Comunica experienta
MonitorulJuridic.ro
În temeiul prevederilor art. 5 din Ordonanţa Guvernului nr. 136/2000 privind mãsurile de protecţie împotriva introducerii şi rãspândirii organismelor de carantinã dãunãtoare plantelor sau produselor vegetale în România, cu modificãrile şi completãrile ulterioare, în temeiul Hotãrârii Guvernului nr. 385/2007 privind organizarea şi funcţionarea Ministerului Agriculturii şi Dezvoltãrii Rurale, vãzând Referatul de aprobare nr. 292.399 din 18 mai 2007 al Agenţiei Naţionale Fitosanitare din cadrul Ministerului Agriculturii şi Dezvoltãrii Rurale, ministrul agriculturii şi dezvoltãrii rurale emite prezentul ordin. ART. I Ordinul ministrului agriculturii, pãdurilor şi dezvoltãrii rurale nr. 912/2004 privind controlul putregaiului inelar al cartofului, produs de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 127 şi 127 bis din 9 februarie 2005, se modificã şi se completeazã dupã cum urmeazã: 1. Anexele nr. I-IV se modificã şi se înlocuiesc cu anexele nr. I-IV*) care fac parte integrantã din prezentul ordin. 2. Dupã anexa nr. IV se introduce o nouã anexã, anexa nr. V*), care face parte integrantã din prezentul ordin.---- *) Anexele se publicã ulterior în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 417 bis în afara abonamentului, care se poate achiziţiona de la Centrul pentru relaţii cu publicul al Regiei Autonome "Monitorul Oficial", Bucureşti, şos. Panduri nr. 1. ART. II Prezentul ordin va fi publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I. ART. III Prezentul ordin transpune prevederile Directivei Consiliului 2006/56/CEE din 12 iunie 2006, care amendeazã anexele Directivei Consiliului 93/85/CEE privind controlul putregaiului inelar al cartofului. Ministrul agriculturii şi dezvoltãrii rurale, Decebal Traian Remeş Bucureşti, 21 mai 2007. Nr. 387. ANEXA I PROTOCOL de testare în vederea diagnosticãrii, detectãrii şi identificãrii agentului responsabil de putregaiul inelar al cartofului, Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann şi Kotthoff) Davis et al. DOMENIU DE APLICARE AL PROTOCOLULUI DE TESTARE Protocolul prezentat în continuare descrie diferitele etape ce trebuie urmate pentru: (i) diagnosticarea putregaiului inelar al cartofului în tuberculi şi plante de cartof; (ii) detectarea bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus pe probe de tuberculi şi plante de cartof; (iii) identificarea bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus PRINCIPII GENERALE Protocoalele optimizate pentru diversele metode, reactivii validaţi şi modalitãţile de preparare a materialului necesar pentru teste şi pentru controale figureazã în apendicii din prezenta anexã. În apendicele 1 din prezenta anexã se furnizeazã o listã a laboratoarelor incluse pentru optimizarea şi validarea protocoalelor. Deoarece protocoalele implicã detectarea unui organism dãunãtor de carantinã şi includ utilizarea culturilor viabile de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus ca materiale de control, este necesar ca procedurile sã se desfãşoare în condiţii adecvate de carantinã, cu instalaţii corespunzãtoare de eliminare a deşeurilor şi cu respectarea cerinţelor referitoare la licenţele corespunzãtoare emise de autoritãţile oficiale responsabile pentru carantinã. Parametrii testelor trebuie sã garanteze o detectare coerentã şi reproductibilã a nivelurilor de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus la pragurile stabilite pentru metodele selecţionate. Este necesarã pregãtirea exactã a martorilor pozitivi. Realizarea testelor în funcţie de pragurile cerute implicã, de asemenea, stabilirea parametrilor corecţi, întreţinerea şi calibrarea echipamentelor, manevrarea şi conservarea atentã a reactivilor şi toate mãsurile care vizeazã împiedicarea contaminãrii între probe, de exemplu, separarea martorilor pozitivi de probele de testat. Trebuie aplicate norme de control al calitãţii pentru a evita apariţia oricãrei greşeli, în special de ordin administrativ, în etichetare şi în documentaţie. Apariţia suspectatã a unui focar, conform art. 4 alin. (2), implicã o reacţie pozitivã la testele de diagnostic sau de depistare efectuate pe o probã, dupã cum se indicã în diagrame. În cazul în care primul test de depistare [testul de imunofluorescenţã (IF) sau testul reacţiei de polimerizare în lanţ (PCR)/testul de hibridizare fluorescentã in situ (FISH)] este pozitiv, existã o suspiciune de contaminare cu Clavibacter michiganensis. ssp. sepedonicus şi trebuie efectuat un al doilea test de depistare. În cazul în care şi al doilea test de depistare este pozitiv, suspiciunea este confirmatã (apariţie suspectatã) şi testele trebuie continuate în conformitate cu protocolul. În cazul în care al doilea test de depistare este negativ, proba este consideratã necontaminatã cu Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Reacţia pozitivã la testul IF, prevãzutã la art. 4 alin. (2) din ordin, este aşadar definitã ca o reacţie pozitivã la testul IF, confirmatã de un al doilea test de depistare (PCR/FISH). Prezenţa confirmatã, prevãzutã la art. 5 alin. (1) din ordin, implicã izolarea şi identificarea unei culturi pure de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, cu confirmarea patogenitãţii. 1. PREZENTAREA DIAGRAMEI FUNCŢIONALE 1.1. Protocol de detectare în vederea diagnosticãrii putregaiului inelar al cartofului în tuberculi şi plante de cartof care prezintã simptome ale bolii (vezi diagrama 1) Procedura de testare vizeazã tuberculii şi plantele de cartof care prezintã simptome caracteristice veştejirii bacteriene sau care prezintã suspiciunea prezenţei bolii respective. Procedura prevede un test rapid de depistare, izolarea organismului patogen plecând de la ţesutul vascular infectat pe medii de diagnostic şi, în cazul unui rezultat pozitiv, identificarea culturii ca fiind Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. DIAGRAMA 1 NOTĂ(CTCE) Diagrama 1 se gãseşte în Monitorul Oficial al României, Partea I, Nr. 417 bis, din data de 22 iunie 2007, la pagina 3.----- *1) Descrierea simptomelor figureazã la pct. 2. *2) Testele adecvate sunt: - testul IF (pct. 4); - testul PCR (pct. 6); - testul FISH (pct 5). *3) Deşi izolarea prin diluţie şi însãmânţare pe medii de culturã a agentului patogen provenit din materialul vegetal care prezintã simptome caracteristice este o sarcinã simplã, însãmânţarea pe mediul de culturã poate sã dea rezultate eronate în stadiile avansate de infecţie. Bacteriile saprofite care se dezvoltã pe un ţesut bolnav pot sã se multiplice mult mai repede decât agentul patogen sau sã îi inhibe creşterea pe mediul de izolare. Aşadar, se recomandã sã se utilizeze în acelaşi timp medii neselective şi selective, de preferinţã de tip MTNA (pct. 8) sau sã se recurgã la testul biologic (pct. 7). *4) Profilul morfologic al unei colonii caracteristice este prezentat la pct. 8. *5) Atunci când testul de izolare este negativ, în ciuda existenţei simptomelor caracteristice ale bolii, trebuie repetatã izolarea. *6) Se poate identifica în mod sigur o culturã purã de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, utilizând testele enumerate la pct. 9. *7) Testul de patogenitate este descris la pct. 10. 1.2.1. Protocol de detectare şi de identificare a bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus pe probe de tuberculi de cartof fãrã simptome (vezi diagrama 2) Principiu Procedura de testare vizeazã detectarea infecţiilor latente ale tuberculilor de cartof. Orice rezultat pozitiv la cel puţin douã teste de depistare, bazate pe principii biologice diferite, trebuie completat cu izolarea organismului patogen, urmatã, în caz de izolare a coloniilor caracteristice, de confirmarea unei culturi pure ca fiind Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Rezultatul pozitiv al unui singur test de depistare nu este suficient pentru ca proba sã fie consideratã suspectã. Testele de depistare şi testele de izolare trebuie sã permitã praguri de detectare cuprinse între 10^3 şi 10^4 celule/mL în depozitul resuspendat, inclusiv în martorii pozitivi din fiecare serie de teste. DIAGRAMA 2 NOTĂ(CTCE) Diagrama 2 se gãseşte în Monitorul Oficial al României, Partea I, Nr. 417 bis, din data de 22 iunie 2007, la pagina 4.----- *1) Dimensiunea probei standard este de 200 de tuberculi, deşi procedura poate fi aplicatã şi unor probe mai mici, în cazul în care nu se dispune de 200 de tuberculi. *2) Extracţia organismului patogen şi metodele de concentrare sunt descrise la pct. 3.1. *3) În cazul în care cel puţin douã teste bazate pe principii biologice diferite sunt pozitive, trebuie sã se efectueze izolarea şi confirmarea. Se va realiza cel puţin un test de depistare. În cazul în care testul respectiv este negativ, proba se considerã negativã. În cazul în care testul este pozitiv, trebuie sã se efectueze cel puţin un al doilea test de depistare, bazat pe principii biologice diferite, pentru a verifica primul rezultat pozitiv. În cazul în care al doilea test sau urmãtoarele sunt negative, proba este consideratã negativã. În acest caz nu este necesarã efectuarea altor teste. *4) Testul IF Se utilizeazã întotdeauna un anticorp policlonal pentru testele IF. Se poate obţine o specificitate mai mare (vezi pct. 4), asociind anticorpului menţionat anticorpi monoclonali suplimentari. *5) Testul PCR. Se utilizeazã reactivi şi protocoale PCR validate în mod corespunzãtor (vezi pct. 6). *6) Testul FISH. Se utilizeazã reactivi şi protocoale validate (vezi pct. 5). *7) Izolare selectivã Asociatã cu utilizarea unui mediu MTNA sau NCP-88 şi a unei diluãri la 1/100 din sediment resuspendat, izolarea selectivã constituie, în numeroase cazuri, o metodã bunã de izolare directã a bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Coloniile caracteristice se pot obţine într-o perioadã de 3 pânã la 10 zile de la însãmânţare. Atunci este posibil sã se efectueze purificarea şi identificarea agentului patogen. Pentru a profita din plin de posibilitãţile oferite de testul în cauzã, trebuie sã se pregãteascã cu grijã conurile de cartof prelevate de la nivelul hilului pentru a evita contaminarea cu bacterii secundare legate de tubercul, care constituie organisme concurente ale bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus pe mediul de culturã şi sunt susceptibile de a înlocui agentul patogen menţionat. În cazul obţinerii unui rezultat eronat la testul de însãmânţare, izolarea trebuie efectuatã din plantele utilizate pentru testul biologic (vezi pct. 8). *8) Testul biologic este utilizat pentru izolarea bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus din extractele de cartof, prin îmbogãţire selectivã în plante de vinete (Solanum melongena). Sunt necesare condiţii optime de incubare, în conformitate cu specificaţiile procedurii în cauzã. Bacteriile care au efect inhibitor asupra bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus în prezenţa unui mediu MTNA sau NCP-88 nu riscã sã afecteze desfãşurarea testului menţionat (vezi pct. 7). *9) Profilul morfologic al unei colonii caracteristice este prezentat la pct 8. *10) Însãmânţarea pe mediul de culturã sau testele biologice pot fi eronate din cauza concurenţei sau a efectului inhibitor al bacteriilor saprofite. În cazul în care testele de depistare dau rezultate pozitive, dar testele de izolare sunt negative, trebuie repetate testele de izolare din acelaşi sediment sau cu ajutorul unor noi ţesuturi vasculare prelevate din apropierea hilului de pe tuberculi tãiaţi provenind din aceeaşi probã şi, dupã caz, trebuie testate probe suplimentare. *11) Se pot identifica în mod sigur culturi pure de izolaţi presupuşi de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, utilizând testele enumerate la pct. 9. *12) Testul patogenitãţii este descris la pct. 10. 1.3. Protocol de detectare şi de identificare a bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus pe probe de plante de cartof fãrã simptome (vezi diagrama 3) DIAGRAMA 3 NOTĂ(CTCE) Diagrama 3 se gãseşte în Monitorul Oficial al României, Partea I, Nr. 417 bis, din data de 22 iunie 2007, la pagina 6.------ *1) Vezi pct. 3.2 pentru dimensiunea recomandatã a probelor. *2) Extracţia organismului patogen şi metodele de concentrare sunt descrise la pct. 3.2. *3) În cazul în care cel puţin douã teste bazate pe principii biologice diferite sunt pozitive, trebuie efectuate izolarea şi confirmarea. Se realizeazã cel puţin un test de depistare. În cazul în care testul respectiv este negativ, proba se considerã negativã. În cazul în care testul este pozitiv, trebuie sã se efectueze cel puţin un al doilea test de depistare, bazat pe principii biologice diferite, pentru a verifica primul rezultat pozitiv. În cazul în care al doilea test sau urmãtoarele sunt negative, proba este consideratã negativã. În acest caz nu este necesarã efectuarea altor teste. *4) Testul de izolare selectivã şi profilul morfologic al unei colonii caracteristice sunt prezentate la pct. 8. *5) Testul IF este descris la pct 4. *6) Testele PCR sunt descrise la pct. 6. *7) Testul FISH este descris la pct. 5. *8) Testul biologic este descris la pct. 7. *9) Izolarea pe mediu de culturã sau testele biologice pot fi eronate din cauza concurenţei sau a efectului inhibitor al bacteriilor saprofite. În cazul în care testele de depistare dau rezultate pozitive, dar testele de izolare sunt negative, trebuie repetate testele de izolare şi, dacã este cazul, trebuie testate probe suplimentare. *10) Se pot identifica în mod sigur culturi pure de izolaţi presupuşi de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, utilizându-se testele enumerate la pct. 9. *11) Testul de patogenitate este descris la pct. 10. 2. EXAMINAREA VIZUALĂ A SIMPTOMELOR PUTREGAIULUI INELAR AL CARTOFULUI 2.1. Plante de cartof În contextul climatic european se întâmplã rareori ca simptomele sã fie observate pe teren, iar atunci când este cazul, acest lucru se întâmplã numai la sfârşitul sezonului. Adesea simptomele pot fi mascate de cele ale altor boli, de vãtãmãri mecanice sau îmbãtrânire ori pot fi confundate cu acestea. Aşadar, simptomele pot trece cu uşurinţã neobservate în momentul inspecţiei pe teren. Simptomele veştejirii sunt foarte diferite de cele ce caracterizeazã putregaiul inelar al cartofului. În general, primul simptom progreseazã într-adevãr lent şi se limiteazã iniţial la marginea frunzelor. În cazul celui de-al doilea, frunzele tinere infectate continuã sã creascã, într-o manierã mai puţin obişnuitã, ceea ce dã frunzelor un aspect neregulat. Frunzele plantelor atinse de obstrucţia ţesuturilor vasculare situate mai jos pe tulpinã prezintã adesea între nervuri pete clorotice de culoare galbenã sau portocalie. Se întâmplã ca frunzuliţele, frunzele şi chiar tulpinile infectate sã moarã. Deseori, frunzele şi tuberculii se micşoreazã. Ocazional se constatã o atrofiere a plantelor. Ilustraţii colorate ale unor simptome se pot gãsi la adresa: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main. 2.2. Tuberculi de cartof Primele simptome apar mai ales în apropierea hilului şi dau un aspect uşor sticlos sau translucid ţesutului, fãrã înmuiere în jurul sistemului vascular. Inelul vascular poate prezenta, la nivelul hilului, o culoare mai închisã decât de obicei. Primul simptom, uşor de identificat, este o îngãlbenire a inelului vascular, ceea ce conduce la eliminarea din vase a unui exudat cu aspect cremos la presarea uşoarã a tuberculului. Exudatul respectiv conţine milioane de bacterii. Poate apãrea o brunificare a ţesutului vascular şi în acest stadiu simptomele tuberculului sunt asemãnãtoare cu cele ale veştejirii bacteriene produse de bacteria Ralstonia solanacearum. Într-o primã fazã, simptomele pot sã se limiteze la o porţiune a inelului care nu este neapãrat situatã în apropierea hilului, dar ulterior aceste simptome vor cuprinde treptat întreg inelul. Pe mãsurã ce infecţia progreseazã, ţesuturile vasculare sunt distruse, iar cortexul exterior se poate separa de cortexul interior. În stadiile avansate ale infecţiei, la suprafaţa tuberculului apar fisuri cu marginile adesea colorate în roşu brun. În multe cazuri observate recent în Europa se constatã o putrezire simultanã a cortexului central şi a inelului vascular, care antreneazã o infecţie secundarã cu apariţia de cavitaţi interne şi necrozã. O infecţie fungicã sau bacterianã secundarã poate masca simptomele şi poate fi dificil şi chiar imposibil sã se distingã simptomele avansate ale putregaiului inelar al cartofului de simptomele altor putregaiuri ale tuberculilor. Nu trebuie excluse nici formele fãrã simptome. Ilustraţii colorate ale unor simptome se pot gãsi la adresa: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main. 3. PREPARAREA PROBEI 3.1. Tuberculi de cartof NOTĂ: - Dimensiunea probei standard este de 200 de tuberculi per test. Prelevarea mai multor probe implicã un numãr mai mare de teste. Un numãr mai mare de tuberculi în probã va cauza inhibiţie sau o interpretare dificilã a rezultatelor. În cazul în care nu se dispune de un numãr atât de mare de tuberculi, procedura poate fi aplicatã fãrã dificultate pe probe mai mici de 200 de tuberculi. - Validarea tuturor metodelor de detectare descrise în continuare se bazeazã pe teste realizate pe probe de 200 de tuberculi. - Extractul de cartof descris în continuare mai poate fi utilizat şi pentru a detecta prezenţa bacteriei responsabile de veştejirea bacterianã a cartofului, Ralstonia solanacearum. Tratarea probei - etapa facultativã: Se spalã tuberculii. Între probe se aplicã substanţe dezinfectante (compuşi cloruraţi pentru eliminarea ADN-ului patogen, atunci când trebuie utilizat testul PCR) şi detergenţi corespunzãtori. Se usucã tuberculii cu aer. Procedura de spãlare menţionatã este utilã (dar nu este neapãrat obligatorie) în special pentru probele care conţin sol în exces şi în cazul în care trebuie efectuat un test PCR sau o procedurã de izolare directã. 3.1.1. Cu ajutorul unui bisturiu sau al unui cuţit pentru legume, curat şi dezinfectat, se cojeşte fiecare tubercul la nivelul hilului pânã la apariţia ţesutului vascular. Se decupeazã cu atenţie un mic con de ţesut vascular la nivelul hilului, avându-se grijã sã se preleve cât mai puţin ţesut nevascular posibil (vezi site-ul web accesibil la adresa: http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main). NOTĂ: Dacã este cazul, tuberculii care prezintã simptome suspecte de putregai inelar se testeazã separat. În cazul în care se observã simptome suspecte de putregai inelar în momentul prelevãrii conului de la nivelul hilului, trebuie sã se efectueze o examinare vizualã a tuberculului, dupã ce a fost tãiat în apropierea hilului. Orice tubercul tãiat care prezintã simptome suspecte trebuie suberificat timp de douã zile la temperatura mediului ambiant, apoi pãstrat în condiţii de carantinã (la o temperaturã cuprinsã între 4 şi 10°C) pânã la efectuarea tuturor testelor. Toţi tuberculii din probã (inclusiv cei care prezintã simptome suspecte) trebuie pãstraţi în conformitate cu prevederile din anexa nr. II. 3.1.2. Se prelevã conurile în recipiente noi, de unicã folosinţã, care sã se poatã închide şi/sau sigila (în cazul recipientelor refolosite, acestea se vor curãţa şi dezinfecta integral cu ajutorul compuşilor cloruraţi). Este preferabil ca tratarea conurilor sã se efectueze imediat. În caz contrar, conurile se depoziteazã în recipient, fãrã a se adãuga tampon, şi fie se refrigereazã pentru o perioadã mai micã de 72 de ore, fie se conservã la temperatura mediului ambiant pentru o perioadã mai scurtã de 24 de ore. Uscarea şi suberificarea, precum şi dezvoltarea saprofiţilor în momentul depozitãrii conurilor pot împiedica detectarea agentului responsabil de putregaiul inelar. 3.1.3. Conurile se trateazã în conformitate cu una dintre urmãtoarele proceduri: a) se acoperã conurile cu un volum suficient de tampon de extracţie (aproximativ 40 mL; vezi apendicele 3) şi se aşazã pe un agitator rotativ (50 şi 100 ture/minut) timp de 4 ore, la o temperaturã mai micã de 24°C, sau timp de 16-24 de ore, în cazul în care sunt refrigeraţi; sau b) se omogenizeazã conurile cu o cantitate suficientã de tampon de extracţie (aproximativ 40 mL; vezi apendicele 3) fie într-un mixer (de exemplu, Waring sau Ultra Thurax), fie zdrobindu-le cu un ciocan din cauciuc sau cu un alt dispozitiv de zdrobire potrivit (de exemplu, Homex), într-o pungã de macerare de unicã folosinţã, sigilatã (de exemplu, de tip Stomacher sau "Bioreba strong guage polythene" de 150 mm x 250 mm, sterilizatã cu radiaţii ionizante). NOTĂ: Existã un risc ridicat de contaminãri încrucişate ale probelor atunci când acestea sunt omogenizate folosindu-se un mixer. Se vor lua mãsuri de precauţie pentru a se evita orice vaporizare sau vãrsare în timpul procesului de extracţie. Se va asigura folosirea unor lame de mixer şi a unor vase proaspãt sterilizate pentru fiecare probã. În cazul folosirii testului PCR, se va evita orice transport de ADN în recipientele sau în aparatele de zdrobire. În cazul în care se recurge la testul PCR, se recomandã zdrobirea în pungi de unicã folosinţã şi utilizarea tuburilor de unicã folosinţã. 3.1.4. Se decanteazã supernatantul. În cazul în care lichidul este prea tulbure, se limpezeşte prin centrifugare la vitezã redusã (la maximum 180 g timp de 10 minute, la o temperaturã de 4-10°C) sau prin filtrare în vid (40-100 æm), spãlându-se suplimentar filtrul cu 10 mL tampon de extracţie (vezi apendicele 3). 3.1.5. Se concentreazã fracţiunea bacterianã prin centrifugare la viteza de 7.000 g timp de 15 minute (sau de 10.000 g timp de 10 minute), la o temperaturã cuprinsã între 4 şi 10°C, apoi se eliminã supernatantul, fãrã a agita depozitul. 3.1.6. Se resuspendã depozitul în 1,5 mL tampon de sedimentare (vezi apendicele 3). Se utilizeazã 500 æL pentru testele de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, 500 æL pentru testele de Ralstonia solanacearum şi 500 æL ca alicot de referinţã. La cei 500 æL alicot de referinţã se adaugã glicerol steril 10-25% (în volum). Alicotul rãmas se agitã prin vortexare şi se depoziteazã la o temperaturã cuprinsã între -16 si -24°C (sãptãmâni) sau între -68 şi -86°C (luni). În timpul testelor, alicoţii se pãstreazã la o temperaturã cuprinsã între 4-10°C. Nu sunt recomandate congelãrile şi decongelãrile repetate. În cazul în care extractul trebuie transportat, se va pãstra într-o ladã frigorificã pentru o perioadã de 24-48 de ore. 3.1.7. Pentru a evita contaminarea, este necesar ca toţi martorii pozitivi şi toate probele de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus sã fie tratate separat, atât pentru testele de IF, cât şi pentru toate celelalte teste. 3.2. Plante de cartof NOTĂ: Pentru a detecta populaţiile latente de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus este recomandabil sã se testeze probe mixte. Procedura poate fi aplicatã cu uşurinţã pentru probele mixte care conţin pânã la 200 pãrţi de tulpini. (Atunci când se efectueazã anchete, anchetele respective trebuie sã se bazeze pe o probã reprezentativã din punct de vedere statistic a populaţiei vegetale examinate.) 3.2.1. Cu ajutorul unui cuţit sau al unei foarfeci de grãdinã, curate şi dezinfectate, se taie un segment de unu-doi centimetri de la baza fiecãrei tulpini, chiar deasupra solului. Fragmentele de tulpini se dezinfecteazã rapid cu etanol 70% şi se usucã imediat cu hârtie de filtru. Se colecteazã fragmentele de tulpini într-un recipient steril închis, respectându-se procedura de prelevare expusã în continuare. 3.2.2. Fragmentele de tulpini se trateazã urmându-se una dintre urmãtoarele proceduri: a) se acoperã fragmentele de tulpinã cu un volum suficient de tampon de extracţie (aproximativ 40 mL; vezi apendicele 3) şi se aşazã pe un agitator rotativ (între 50 şi 100 ture/minut) timp de 4 ore, la o temperaturã mai micã de 24°C, sau timp de 16-24 de ore, în cazul în care sunt refrigerate; sau b) fragmentele se zdrobesc imediat într-o pungã de macerare rezistentã (de exemplu, Stomacher sau Bioreba), cu o cantitate adecvatã de tampon de extracţie (vezi apendicele 3), folosindu-se un ciocan de cauciuc sau un alt dispozitiv de zdrobire corespunzãtor (de exemplu, Homex). În caz contrar, fragmentele trebuie sã fie pãstrate la frigider maximum 72 de ore sau la temperatura mediului ambiant maximum 24 de ore. 3.2.3. Dupã o sedimentare de 15 minute, se decanteazã supernatantul. 3.2.4. De obicei, nu este necesar sã se efectueze o nouã limpezire a extractului sau a concentraţiei fracţiunii bacteriene; cu toate acestea, limpezirea se poate efectua prin filtrare şi/sau centrifugare, în conformitate cu metoda descrisã la pct. 3.1.4-3.1.6. 3.2.5. Se separã extractul de probã pur/concentrat în douã pãrţi egale. Una dintre pãrţi se pãstreazã pe toatã durata testului la o temperaturã de 4-10°C, iar cealaltã se depoziteazã la o temperaturã cuprinsã între -16 şi -24°C (sãptãmâni) sau între -68 şi -86°C (luni), dupã ce s-a adãugat în prealabil o cantitate de glicerol steril 10-25% (în volum), pentru cazurile în care va fi necesarã efectuarea unor testãri suplimentare. 4. TESTUL DE IMUNOFLUORESCENŢĂ (IF) Principiu Ţinându-se seama de capacitatea sa recunoscutã de a atinge cerinţele solicitate, se recomandã utilizarea testului IF ca principal test de depistare. În cazul în care testul IF este utilizat ca principal test de depistare şi rezultatul sãu este unul pozitiv, trebuie sã se efectueze un test PCR sau FISH ca test secundar. În cazul în care testul IF este folosit ca test secundar, iar rezultatul sãu este pozitiv, analiza trebuie completatã cu teste suplimentare, în conformitate cu indicaţiile din diagrama funcţionalã. NOTĂ: Atunci când testul IF se utilizeazã ca principal test de depistare, se folosesc întotdeauna anticorpi policlonali. Atunci când testul IF efectuat cu anticorpi policlonali dã un rezultat pozitiv, se efectueazã un test suplimentar cu anticorpi monoclonali, test ce are o specificitate mai mare şi o sensibilitate mai micã. Trebuie sã se foloseascã anticorpii unei tulpini de referinţã a bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Se recomandã sã se determine titrul pentru fiecare nou lot de anticorpi. Titrul se defineşte ca fiind cea mai înaltã diluţie la care se obţine o reacţie optimã, atunci când se testeazã o suspensie care conţine între 10^5 şi 10^6 celule per mL a unei tulpini omoloage de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, folosindu-se un conjugat adecvat de izotiocianat de fluoresceinã (FITC), în conformitate cu recomandãrile producãtorului. Soluţia brutã de anticorpi policlonali sau monoclonali trebuie sã aibã un titru IF de cel puţin 1:2.000. În momentul efectuãrii testului, diluţia/diluţiile de lucru a/ale anticorpilor trebuie sã fie aproximativ egalã/egale cu titrul. Se folosesc anticorpi validaţi (vezi site-ul web la adresa: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Testul trebuie efectuat pe extracte de probã proaspãt preparate. Dacã este cazul, acesta poate fi efectuat cu succes şi pe extracte conservate cu glicerol, la o temperaturã cuprinsã între -68 şi -86°C. Glicerolul poate fi separat de probã prin adãugarea unui mL de tampon de sedimentare (vezi apendicele 3), urmat de recentrifugare timp de 15 minute la 7.000 g şi resuspendare în acelaşi volum de tampon de sedimentare. Acest lucru este rareori necesar, în special atunci când proba este fixatã pe lamã prin flambare (vezi pct. 2.2). Se pregãtesc lame-martor pozitive distincte, utilizându-se tulpini omoloage sau oricare altã tulpinã de referinţã a bacteriei Clavibacter michiganensius ssp. sepedonicus, obtinute dintr-o suspensie de extract de cartof, aşa cum se specificã în apendicele 2 şi, opţional, într-un tampon. Acolo unde este posibil, ar trebui sã se utilizeze pe aceeaşi lamã un martor provenit din ţesut infectat în mod natural (conservat prin liofilizare sau congelare la temperaturi cuprinse între -16°C şi -24°C). Ca martori negativi se folosesc alicoţi din extract de probã care au fost gãsiţi negativi la testare. Se utilizeazã lame de microscop cu multe godeuri, de preferinţã 10 godeuri, fiecare godeu având un diametru minim de 6 mm. Controalele se testeazã la fel ca probele. 4.1. Lamele se preparã folosindu-se una dintre urmãtoarele metode: (i) pentru sedimentele cu conţinut relativ redus de amidon: se pipeteazã în primul godeu un volum standard (15 æL în godeurile de 6 mm; pentru godeurile cu un diametru mai mare se pipeteazã o cantitate mai mare) dintr-o diluţie de 1/100 de sediment de cartof resuspendat. Apoi se pipeteazã un volum similar de sediment nediluat (1/1) în godeurile rãmase de pe acel rând. Rândul urmãtor poate fi folosit ca duplicat sau poate servi pentru a doua probã, aşa cum este indicat în figura 1; (ii) alte sedimente: se preparã diluţii zecimale (1/10 şi 1/100) din sedimentul resuspendat în tampon de sedimentare. Se pipeteazã pe primul rând de godeuri un volum standard (15 æL în godeurile de 6 mm; pentru godeurile cu un diametru mai mare se pipeteazã un volum mai mare) de sediment resuspendat şi fiecare diluţie. Şirul urmãtor poate fi folosit ca duplicat sau poate servi pentru o a doua probã, aşa cum este indicat în figura 2. 4.2. Se usucã picãturile la temperatura mediului ambiant sau prin încãlzire la temperaturi cuprinse între 40°C şi 45°C. Celulele bacteriene se fixeazã pe lamã prin încãlzire (15 minute la 60°C), prin flambare, cu ajutorul etanolului 95%, sau urmând instrucţiunile specifice ale furnizorilor de anticorpi. Dacã este necesar, lamele fixate pot fi pãstrate la frigider într-o cutie desicator pentru cel mult 3 luni înainte de efectuarea unui alt test. 4.3. Procedura testului de imunofluorescenţã (IF): (i) în conformitate cu metoda de preparare a lamelor-test, indicatã la pct. 4.1 (i): se preparã o serie de diluţii de anticorpi la jumãtate, într-un tampon IF. Primul godeu trebuie sã conţinã 1/2 din titru (T/2), celelalte, 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titrul (T) şi de douã ori titrul (2T); (ii) în conformitate cu metoda de preparare a lamelor-test, indicatã la pct. 4.1 (ii): se preparã diluţia de lucru de anticorpi într-un tampon IF. Diluţia de lucru are efect asupra specificitãţii. Figura 1. Prepararea lamei-test în conformitate cu pct. 4.1 (i) şi 4.3 (i)
Diluţia de sediment resuspendat
1/100 1/1 1/1 1/1 1/1 Diluţie de sediment resuspendat
(T = titru) T/2 T/4 T/2 T 2T Diluţie pe jumãtate a
antiserului/anticorpilor
Diluţia de lucru de antiser/anticorp
1/1 1/10 1/100 gol gol Diluţie la a zecea parte de
sediment resuspendat
Teste Rezultate preconizate
───── ──────────────────────
Oxidare/fermentare (O/F) Inert sau slab oxidant
Oxidazã -
Creştere la 37°C -
Activitatea ureazei -
Hidroliza esculinei +
Hidroliza amidonului - sau slab
Creştere în soluţie de NaCl 7% -
Producţia de indol -
Activitatea catalazei +
Producţie de H(2)S -
Utilizarea citratului -
Lichefierea gelatinei -
Producţia de acid din glicerol -
Producţia de acid din lactozã - sau slab
Producţia de acid din ramnozã -
Producţia de acid din salicin -
Coloraţia Gram (vezi apendice 9) +
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
Laborator*1) Localitate Ţarã
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
Agentur fur Gesundheit und Ernahrungssicherheit Viena şi Linz Austria
Departement Gewasbescherming Merelbeke Belgia
Plantetdirektoratet Lyngby Danemarca
Central Science Laboratory York Anglia
Scottish Agricultural Science Agency Edinburgh Scoţia
Laboratoire National de La Protection des Vegetaux Angers Franţa
Unite de Bacteriologie
Laboratoire National de La
Protection des Vegetaux Le Rheu Franţa
Station de Quarantaine de la Pomme de Terre
Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Germania
Pflanzenschutzamt Hannover Hanover Germania
State Laboratory Dublin Irlanda
Plantenziektenkundige Dienst Wageningen Olanda
Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Aas Norvegia
Center
Direccao-Geral de Proteccao das Culturas Lisabona Portugalia
Nacionalni Institut za Biologijo Ljubljana Slovenia
Centro de diagnostico de Aldearrubia Salamanca Spania
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
Obiect Cantitate
(pe l)
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
Fulgi de Lubrol Defloculant*) 0,5 g
Antispumant cu DC silicon Agent antispumant*) 1,0 mL
Pirofosfat tetrasodic Antioxidant 1,0 g
Polivinilpirolidonã -40.000 (PVP-40) Leagã inhibitorii PCR 50 g
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
Na(2)HPO(4).12H(2)O 3,2 g
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
NaH(2)PO(4).2H(2)O 0,15 g
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
Glicerol 50 mL
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
Apã distilatã 100 mL
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
s = unde:i = coeficientul câmpului (depinde de tipul de ocular şi
\'f0i^2/4G^2K^2 variazã de la 8 la 24)
K = coeficientul tubului (1 sau 1,25)
G = mãrirea obiectivului(de 100 de ori, de 40 de ori etc.)
Primer direct PSA-1 5' - ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa - 3'
Primer indirect PSA-R 5' - tac tga gat gtt tca ctt ccc c - 3'
Primer direct NS-7-F 5' - gag gca ata aca ggt ctg tga tgc - 3'
Primer indirect NS-8-R 5' - tcc gca ggt tca cct acg ga - 3'
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
Reactiv Cantitate per reacţie Concentraţie finalã
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
Apã ultrapurã sterilã 15,725 æL
10 x tampon PCR^1 (15 mM MgCl(2)) 2,5 æL 1 x (1,5 mM MgCl(2))
BSA (fracţie V) (10%) 0,25 æL 0,1%
Amestec d-nTP (20 mM) 0,125 æL 0,1 mM
Primer PSA-1 (10 æM) 0,5 æL 0,2 æM
Primer PSA-R (10 æM) 0,5 æ 0,2 æM
Primer NS-7-F (10 æM)*2) 0,1 æL 0,04 æM
Primer NS-8-R (10 æM)*2) 0,1 æL 0,04 æM
Taq Polimerazã (5U/æL)*1) 0,2 æL 1,0 U
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
Volumul probei 5,0 æL
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
Volum total: 25,0 æL
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
1 ciclu de: (i) 3 minute la 95°C: denaturarea ADN;
10 cicluri de: (ii) 1 minut la 95°C: denaturarea ADN;
(iii) 1 minut la 64°C: hibridizare cu primerii;
(iv) 1 minut la 72°C: elongarea ADN-ului;
25 de cicluri de: (v) 30 secunde la 95°C: denaturarea ADN;
(vi) 30 secunde la 62°C: hibridizare cu primerii;
(vii) 1 minut la 72°C: elongarea ADN-ului;
1 ciclu de: (viii) 5 minute la 72°C: elongare finalã;
(ix) se menţine la 4°C.
───────────────────────────────────────────────────────────────
2 lame 8lame
───────────────────────────────────────────────────────────────
Apã ultrapurã sterilã 50,1 200,4
Hibmix 3 x 30,0 120,0
1% Dodecilsulfat de sodiu 0,9 3,6
Sonda EUB 338 (100 ng/æL) 4,5 18,0
Sonda CMSCY301 (100 ng/æL) 4,5 18,0
───────────────────────────────────────────────────────────────
Volum total (æL) 90,0 360,0
───────────────────────────────────────────────────────────────
Durata zilei 14 ore sau durata naturalã a zilei
Temperatura: ziua 21-24°C
noaptea 15°C.
Soiuri sensibile de vinete: "Black Beauty";
"Long Tom";
"Rima";
"Balsas".
Newsletter GRATUIT
Aboneaza-te si primesti zilnic Monitorul Oficial pe email
Comentarii
Fii primul care comenteaza.
