acest organism. ANEXA V 1. Elementele care determina extinderea contaminării probabile în conformitate cu art. 9 alin. (2) lit. e) şi alin. (4) lit. c) din ordin includ, acolo unde este cazul: - materialul de plantare cultivat într-un loc de producţie desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu art. 9 alin (2) lit. b), c) şi d) din ordin; - locurile de producţie cu o producţie legată de materialului de plantare desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu art. 9 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin, inclusiv cele care partajeaza echipamente de producţie, şi instalaţiile în mod direct sau printr-un contractant comun; - materialul de plantare produs în locul sau locurile de producţie prevăzute în liniuta a doua sau care se afla în acest loc sau în aceste locuri de producţie în timpul perioadei în care materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu art. 9 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin, a fost prezent la locul de producţie prevăzut în prima liniuta; - manipularea materialului de plantare stocat, provenit din locurile de producţie menţionate; - orice utilaj, vehicul, vas, depozit sau unităţi ale acestora şi orice alte obiecte, inclusiv materialul de ambalare, care ar fi putut intra în contact cu materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu art. 9 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin; - oricare material de plantare depozitat sau în contact cu oricare dintre structurile sau obiectele enumerate în liniuta a cincea, înainte de curăţarea şi dezinfectarea acestor structuri sau obiecte; - ca rezultat al investigaţiei şi testării în conformitate cu art. 9 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin, în cazul cartofilor, acei tuberculi sau plante cu o înrudire clonală colaterală sau ascendenta, şi în cazul tomatelor, acele plante cu aceeaşi sursa ca materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu art. 9 alin. (2) lit. (b), c) şi d) din ordin şi pentru, care apare ca probabilă contaminarea printr-o legătura clonală, deşi rezultatele testării pot fi negative pentru organism; - locul sau locurile de producţie ale materialului de plantare prevăzute în liniuta a şaptea; - locul sau locurile de producţie ale materialului de plantare, care utilizează apa pentru irigare sau stropire, care a fost desemnată ca fiind contaminată în conformitate cu art. 9 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin; - materialul de plantare produs în câmpurile inundate cu apa de suprafaţa, confirmată ca fiind infectata cu acest organism. 2. Determinarea unei posibile raspândiri în conformitate cu art. 9 alin. (2) lit. f) şi alin. (4) lit. c) din ordin include: (i) în cazurile prevăzute în art. 9 alin. (2) lit. f), o luare în considerare a următoarelor elemente: - vecinătatea altor locuri de producţie ale materialului de plantare; - producţia şi utilizarea în comun a stocurilor de cartofi de samânta; - locurile de producţie care utilizează apa de suprafaţa pentru irigarea sau stropirea materialului de plantare, în cazurile în care exista sau a existat riscul de scurgere sau inundare cu apa de suprafaţa dintr-unul sau mai multe locuri de producţie desemnate ca fiind contaminate în conformitate cu art. 9 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin; (ii) în cazurile în care apa de suprafaţa a fost desemnată ca fiind contaminată în conformitate cu art. 9 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin: - locul sau locurile de producţie învecinate care produc materialul de plantare sau care sunt în pericol de a fi inundate cu apa de suprafaţa desemnată ca fiind contaminată; - orice bazin de irigare îngropat, care are legătura cu apa de suprafaţa desemnată ca fiind contaminată. 3. Detaliile notificării prevăzute la art. 10 din ordin includ: - data raportării apariţiei suspectate în conformitate cu art. 6, 7 şi 8 din ordin, şi datele de prelevare a probelor, precum şi confirmarea prezentei organismului în conformitate cu art. 9 din ordin, după caz; - o descriere a elementelor contaminării desemnate şi a zonei de demarcaţie. 4. Detaliile notificării suplimentare prevăzute la art. 11 din ordin includ: - pentru orice transport sau lot de cartofi desemnat ca fiind contaminat, certificatele fitosanitare prevăzute în art. 8 din Hotărârea Guvernului nr. 1030/2001, numărul paşaportului sau numărul de înregistrare al producătorilor de cartofi, depozitele colective şi centrele de expediere, după caz; - pentru orice transport sau lot de plante de tomate desemnat ca fiind contaminat, certificatele fitosanitare prevăzute în art. 8 din Hotărârea Guvernului nr. 1.030/2001 şi numărul paşaportului, în conformitate cu anexa nr. V partea A. secţiunea 1 pct. 2.2 din Hotărârea Guvernului nr. 1.030/2001; - denumirea soiului şi a categoriei pentru stocurile de cartofi de samânta şi, dacă este posibil, în toate celelalte cazuri; - alte asemenea informaţii legate de confirmarea apariţiei, cerute de Laboratorul Central de Carantina Fitosanitara şi Ministerul Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor. ANEXA VI 1. Prevederile art. 13 din ordin, se referă la: - incinerarea; - utilizarea ca furaje pentru animale, după tratament termic, astfel încât să nu existe riscul supravieţuirii organismului; - îngroparea profunda, într-un loc de eliminare, unde nu exista riscul infiltrarii în terenul agricol sau al contactului cu surse de apa care ar putea fi utilizate pentru irigarea terenului agricol; - prelucrarea industriala prin livrare directa şi imediata către o uzina de prelucrare cu instalaţii de eliminare a deşeurilor, aprobate în conformitate cu dispoziţiile prevăzute în anexa nr. VII la prezentul ordin; - alte măsuri, cu condiţia să se fi stabilit ca nu exista nici un risc identificabil de răspândire a organismului; aceste măsuri sunt notificate imediat Ministerului Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor. 2. Materialul de plantare prevăzut la art. 14 din ordin, va fi utilizat sau eliminat, sub controlul direcţiei fitosanitare pe raza căreia cartofii urmează să fie ambalaţi sau prelucraţi, cu aprobarea Ministerului Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor, astfel: (i) pentru tuberculi de cartofi: - utilizarea drept cartofi destinaţi consumului, ambalaţi în locuri cu instalaţii corespunzătoare de eliminare a deşeurilor, pregătiţi pentru livrare directa şi folosire fără reambalare, şi produşi pentru aceasta livrare directa şi folosire; - utilizarea drept cartofi de consum destinaţi procesării industriale şi produşi pentru livrare directa şi imediata către o fabrica de prelucrare cu instalaţii corespunzătoare de eliminare a deşeurilor; - alta utilizare sau eliminare, cu condiţia să se fi stabilit ca nu exista nici un risc identificabil de răspândire a organismului; (ii) pentru alte părţi de planta, inclusiv resturi de tulpina ori frunziş: - distrugerea; - alta utilizare ori eliminare, cu condiţia să se fi stabilit ca nu exista nici un risc identificabil de răspândire a organismului. 3. Metodele corespunzătoare de decontaminare a obiectelor prevăzute la art. 15 din ordin sunt curăţarea şi, dacă este cazul, dezinfectarea, astfel încât să nu existe nici un risc identificabil de răspândire a organismului. Aceste metode sunt aplicate sub controlul direcţiei fitosanitare. 4. Seria de măsuri ce urmează să fie puse în aplicare de direcţia fitosanitara în cadrul zonei sau zonelor demarcate stabilite în conformitate cu art. 9 alin. (2) lit. f) şi alin. (4) lit. c) şi prevăzute în art. 16 din ordin includ: 4.1. în cazurile în care locurile de producţie au fost desemnate ca fiind contaminate în conformitate cu art. 9 alin (2) lit. b), c) şi d) din ordin: a) într-un câmp sau o unitate de producţie de cultura protejata desemnată ca fiind contaminată în conformitate cu art. 9 alin (2) lit. b), c) şi d) din ordin: (i) în cursul a cel puţin 4 ani de cultura, următori contaminării desemnate, - sunt luate măsuri pentru eliminarea plantelor spontane de cartofi şi tomate, precum şi a altor plante - gazda ale organismului, inclusiv a buruienilor solanacee, şi: - nu se planteaza următoarele: ● tuberculi sau plante de cartof; ● plante sau seminţe de tomate; ● ţinând seama de biologia organismului: * alte plante - gazda; * plante din specia Brassica, pentru care exista un risc identificat de supravieţuire a organismului; ● culturi pentru care exista un risc identificat de răspândire a organismului; - în primul sezon de cultura a cartofilor sau tomatelor, urmând perioadei specificate la liniuta a doua şi cu condiţia ca acel câmp să fi fost declarat liber de plante spontane de cartof sau tomate şi alte plante - gazda, inclusiv buruieni solanacee, pentru cel puţin doi ani consecutivi de cultura, anteriori plantării: ● în cazul cartofilor, sunt plantati cartofii de samânta certificaţi oficial doar pentru producţia destinată consumului; ● se desfăşoară o inspecţie, inclusiv efectuarea de teste, în conformitate cu art. 2 din ordin, - în sezonul de cultura a cartofilor sau tomatelor care urmează celui prevăzut în liniuta a treia şi urmând un ciclu de rotaţie corespunzător, în cazul cartofilor, vor fi plantati cartofii de samânta certificaţi oficial pentru producerea cartofilor de samânta sau de consum, şi atât în cazul cartofilor, cât şi în cazul tomatelor se desfăşoară o inspecţie, asa cum se specifica în art. 2. din ordin; (ii) în cursul a 5 ani de cultura, următori contaminării desemnate: - sunt luate măsuri pentru eliminarea plantelor spontane de cartofi şi tomate, precum şi a altor plante - gazda ale organismului, inclusiv a buruienilor solanacee; şi - câmpul este stabilit şi menţinut în cursul primilor 3 ani întelenit, cultivat cu cereale în conformitate cu riscul identificat, ca păşune permanenta cu cosire la baza repetată, păşune intensiva sau cu iarba pentru producerea de seminţe, urmată de plantarea în următorii 2 ani cu plante care nu sunt gazde pentru organism pentru care nu exista un risc identificat de supravieţuire sau răspândire a organismului; - în primul sezon de cultura a cartofilor sau tomatelor urmând perioadei specificate la liniuta a doua: ● în cazul cartofilor, se planteaza cartofii de samânta certificaţi oficial atât pentru producţia de samânta, cât şi pentru consum; şi se desfăşoară o inspecţie oficială inclusiv efectuarea de teste, asa cum se specifica în art. 2 din ordin; b) pe alte câmpuri: - în anul de cultura următor contaminării desemnate: ● nu se planteaza tuberculi sau plante de cartofi, sau se planteaza alte plante - gazda ale organismului şi se iau măsuri de eliminare a plantelor spontane de cartofi şi tomate sau alte plante - gazda, inclusiv buruieni solanacee, dacă este cazul; ● în cazul tuberculilor de cartofi, cartofii de samânta certificaţi oficial pot fi plantati doar pentru producţia de cartofi de consum, cu condiţia să se fi eliminat orice risc al plantelor spontane de cartofi sau tomate şi al altor plante - gazda ale organismului, inclusiv buruieni solanacee. Recolta în creştere este inspectata în perioadele potrivite, iar plantele spontane de cartofi sunt testate pentru prezenta organismului; în plus, pentru cartofi sunt inspectaţi şi tuberculii recoltaţi; - în primul an de cultivare următor celui specificat la liniuta precedenta: ● în cazul cartofilor, se planteaza numai cartofii de samânta certificaţi oficial pentru producţia de cartof de samânta sau de consum; - pentru cel puţin al doilea an de cultivare urmând celui din prima liniuta: ● în cazul cartofilor, se planteaza numai cartofii de samânta certificaţi oficial sau cultivati sub control, proveniţi din cartofi de samânta certificaţi oficial, pentru producerea atât a cartofilor de samânta, cât şi de consum; - în fiecare dintre anii de cultura prevăzuţi în liniutele precedente, se iau măsuri pentru eliminarea plantelor spontane de cartofi sau de tomate şi a altor plante - gazda ale organismului, inclusiv buruieni solanacee, şi se desfăşoară o inspecţie oficială asa cum se specifica în art. 2 din ordin, iar în cazul în care sunt plantati cartofi de samânta pentru producţia de samânta, se efectuează testarea acestora; c) imediat după desemnarea contaminării în conformitate cu art. 9 alin (2) lit. b), c) şi d) din ordin şi în fiecare dintre anii de cultura următori pâna la inclusiv primul sezon permis pentru cultura cartofilor şi tomatelor pe câmpul sau câmpurile desemnate ca fiind contaminate, după cum se detaliază la lit. a): - toate utilajele şi instalaţiile de depozitare de la locul de producţie şi implicate în producerea cartofilor şi tomatelor sunt curăţate şi, dacă este cazul, dezinfectate utilizând metode adecvate, după cum se specifica la pct. 3; - sunt introduse controale ale programelor de irigare şi stropire, inclusiv o interzicere a acestora, în scopul prevenirii răspândirii organismului; d) într-o unitate de producţie de cultura protejata desemnată ca fiind contaminată, în conformitate cu art. 9 alin (2) lit. b), c) şi d) din ordin, unde este posibila înlocuirea completa a mediului de cultivare: - nu se planteaza tuberculi sau plante de cartof sau alte plante - gazda ale organismului, inclusiv plante şi seminţe de tomate, cu excepţia cazului în care respectiva unitate a fost supusă măsurilor de eliminare a organismului şi de îndepărtare a întregului material vegetal - gazda, inclusiv, cel puţin o schimbare completa a mediului de cultura, precum şi o curăţare şi, dacă este cazul, dezinfectarea respectivei unităţi şi a întregului echipament, şi în care a fost acordată ulterior aprobarea pentru producerea de cartofi sau de tomate din partea Ministerului Agriculturii Alimentaţiei şi Pădurilor; - pentru producerea de cartofi, aceştia provin din cartofii de samânta certificaţi oficial sau din minituberculi sau microplante derivate din surse testate; - sunt introduse controale asupra programelor de irigare şi stropire, inclusiv o interzicere a acestora, dacă este cazul, în scopul prevenirii răspândirii organismului. 4.2 În cadrul zonei demarcate, fără a prejudicia măsurile detaliate la pct. 4.1: a) imediat după contaminarea desemnată şi pentru cel puţin 3 ani de cultura: aa) în cazurile în care zona demarcata a fost determinata în conformitate cu art. 9 alin (2) lit. f) din ordin: - se asigura supravegherea de către direcţiile fitosanitare, a locurilor de cultivare, depozitare sau de manipulare a tuberculilor de cartofi sau a tomatelor, împreuna cu locurile în care funcţionează utilajele pentru prelucrarea cartofilor sau a tomatelor; - se solicita curăţarea şi, dacă este cazul, dezinfectarea utilajelor şi a depozitelor din aceste locuri, utilizându-se metodele corespunzătoare specificate la pct. 3; - se solicita plantarea doar a seminţelor certificate sau a seminţelor cultivate sub control pentru toate culturile de cartofi din acea zona şi testarea după recoltare a cartofilor de samânta, cultivati în locuri de producţie determinate ca fiind probabil contaminate în conformitate cu art. 9 alin. (2) lit. e) din ordin; - se solicita manipularea separată a stocurilor de cartofi de samânta; recoltaţi fata de cele destinate consumului în toate locurile din zona respectiva; - desfăşoară o inspecţie în conformitate cu art. 2 din ordin. ab) în cazurile în care apa de suprafaţa a fost desemnată ca fiind contaminată în conformitate cu art. 9 alin. (4) lit. b) din ordin sau inclusă printre elementele de răspândire posibila a organismului în conformitate cu anexa nr. V pct. 2 - se desfăşoară o inspecţie anuala în perioade adecvate, inclusiv prelevarea de probe din apa de suprafaţa şi de plante gazda solanacee corespunzătoare, prelevate din sursele corespunzătoare de apa şi testarea în conformitate cu: ● metoda corespunzătoare stabilită în anexa nr. II, pentru materialul de plantare; sau ● orice alta metoda aprobată, în celelalte cazuri; - se introduc controale asupra programelor de irigare şi stropire, inclusiv o interzicere a utilizării apei, desemnate ca fiind contaminată, pentru irigarea şi stropirea materialului de plantare şi, dacă este cazul, a altor plante gazda, în scopul prevenirii răspândirii organismului. Aceasta interdicţie poate fi revizuită pe baza rezultatelor obţinute la inspecţia anuala; - în cazurile în care deşeurile lichide deversate sunt contaminate, se introduc controale asupra deşeurilor eliminate din procesările industriale sau provenite din locurile de ambalare ale materialului de plantare; b) se instituie un program, dacă este cazul, de înlocuire a tuturor stocurilor de cartofi de samânta într-o perioada corespunzătoare. ANEXA VII Instalaţiile de eliminare a deşeurilor, la care se face referire în anexa nr. VI pct. 1 a patra liniuta, sunt în conformitate cu următoarele dispoziţii, astfel încât să se prevină riscul de răspândire a organismului: (i) deşeurile provenite din procesarea cartofilor şi tomatelor (inclusiv cartofii, cojile de cartofi şi tomatele eliminate) şi orice alte deşeuri solide asociate cu cartofii şi tomatele trebuie: - îngropate la adâncime, la locul de eliminare, astfel încât să nu existe risc de infiltrare în terenul agricol sau de contact cu surse de apa care ar putea fi utilizate pentru irigarea, terenului agricol. Deşeurile sunt transportate direct în locurile special amenajate, astfel încât să nu existe riscul răspândirii acestor deşeuri; sau - incinerate. (ii) deşeurile lichide rezultate din procesări: înaintea eliminării deşeurile lichide ce conţin particule solide în suspensie sunt supuse filtrării sau decantarii pentru îndepărtarea acestor particule solide. Aceste particule solide sunt eliminate în conformitate cu metodele stabilite la pct. (i) de mai sus. Deşeurile lichide vor fi: - încălzite la minimum 70°C timp de cel puţin 30 de minute înainte de eliminare; sau - eliminate în alt mod, aprobat de Ministerul Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor şi sub controlul direcţiei fitosanitare, astfel încât să nu existe riscul ca deşeurile să între în contact cu terenul agricol sau cu sursele de apa care ar putea fi folosite pentru irigarea terenului agricol. ------- 
