Comunica experienta
MonitorulJuridic.ro

Trimite prin Yahoo Messenger pagina: ORDIN nr. 23 din 10 iunie 2004 pentru aprobarea Normei veterinare ce stabileste metode nationale de analiza pentru controlul oficial al furajelor in scopul identificarii continutului in robenidina (E 750) si metil benzoat

Cautare document

Termen: Tipul actului: Anul publicarii actului:

Cautare document

Termen: Tipul actului: Anul publicarii actului:

Copierea de continut din prezentul site este supusa regulilor precizate in Termeni si conditii! Click aici.
Prin utilizarea siteului sunteti de acord, in mod implicit cu Termenii si conditiile! Orice abatere de la acestea constituie incalcarea dreptului nostru de autor si va angajeaza raspunderea!

ORDIN nr. 23 din 10 iunie 2004 pentru aprobarea Normei veterinare ce stabileste metode nationale de analiza pentru controlul oficial al furajelor in scopul identificarii continutului in robenidina (E 750) si metil benzoat

EMITENT: AGENTIA VETERINARA SI PENTRU SIGURANTA ALIMENTELOR
PUBLICAT: MONITORUL OFICIAL nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004

Comenteaza legea

În temeiul prevederilor <>art. 10 lit. b) din Ordonanta Guvernului nr. 42/2004 privind organizarea activitãţii veterinare,
în baza <>Hotãrârii Guvernului nr. 308/2004 privind organizarea şi funcţionarea Agenţiei Veterinare şi pentru Siguranta Alimentelor şi a unitãţilor din subordinea acesteia,
vazand Referatul de aprobare nr. 153.183 din 26 mai 2004 al Direcţiei generale veterinare,

preşedintele Agenţiei Veterinare şi pentru Siguranta Alimentelor emite urmãtorul ordin:

ART. 1
Se aproba Norma veterinara ce stabileşte metode naţionale de analiza pentru controlul oficial al furajelor în scopul identificarii conţinutului în robenidina (E 750) şi metil benzoat, prevãzutã în anexa care face parte integrantã din prezentul ordin.
ART. 2
Institutele centrale de profil, direcţiile veterinare şi pentru siguranta alimentelor judeţene şi a municipiului Bucureşti vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.
ART. 3
Agenţia Veterinara şi pentru Siguranta Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin.
ART. 4
Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Preşedintele Agenţiei Veterinare şi pentru Siguranta Alimentelor,
Liviu Harbuz

Bucureşti, 10 iunie 2004.
Nr. 23.

ANEXA

NORMA VETERINARA
ce stabileşte metode naţionale de analiza pentru controlul oficial al furajelor în scopul identificarii conţinutului în robenidina (E 750) şi metil benzoat

ART. 1
Analizele efectuate în cursul controalelor oficiale a furajelor, pentru a se identifica conţinutul acestora în robenidina şi metil benzoat trebuie sa fie realizate utilizând metodele descrise la anexa prezentei norme.
ART. 2
(1) Autoritatea veterinara centrala a României poate adopta acte normative sau prevederi administrative suplimentare prezentei norme veterinare, pentru a dispune implementarea şi respectarea prevederilor acesteia.
(2) Autoritatea veterinara centrala va lua mãsurile necesare şi va sanctiona, potrivit legii, orice încãlcare a prevederilor prezentei norme veterinare.
(3) Atunci când autoritatea veterinara centrala a României adopta cele menţionate la alineatele precedente, trebuie sa se facã o referire expresã la prezenta norma veterinara.

ANEXA
------
la norma veterinara
-------------------

1. DETERMINAREA ROBENIDINEI
1,3-bis [(4-clorobenzidin)amino] hidroclorid - guanidina
1. Scop şi aplicabilitate
Aceasta metoda are ca scop determinarea robenidinei din furaje. Limita minima a determinãrii este de 5 mg/kg.
2. Principiu
Proba este extrasa cu metanol acidifiat. Extractul este uscat şi o parte alicota este supusã purificarii prin trecere printr-o coloana de oxid de aluminiu. Robenidina este eluata din coloana cu ajutorul metanolului, concentrata şi adusã la un volum corespunzãtor cu faza mobila. Conţinutul în robenidina este determinat prin cromatografie lichidã de inalta performanta în faza inversa -RP (HPLC) ce utilizeazã un detector UV.
3. Reactivi
3.1. Metanol
3.2. Metanol acidifiat
Într-un balon cotat de 500 ml se transfera 4,0 ml acid clorhidric (d = 1,18 g/ml), se completeazã pana la semn cu metanol (3.1) şi se amesteca. Aceasta soluţie trebuie sa fie proaspãt preparata, înainte de utilizare.
3.3. Acetonitril, grad HPLC
3.4. Sita moleculara
Tip 3A, de la 8 la 12 ochiuri (dimensiuni 1,6 - 2,5 mm, alumino-silicat cristalin, diametrul porilor de 0,3 mm).
3.5. Oxid de aluminiu: activitate gradul I, pentru cromatografie pe coloana 100 g oxid de aluminiu se transfera într-un recipient corespunzãtor şi se adauga 2,0 ml apa. Se acoperã şi se agita aproximativ 20 minute. Se pãstreazã într-un recipient bine închis.
3.6. Soluţie de fosfat dihidrogenat de potasiu, c = 0,025 mol/l.
Se dizolva 3,40 g fosfat dihidrogenat de potasiu în apa (grad HPLC) într-un balon cotat de 1000 ml, se aduce la semn şi se amesteca.
3.7. Soluţie de fosfat monohidrogenat de sodiu, c = 0,025 mol/l.
Se dizolva 3,55 g difosfat monohidrogenat anhidru (sau 4,45 g dihidrat sau 8,95 g dodecahidrat) în apa (grade HPLC) într-un balon cotat de 1000 ml, se aduce la semn şi se amesteca.
3.8. Faza mobila HPLC
Se amesteca urmãtorii reactivi:
650 ml acetonitril (3.3),
250 ml apa (grad - HPLC),
50 ml soluţie de fosfat dihidrogenat de potasiu (3.6),
50 ml soluţie de fosfat monohidrogenat disodic (3.7).
Se filtreaza prin filtre de 0,22 [ ] m (4.6) şi se degazeaza soluţia, (ex. prin tratament cu ultrasunete timp de 10 minute).
3.9. Substanta standard (de titrare)
Robedinidina pura: 1.3-bis[(4-clorbenzidina)amino] guanidin hidroclorid, E 750.
3.9.1. Soluţie standard stoc de robenidina: 300 mg/ml
Se cantaresc cu aproximatie de 0,1 mg, 30 mg din substanta standard (de titrare) de robenidina (3.9). Se dizolva în metanol acidifiat (3.2) într-un balon cotat de 100 ml, se aduce la semn şi se amesteca. Balonul cotat se inveleste într-o folie de aluminiu şi se pãstreazã la loc intunecos.
3.9.2. Soluţie standard intermediara de robenidina: 12 mg/ml.
Se pun 10,0 ml din soluţia standard stoc (3.9.1) într-un balon cotat de 250 ml, se aduce la semn cu faza mobila (3.8) şi se amesteca. Balonul cotat se inveleste într-o folie de aluminiu şi se pãstreazã la loc intunecos.
3.9.3. Calibrarea (etalonarea) soluţiilor
Într-o serie de baloane cotate de 50 ml se transfera 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 şi 25,0 ml din soluţia standard intermediara (3.9.2). Se aduce la semn cu faza mobila (3.8) şi se amesteca. Aceste soluţii corespund concentratiilor de 1,2, 2,4, 3,6, 4,8, şi 6,0 mg/ml de robenidina. Aceste soluţii trebuie sa fie proaspãt preparate, înainte de utilizare.
4. Aparat
4.1. Coloana de sticla
Construitã din sticla bruna prevãzutã cu robinet şi un rezervor de aproximativ 150 ml capacitate, diametrul interior de la 10 la 15 mm, lungime 250 mm.
4.2. Agitator manual de laborator
4.3. Evaporator cu film rotativ
4.4. Echipament HPLC cu detector cu ultraviolete cu lungimi de unda variabile sau detector cu sistem de diode în linie cu lungimi de unda cuprinse între 250 şi 400 nm.
4.4.1. Coloana de cromatografie lichidã: 300 mm x 4 mm, C 18, 10 mm sau o coloana echivalenta.
4.5. Filtru cu hârtie din fibre de sticla (Whatman GF/A sau filtre echivalente)
4.6. Filtru cu membrana de 0,22 mm
4.7. Filtru cu membrana de 0,45 mm
5. Metoda de lucru
Nota: Robenidina este sensibila la lumina. Sticla bruna trebuie utilizata la toate operaţiunile.
5.1. Generalitati
5.1.1. Trebuie analizat un furaj martor pentru a se verifica absenta robenidinei şi interferenta substanţelor.
5.1.2. Trebuie efectuat un test de randament prin care se analizeazã un furaj martor ce este imbogatit prin adãugarea unei cantitãţi de robenidina identicã cu cea prezenta în proba. Pentru a se imbogati la un nivel de 60 mg/kg, se adauga 3,0 ml soluţie etalon stoc (3.9.1) într-un pahar conic de 250 ml. Soluţia se evapora la c. 0,5 ml în curent de azot. Se adauga 15 g din furajul martor, se amesteca şi se asteapta 10 minute înainte de procedura de extracţie. (5.2)
Nota: În cadrul acestei metode, furajul martor trebuie sa fie similar, ca tip, cu cel al probelor de cercetat şi cu privire la analiza, nu trebuie sa fie detectata robenidina.
5.2. Extractia
Se cantaresc cu o precizie de 0,01 g, aproximativ 15 g din proba preparata. Se transfera într-un pahar conic de 250 ml şi se adauga 100,0 ml metanol acidifiat (3.2). Se acoperã şi se agita timp de o ora la agitator (4.2). Soluţia se filtreaza prin hârtia de filtru din fibra de sticla (4.5) şi se colecteazã integral filtratul într-un pahar conic de 150 ml. Se adauga 7,5 g de sita moleculara (3.4), se acoperã şi se agita timp de 5 minute. Se filtreaza imediat printr-un filtru din fibre de sticla. Aceasta soluţie se pãstreazã pentru etapa de purificare (5.3).
5.3. Purificarea
5.3.1. Prepararea coloanei de oxid de aluminiu
Extremitatea inferioarã a coloanei de sticla se obtureaza cu un mic tampon de vata de sticla (4.1) şi se taseaza utilizând o bagheta de sticla. Se cantaresc 11,0 g din oxidul de aluminiu preparat (3.5) şi se transfera în coloana. Trebuie sa se aibã grija sa se minimizeze expunerea la aer în timpul acestei etape. Se loveste uşor extremitatea inferioarã a coloanei umplute pentru a se decanta oxidul de aluminiu.
5.3.2. Purificarea probei
Cu ajutorul unei pipete, se transfera în coloana 5,0 ml din extractul de proba preparat la (5.2). Se lasa varful pipetei închis pana la peretele coloanei şi se permite soluţiei sa fie absorbitã pe oxidul de aluminiu. Se elueaza robenidina din coloana utilizând 100 ml metanol (3.1), la un debit de 2 pana la 3 ml/minut şi se colecteazã eluantul într-un balon cu fund rotund de 250 ml. Se evapora soluţia de metanol pana la uscare la 40°C, la presiune redusã, cu ajutorul evaporatorului rotativ (4.3). Se redizolva reziduul în 3 pana la 4 ml de faza mobila (3.8) şi se transfera cantitativ într-un balon cotat de 10 ml. Se clateste balonul cu mai multe pãrţi de 1-2 ml faza mobila şi se transfera aceste lichide de spalare în balonul cotat. Se aduce la semn cu acelaşi solvent şi se amesteca. O parte alicota este filtrata prin membrana filtrului de 0,45 mm (4.7). Aceasta soluţie se stocheaza pentru determinare HPLC (5.4).
5.4. Determinare HPLC
5.4.1. Parametri
Urmãtoarele condiţii sunt oferite pentru îndrumare, putând fi utilizate cu condiţia sa ofere rezultate echivalente:
Coloana de cromatografie lichidã (4.4.1), faza mobila HPLC (3.8),
Debit: 1,5 - 2 ml/minut,
Lungime de unda: 317 nm,
Volum injectat: 20 - 50 ml
Se verifica stabilitatea sistemului cromatografic, se injecteaza soluţia de etalonare (3.9.3) ce conţine 3,6 mg/ml, de câte ori este nevoie, pana se realizeazã cel mai înalt pic şi timpii de retenţie sunt constanti.
5.4.2. Curba de etalonare
Se injecteaza fiecare soluţie de etalonare (3.9.3.) de câte ori este nevoie şi se mãsoarã inaltimile picurilor (ariilor) pentru fiecare concentraţie. Se reprezintã grafic o curba de etalonare utilizând mediile picurilor sau ariilor principale ale soluţiilor de etalonare ca ordonate şi concentratiile corespunzãtoare în mg/ml ca abscise.
5.4.3. Soluţia proba
Se injecteaza extractul de proba (5.3.2) de câte ori este necesar, utilizând aceleaşi volume luate drept soluţii de etalonare şi se determina media inaltimilor picurilor (ariilor) de robenidina.
6. Calcularea rezultatelor
Din media inaltimilor (ariilor) picurilor de robenidina a probelor se determina concentratia probelor în mg/ml prin referire la curba de etalonare (5.4.2).
Conţinutul probei în robenidina w (mg/ml) este dat de urmãtoarea formula:


        c x 200

în care:
c = concentratia probei în robenidina, în mg/ml,
m = masa probei exprimatã în g.
7. Validarea rezultatelor
7.1. Identitate
Identitatea produsului analizat poate fi confirmatã prin co-cromatografie sau prin utilizarea unui detector cu sistem de diode prin care sunt comparate spectrul extractului de proba şi soluţia de calibrare (3.9.3) ce conţine 6 mg/ml.
7.1.1. Co-cromatografia
Un extract de proba este imbogatit prin adãugarea unei cantitãţi corespunzãtoare din soluţia etalon (3.9.3). Cantitatea de robenidina adãugatã trebuie sa fie similarã cantitãţii estimate de robenidina gasita în extractul de proba.
Numai înãlţimea picurilor de robenidina trebuie sa creascã dupã luarea în calcul a ambelor cantitãţi adãugate şi diluarea extractului. Largimea picului, la jumãtate din înãlţimea maxima, trebuie sa se încadreze în maxim 10% din largimea iniţialã.
7.1.2. Detectarea prin sistemul de diode
Rezultatele sunt evaluate în conformitate cu urmãtoarele criterii:
(a) lungimea de unda a absorbtiei maxime a probei şi a spectrelor standardului, înregistrate la varful picului, pe cromatograma, trebuie sa fie aceeaşi, cu o limita de siguranta determinata prin puterea de rezoluţie a sistemului de detectare. Pentru detectare prin sistemul de diode, aceasta este tipica pana la aproximativ 2 nm.
(b) între 250 şi 400 nm, spectrele standard şi a probei, înregistrate la varful picului pe cromatograma, trebuie sa fie diferite pentru acele pãrţi ale spectrului cuprinse între 10 şi 100% ale absorbtiei relative. Acest criteriu este îndeplinit când sunt prezente aceleaşi maxime şi când nu se observa vreo deviatie între cele doua puncte ale spectrului ce depãşeşte 15% din proba de analizat standard.
(c) între 250 şi 400 nm, spectrele curbei ascendente, varfului şi curbei descendente a picului, produse de extractul de proba nu trebuie sa fie diferite unele de celelalte pentru acele pãrţi ale spectrului în interiorul gamei de la 10 la 100% de absorbţie relativã. Acest criteriu este îndeplinit când sunt prezente aceleaşi maxime şi când la toate punctele observate deviatia între spectre nu depãşeşte 15% din absorbtia spectrului varfului.
Dacã unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezenta substanţei de analizat nu este confirmatã
7.2. Repetabilitate
Diferenţa între rezultatele a 2 determinãri paralele, efectuate pe aceeaşi proba, nu trebuie sa depãşeascã 10% din cel mai mare rezultat al conţinutului în robenidina, mai mare de 15 mg/kg.
7.3. Randament
Pentru proba martor imbogatita, randamentul trebuie sa fie de minim 85%.
8. Rezultatele unui studiu de colaborare
A fost realizat, de cãtre comunitate, un studiu de colaborare în 12 laboratoare, în care au fost analizate 4 probe de furaj pentru pãsãri şi iepuri, sub forma de fãina sau pelete. Au fost efectuate analize duble pentru fiecare proba. Rezultatele sunt prezentate în tabelul urmãtor:
Rezultate


         Media mg/ml          27,00         27,99         43,6         40,1
         Sr (mg/kg)            1,46          1,26          1,44         1,66
         CVr (%)               5,4           4,5           3,3          4,1
         Sr (mg/kg)            4,36          3,36          4,61         3,91
         CVR (%)              16,1          12,0          10,6          9,7
         Randament (%)        90,0          93,3          87,2         80,2

Sr = deviatia standard a repetabilitatii
CVr = coeficientul de deviatie a repetabilitatii
SR = deviatia standard a reproductibilitatii
CVR = coeficient de variatie a reproductibilitatii
2. DETERMINAREA METIL BENZOATULUI
7-benziloxi-6-butil-3-metoxicarbonil-4-quinolona
1. Scop şi aplicabilitate
Aceasta metoda are ca scop determinarea metil benzoatului din furaje.
Limita minima a determinãrii este de 1 mg/kg.
2. Principiu
Metil benzoatul este extras din proba cu soluţie metanolica de acid metansulfonic. Extractul este purificat cu diclormetan prin cromatografie de schimb ionic şi apoi din nou cu diclormetan.
Conţinutul în benzoat de metil este determinat prin cromatografie lichidã de inalta performanta în faza inversa (HPLC) ce utilizeazã un detector UV.
3. Reactivi
3.1. Diclormetan
3.2. Metanol, grade HPLC
3.3. faza mobila HPLC:
amestec de metanol (3.2) şi apa (grade HPLC) 75 + 25 (v + v)
filtrarea prin filtre de 0,22 mm (4.6) şi degazarea soluţiei, (ex. prin tratament cu ultrasunete timp de 10 minute)
3.4. Soluţie de acid metansulfonic, s = 2%
Se dilueaza 20 ml acid metansulfonic pana la 1000 ml cu metanol (3.2).
3.5. Soluţie de acid clorhidric, s = 10%
Se dilueaza 100 ml acid clorhidric (P 20 c. 1,18 g/ml) cu apa pana la 1000 ml.
3.6. Amberlite CG-120 (Na), rasina schimbatoare de cationi, diametrul granulelor de la 100 la 200 mesh (0,074 - 0,038 mm)
Rasina este retratata înaintea utilizãrii: se amesteca 100 g rasina cu 500 ml soluţie acid clorhidric (3.5) şi se incalzeste pe o placa fierbinte, agitandu-se continuu. Se lasa la rece pentru a se decanta acidul. Se filtreaza prin hârtia de filtru sub vacuum. Se spala rasina de doua ori cu 500 ml pãrţi apa şi apoi cu 250 ml etanol (3.2). Se spala rasina cu cele 250 ml pãrţi de metanol (3.2) şi se usucã prin trecerea aerului prin filtru.
Rasina uscata se pãstreazã într-o sticla închisã.
3.7. Substanta standard: metil benzoat pur (7-benziloxi-6-butil-3- metoxicarbonil-4-quinolona)
3.7.1. Soluţie stoc de metil benzoat, 500 mg/ml
Se cantaresc cu aproximatie de 0,1 mg, 50 mg din substanta standard (3.7) se dizolva în soluţie de acid metansulfonic (3.4), într-un balon cotat de 100 ml se completeazã pana la semn şi se amesteca.
3.7.2. Soluţie standard intermediara de metil benzoat, 50 mg/ml
Se transfera 5,0 ml soluţie stoc de metil benzoat (3.7.1) într-un balon cotat de 50 ml, se aduce la semn cu metanol (3.2) şi se amesteca.
3.7.3. Etalonarea soluţiilor
Într-o serie de baloane cotate de 25 ml se transfera 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, şi 5,0, ml de soluţie standard (etalon) intermediara de metil benzoat (3.7.2). Se aduce la semn cu faza mobila (3.3) şi se amesteca. Aceste soluţii corespund concentratiilor de 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 şi 10,0 mg/ml metil benzoat. Aceste soluţii trebuie sa fie proaspãt preparate înainte de utilizare.
4. Aparat
4.1. Agitator de laborator
4.2. Evaporator rotativ
4.3. Coloana de sticla (250 mm x 15 mm) prevãzutã cu robinet şi rezervor de aproximativ 200 ml capacitate.
4.4. Echipament HPLC cu detector cu ultraviolete cu lungimi de unda variabile sau detector cu sistem de diode
4.4.1. Coloana cromatografica cu lichid: 300 mm x 4 mm, C - 18, 10 mm
4.5. Filtru cu membrana de 0,22 mm
4.6. Filtru cu membrana de 0,45 mm
5. Metoda de lucru
5.1. Generalitati
5.1.1. Un furaj martor trebuie analizat pentru a se verifica absenta metil benzenului sau a altor substanţe interferente.
5.1.2. Trebuie efectuat un test de randament prin care se analizeazã un furaj martor ce este imbogatit prin adãugarea unei cantitãţi de metil benzoat, identicã cu cea prezenta în proba. Pentru a se imbogati la un nivel de 15 mg/kg, se adauga 600 ml soluţie stoc (3.7.1) la 20 g furaj martor, se amesteca şi se asteapta 10 minute înainte de procedura de extracţie (5.2).
Nota: În cadrul acestei metode, furajul martor trebuie sa fie ca tip, similar cu cel al probei, iar cu privire la analiza, nu trebuie sa fie detectat metil benzoat.
5.2. Extractia
Se cantareste cu precizie de 0,01 g, aproximativ 20 g din proba preparata şi se transfera într-un pahar conic de 250 ml. Se adauga 100,0 ml soluţie de acid metansulfonic (3.4) şi se agita mecanic (4.1) timp de 30 minute. Soluţia se filtreaza prin hârtia de filtru (4.1) şi se pãstreazã filtratul pentru etapa de separare lichid-lichid.
5.3. Separarea lichid-lichid
Se transfera 25 ml filtrat obţinut, (5.2) într-o palnie de separare de 500 ml ce conţine 100 ml soluţie de acid clorhidric. Se adauga 100 ml diclormetan (3.1), în palnie şi se agita un minut. Se lasa sa se separe fazele şi se preia stratul inferior (diclormetan) într-un balon cu fund rotund de 500 ml. Se repeta extractia fazei apoase cu celelalte doua porţiuni de diclormetan a 40 ml şi se combina acestea cu primul extract din balonul cu fund rotund. Se evapora extractul de diclormetan pana la uscare la evaporatorul rotativ (4.2), ce funcţioneazã la presiune scãzutã la 40°C. Reziduul se dizolva în 20 pana la 25 ml metanol (3.2), se pune dopul şi se conserva extractul total pentru cromatografie prin schimb ionic (5.4).
5.4. Cromatografie prin schimb ionic
5.4.1. Prepararea coloanei cu schimbatori de cationi
Se introduce un mic tampon de vata de sticla la extremitatea inferioarã a coloanei de sticla. Se prepara o suspensie de 5 g de rasina schimbatoare de cationi (3.6) cu 50 ml acid clorhidric (3.5), se toarna în coloana de sticla şi se lasa sa se stabilizeze. Se indeparteaza excesul de acid lasandu-l sa se scurgã chiar deasupra suprafeţei rasinii şi se spala coloana cu apa pana când este neutralizat cu turnesol. Se transfera 50 ml metanol (3.2) în coloana şi permite scurgerea de pe suprafata rasinii.
5.4.2. Cromatografie pe coloana
Cu ajutorul unei pipete, se transfera cu grija extractul obţinut în (5.3) coloana. Se clateste balonul cu fund rotund cu doua pãrţi de 5 şi 10 ml metanol (3.2) şi se transfera aceste lichide de spalare în coloana. Se lasa extractul sa se scurgã pe suprafata rasinii, se spala coloana cu 50 ml metanol şi se asigura ca debitul nu este mai mare de 5 ml/min. Se inlatura eluantul. Se elueaza metil benzoatul din coloana utilizând 150 ml soluţie de acid metansulfonic (3.4) şi se colecteazã eluantul din coloana într-un pahar conic de 250 ml.
5.5. Separarea lichid-lichid
Se transfera eluantul obţinut (5.4.2) într-o palnie de decantare de 1 litru. Se clateste paharul conic cu 5 pana la 10 ml metanol (3.2) şi se combina lichidul de spalare cu conţinutul palniei de separare. Se adauga 300 ml soluţie acid clorhidric (3.5) şi 130 ml diclormetan (3.1). Se agita timp de 1 minut şi se lasa sa se separe fazele. Se lasa sa se scurgã faza inferioarã (diclormetan) într-un balon cu fundul rotund de 500 ml. Se repeta extractia fazei apoase cu alte doua pãrţi de 70 ml de diclormetan şi se combina aceste extracte cu primul într-un balon cu fundul rotund.
Se evapora extractul de diclormetan pana la uscare cu evaporatorul rotativ (4.2) ce funcţioneazã la presiune redusã şi la temperatura de 40°C. Se dizolva reziduul într-un balon cu aproximativ 5 ml metanol (3.2) şi se transfera intreaga cantitate din aceasta soluţie într-un balon cotat de 10 ml. Se clateste balonul cu fund rotund cu doua noi pãrţi de 1 pana la 2 ml metanol şi acestea se transfera într-un balon cotat. Se aduce la semn cu metanol şi se amesteca. O porţiune alicota este filtrata printr-un filtru cu membrana (4.6). Aceasta soluţie se pãstreazã pentru analiza HPLC (5.6).
5.6. Determinarea HPLC
5.6.1. Parametri
Urmãtoarele condiţii sunt oferite pentru orientare, putând fi utilizate cu condiţia sa ofere rezultate echivalente:
- coloana cromatografica cu lichid (4.4.1).
- faza mobila HPLC: amestec apa - metanol (3.3), - debit: de la 1 la 1,5 ml/minut.
- lungime de unda de detectie: 265 nm, - Volum injectat de la 20 la 50 ml.
Se controleazã stabilitatea sistemului cromatografie, injectandu-se soluţia de etalonare (3.7.3) ce conţine 4 mg/ml, de mai multe ori, pana când se realizeazã inaltimile sau ariile picului şi timpii de retenţie fixati.
5.6.2. Curba etalon
Se injecteaza fiecare soluţie de calibrare (etalonare) (3.7.3) la diferite intervale de timp şi se mãsoarã inaltimile (ariile) picurilor pentru fiecare concentraţie. Se reprezintã grafic o curba de calibrare utilizându-se media inaltimilor picului sau ariile soluţiilor de calibrare (etalonare) ca ordonate şi concentratiile corespondente în mg/ml, ca abscise.
5.6.3. Soluţia proba
Se injecteaza extractul de proba (5.3.2) de mai multe ori, utilizându-se acelaşi volum folosit pentru soluţiile de calibrare (etalonare) şi se determina media inaltimilor picurilor (ariilor) de metil benzoat.
6. Calcularea rezultatelor
Se determina concentratia soluţiei din proba în mg/ml pornindu-se de la media inaltimii (ariei) picurilor de metil benzoat a soluţiei din proba în raport cu curba de etalonare (5.4.2).
Conţinutul în metil benzoat al probei w (mg/ml) este dat de urmãtoarea formula:


        c x 40

în care:
c = concentratia în metil benzoat a probei, în mg/ml,
m = masa probei de testat exprimatã în g.
7. Validarea rezultatelor
7.1. Identitate
Identitatea produsului analizat poate fi confirmatã prin co-cromatografie sau prin utilizarea unui detector cu sistem de diode prin care sunt comparate spectrul extractului probei şi soluţia de etalonare (3.7.2) ce conţine 6 mg/ml.
7.1.1. Co-cromatografia
Un extract de proba este imbogatit prin adãugarea unei cantitãţi corespunzãtoare din soluţia de etalonare (3.9.3). Cantitatea de metil benzoat adãugatã trebuie sa fie similarã cu cantitatea estimatã de metil benzoat în extractul de proba.
Numai înãlţimea picului de metil benzoat trebuie sa creascã dupã luarea în calcul a ambelor cantitãţi adãugate şi diluarea extractului. Largimea picului, la jumãtate din înãlţimea maxima, trebuie sa se încadreze în maxim 10% din largimea iniţialã.
7.1.2. Detectare prin sistemul de diode
Rezultatele sunt evaluate în conformitate cu urmãtoarele criterii:
(a) lungimea de unda a absorbtiei maxime a probei şi a spectrelor standardului (etalonului), înregistrate pe cromatograma la varful picului, trebuie sa fie aceeaşi, cu o zona de siguranta determinata prin puterea de rezoluţie a sistemului de detectare. Pentru detectare prin sistemul de diode, aceasta este tipica pana la aproximativ 2 nm.
(b) între 220 şi 350 nm, spectrele probei şi a etalonului, înregistrate pe cromatograma la varful picului, nu trebuie sa fie diferite pentru acele pãrţi ale spectrului cuprinse între 10 şi 100% ale absorbtiei relative. Acest criteriu este îndeplinit când sunt prezente aceleaşi maxime şi când nu se observa vreo deviatie între cele doua puncte ale spectrului ce depãşeşte 15% din proba de analizat standard.
(c) între 220 şi 350 nm, spectrul curbei ascendente, a varfului şi a curbei descendente a picului produs de extractul de proba, nu trebuie sa fie diferita unele de celelalte, pentru acele pãrţi ale spectrului în interiorul gamei de la 10 la 100% de absorbţie relativã. Acest criteriu este îndeplinit când sunt prezente aceleaşi maxime şi când la toate punctele observate deviatia dintre spectre nu depãşeşte 15% din absorbtia spectrului varfului.
Dacã unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezenta substanţei de analizat nu este confirmatã.
7.2. Repetabilitate
Diferenţa între rezultatele a 2 determinãri paralele efectuate pe aceleaşi probe nu trebuie sa depãşeascã 10% din cel mai mare rezultat al conţinutului în metil benzoat, între 4 şi 20 mg/kg.
7.3. Randament
Pentru o proba martor imbogatita, randamentul trebuie sa fie de minim 90%.
8. Rezultate ale unui studiu de colaborare
Cinci probe au fost analizate de cãtre 10 laboratoare. Au fost efectuate analize duble pentru fiecare proba.
Rezultate


         Media             n.d        4,50        4,50        8,90        8,70
         Sr (mg/kg)         -         0,30        0,20        0,60        0,50
         CVr (%)            -         6,70        4,40        6,70        5,70
         Sr (mg/kg)         -         0,40        0,50        0,90        1,00
         CVR (%)            -         8,90       11,10       10,10       11,50
         Randament (%)      -        93,00       92,00       89,00       92,00

n.d. = nedetectat
Sr = deviatia standard a repetabilitatii
CVr = coeficientul de deviatie a repetabilitatii
SR = deviatia standard a reproductibilitatii
CVR = coeficient de variatie a reproductibilitatii
------------

Newsletter GRATUIT

Aboneaza-te si primesti zilnic Monitorul Oficial pe email

Tags: Monitorul Oficial, Acte Monitorul Oficial, Ordin, Alte Institutii, ORDIN nr. 23 din 10 iunie 2004

Comentarii

Fii primul care comenteaza.

MonitorulJuridic.ro este un proiect:

Atentie, Juristi!

5 modele Contracte Civile si Acte Comerciale - conforme cu Noul Cod civil si GDPR

Legea GDPR a modificat Contractele, Cererile sau Notificarile obligatorii

Va oferim Modele de Documente conform GDPR + Clauze speciale

Descarcati GRATUIT Raportul Special "5 modele Contracte Civile si Acte Comerciale - conforme cu Noul Cod civil si GDPR"