Comunica experienta
MonitorulJuridic.ro
În temeiul prevederilor <>art. 10 lit. b) din Ordonanta Guvernului nr. 42/2004 privind organizarea activitãţii veterinare, în baza <>Hotãrârii Guvernului nr. 308/2004 privind organizarea şi funcţionarea Agenţiei Veterinare şi pentru Siguranta Alimentelor şi a unitãţilor din subordinea acesteia, vazand Referatul de aprobare nr. 153.354 din 26 mai 2004 al Direcţiei generale veterinare, preşedintele Agenţiei Veterinare şi pentru Siguranta Alimentelor emite urmãtorul ordin: ART. 1 Se aproba Norma veterinara ce stabileşte metode naţionale de analiza pentru controlul oficial al furajelor în scopul identificarii conţinutului în halofuginona, prevãzutã în anexa care face parte integrantã din prezentul ordin. ART. 2 Institutele centrale de profil, direcţiile veterinare şi pentru siguranta alimentelor judeţene şi a municipiului Bucureşti vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin. ART. 3 Agenţia Veterinara şi pentru Siguranta Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin. ART. 4 Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I. Preşedintele Agenţiei Veterinare şi pentru Siguranta Alimentelor, Liviu Harbuz Bucureşti, 10 iunie 2004. Nr. 21. ANEXA NORMA VETERINARAce stabileşte metode naţionale de analiza pentru controlul oficial al furajelor în scopul identificarii conţinutului în halofuginona ART. 1 Analizele pentru conţinutul în halofuginona în scopul controlului oficial al furajelor trebuie sa fie efectuate utilizând metodele descrise de anexa la prezenta norma veterinara. ART. 2 (1) Autoritatea veterinara centrala a României poate adopta acte normative sau prevederi administrative suplimentare prezentei norme veterinare, pentru a dispune implementarea şi respectarea prevederilor acesteia. (2) Autoritatea veterinara centrala va lua mãsurile necesare şi va sanctiona, potrivit legii, orice încãlcare a prevederilor prezentei norme veterinare. (3) Atunci când autoritatea veterinara centrala a României adopta cele menţionate la alineatele precedente, trebuie sa se facã o referire expresã la prezenta norma veterinara. ANEXA -----la norma veterinara------------------- DETERMINAREA HALOFUGINONEI DL-trans-7-bromo-6-cloro-3-[3-(3-hidroxi-2-piperidil) acetonil]-quinazolin-4-(3H)-1 bromhidrat 1. Scop şi aplicabilitate Aceasta metoda are ca scop determinarea halofuginonei din furaje. Limita minima a determinãrii este de 1 mg/kg. 2. Principiu Dupã tratare cu apa fierbinte, halofuginona este extrasa ca baza libera în acetat de etil şi dupã aceea separatã ca şi clorhidrat, într-o soluţie acida apoasa. Extractul este purificat prin cromatografie de schimb ionic. Conţinutul în halofuginona este determinat prin cromatografie lichidã de inalta performanta în faza inversa (RP-HPLC) ce utilizeazã un detector cu UV. 3. Reactivi 3.1. Acetonitril, grade HPLC 3.2. Rasina Amberlite XAD-2 3.3. Acetat de amoniu 3.4. Acetat de etil 3.5. Acid acetic glacial 3.6. Substanta standard halofuginona (DL-trans-7-bromo-6-cloro-3-[3-(3- hidroxi-2-piperidil) acetonil]-quinazolin-4-(3H)-1 bromhidrat, E 764) 3.6.1. Soluţie standard (etalon) stoc de halofuginona, 100 mg/ml. Se cantaresc, cu aproximatie de 0,1 mg, 50 mg halofuginona (3.6) într-un balon cotat de 500 ml, se dizolva în soluţie tampon de acetat de amoniu (3.18), se aduce la semn cu soluţie tampon şi se amesteca. Aceasta soluţie este stabilã timp de 3 sãptãmâni, la 5°C dacã este pastrata la intuneric. 3.6.2. Calibrarea (etalonarea) soluţiilor Într-o serie de baloane cotate de 100 ml se transfera 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 şi 6,0 ml din soluţia standard (etalon) stoc (3.6.1). Se aduce la semn cu faza mobila (3.2.1) şi se amesteca. Aceste soluţii corespund concentratiilor de 2,0, 3,0, 4,0, şi 6,0 mg/ml de halofuginona. Aceste soluţii trebuie sa fie proaspãt preparate, înainte de utilizare. 3.7. Acid clorhidric (r 20 aproximativ 1,16 g/ml) 3.8. Metanol 3.9. Azotat de argint 3.10. Ascorbat de sodiu 3.11. Carbonat de sodiu 3.12. Clorura de sodiu 3.13. EDTA (sare disodica a acidului etilendiamintetrcetic) 3.14. Apa distilata grade HPLC 3.15. Soluţie de carbonat de sodiu, v = 10 g/100 ml 3.16. Soluţie de carbonat de sodiu saturata în clorura de sodiu, v = 5 g/100 ml Se dizolva 50 g carbonat de sodiu (3.11) în apa, se dilueaza pana la 1 litru şi se adauga clorura de sodiu (3.12) pana când soluţia devine saturata. 3.17. Acid clorhidric, aproximativ 0,1 mol/l Se dilueaza 10 ml HCl (3.7) cu apa pana la 1 litru. 3.18. Soluţie tampon de acetat de amoniu, aproximativ 0,25 Se dizolva 19,3 g acetat de amoniu (3.3) şi 30 ml acid acetic (3.5) în apa (3.14) şi se dilueaza pana la 1 litru. 3.19. Prepararea rasinii Amberlite XAD-2 Se spala o cantitate corespunzãtoare de Amberlite (3.2) cu apa pana se elimina toţi ionii de clorura, asa cum este indicat printr-un test cu nitrat de argint efectuat în faza apoasa eliminata. Apoi se spala rasina cu 50 ml metanol (3.8), se inlatura metanolul şi se pãstreazã rasina în metanol proaspãt. 3.20. Soluţie nitrat de argint, aproximativ 0,1 mol/l Se dizolva 0,17 g nitrat de argint (3.9) în 10 ml apa. 3.21. Faza mobila HPLC Se amesteca 500 ml acetonitril (3.1) cu 300 ml soluţie tampon acetat de amoniu (3.18) şi 1200 ml apa (3.14), pH-ul se ajusteaza la 4,3 utilizându-se acid acetic (3.5). Se filtreaza prin filtru de 0,22 mm (4.8) şi se degazeaza soluţia (ex. prin ultrasunete timp de 10 minute). Aceasta soluţie este stabilã timp de o luna, dacã este pastrata la intuneric într-un recipient închis. 4. Aparatura 4.1. Baie de ultrasunete 4.2. Evaporator cu film rotativ 4.3. Centrifuga 4.4. Echipament HPLC cu detector UV cu lungimi de unda variabile sau detector cu sistem de diode în linie. 4.4.1. Coloana de cromatografie lichidã: 300 mm x 4 mm, C 18, 10 mm sau o coloana echivalenta. 4.5. Coloana de sticla (300 mm x 10 mm) prevãzutã cu filtru din sticla sinterizata şi robinet. 4.6. Filtre din fibre de sticla, diametru 150 mm 4.7. Filtru cu membrana de 0,45 mm 4.8. Filtru cu membrana de 0,22 mm 5. Metoda de lucru Nota: Halofuginona ca baza libera este instabila în soluţii alcaline şi de acetat de etil. Aceasta nu trebuie sa rãmânã în acetat de etil mai mult de 30 minute. 5.1. Generalitati 5.1.1. Trebuie analizat un furaj martor pentru a se verifica absenta halofuginonei şi interferenta substanţelor. 5.1.2. Trebuie efectuat un test de randament prin care se analizeazã un furaj martor ce a fost imbogatit prin adãugarea unei cantitãţi de halofuginona identicã cu cea prezenta în proba. Pentru a se imbogati la un nivel de 3 mg/kg, se adauga 300 ml soluţie standard (etalon) stoc (3.6.1) la 10 g din furajul martor, se amesteca şi se asteapta timp de 10 minute înainte de procedura de extracţie (5.2). Nota: În cadrul acestei metode, furajul martor trebuie sa fie similar, ca tip, cu cel al probei de cercetat, iar cu privire la analiza, nu trebuie sa fie detectata halofuginona. 5.2. Extracţie Se cantaresc, cu o precizie de 0,1 g, 10 g din proba preparata într-un tub de centrifuga de 200 ml, se adauga 0,5 g ascorbat de sodiu (3.10), 0,5 ml EDTA (3.13) şi 20 ml apa şi se amesteca. Se transfera într-un pahar conic de 250 ml şi se adauga 100,0 ml metanol acidifiat (3.2). Se introduce tubul timp de 5 minute într-o baie de apa (80°C). Dupã rãcire la temperatura camerei, se adauga 20 ml soluţie carbonat de sodiu (3.15) şi se amesteca. Imediat se adauga 100 ml acetat de etil (3.4) şi se agita energic timp de 15 secunde. Apoi se introduce tubul timp de trei minute în baia de ultrasunete (4.1) şi se desface dopul. Se centrifugheaza timp de 2 minute şi se decanteaza faza de acetat de etil prin filtrul din fibra de sticla (4.6), într-o palnie de separare de 500 ml. Se repeta extractia probei cu a doua parte de 100 ml de acetat de etil. Se spala extractele combinate timp de un minut cu 50 ml soluţie de carbonat de sodiu saturata în clorura de sodiu (3.16) şi se inlatura faza apoasa. Se extrage faza organicã timp de 1 minut cu 5 ml acid clorhidric (3.17). Se transfera faza acida inferioarã într-o palnie de separare de 250 ml. Se extrage din nou faza organicã timp de 1,5 minute cu o alta parte de 50 ml acid clorhidric şi se combina cu primul extract. Se spala extractele acide combinate prin agitare timp de aproximativ 10 secunde cu 10 ml acetat de etil (3.4). Se transfera cantitativ faza apoasa într-un balon cu fund rotund de 250 ml şi se elimina faza organicã. Se evapora tot restul de acetat de etil din soluţia acida utilizând un evaporator cu film rotativ (2.4) temperatura baii de apa nu trebuie sa depãşeascã 40°C. Sub un vid de aproximativ 25 mbar toate reziduurile de acetat de etil trebuie sa se elimine în 5 minute, la 38°C. 5.3. Purificarea 5.3.1. Prepararea coloanei de Amberlite Pentru fiecare extract de proba se prepara o coloana XAD-2. (3.8). Se transfera 10 g de Amberlite preparat într-o coloana de sticla cu metanol (4.5). Se adauga un mic tampon de vata de sticla deasupra stratului de rasina. Se scurge metanolul din coloana cu metanol şi se spala rasina cu 100 ml apa, oprind scurgerea în momentul în care lichidul ajunge la suprafata stratului de rasina. Coloana se lasa sa se stabilizeze timp de 10 minute înainte de utilizare. Niciodatã nu se lasa coloana sa se usuce. 5.3.2. Purificarea probei Extractul se transfera (5.2) la suprafata coloanei de Amberlite preparata (5.3.1) şi se elueaza, indepartand eluantul. Viteza de elutie nu trebuie sa depãşeascã 20 ml/minut. Se clateste balonul cu fund rotund cu 20 ml acid clorhidric (3.17) şi se utilizeazã aceasta soluţie la spalarea coloanei rasinii. Se sufla asupra soluţiei de acid ce a rãmas cu un curent de aer. Se indeparteaza lichidele de spalare. Se adauga 100 ml metanol (3.8), în coloana şi se lasa sa elueze 5-10 ml colectand eluantul într-un balon cu fund rotund de 250 ml. Metanolul rãmas se lasa timp de zece minute sa se stabilizeze cu rasina şi se continua elutia la o viteza ce nu depãşeşte 20 ml/minut, colectand eluantul în acelaşi balon cu fund rotund. Se evapora metanolul cu ajutorul evaporatorului cu film rotativ (4.2), temperatura baii de apa nu trebuie sa depãşeascã 40°C. Se transfera cantitativ reziduul într-un balon cotat de 10 ml utilizând faza mobila (3.21). Se aduce la semn cu faza mobila şi se amesteca. O parte alicota este filtrata prin membrana filtrului (4.7). Aceasta soluţie se stocheaza pentru determinare HPLC (5.4). 5.4. Determinare HPLC 5.4.1. Parametri Urmãtoarele condiţii sunt oferite pentru orientare, putând fi utilizate, cu condiţia sa ofere rezultate echivalente: Coloana de cromatografie lichidã (4.4.1), faza mobila HPLC (3.21), Debit: 1,5-2 ml/minut, Lungime de unda: 243 nm, Volum injectat: 40-100 ml. Se verifica stabilitatea sistemului cromatografic, se injecteaza soluţia de etalonare (3.9.3) ce conţine 3,0 mg/ml, de câte ori este nevoie, pana când sunt obţinute înãlţimi sau arii ale picului şi timpi de retenţie constanti. 5.4.2. Curba de etalonare Se injecteaza fiecare soluţie de etalonare (3.6.2.) de câte ori este nevoie şi se mãsoarã inaltimile picurilor (ariilor) pentru fiecare concentraţie. Se reprezintã grafic o curba de etalonare utilizând mediile picurilor sau ariilor principale ale soluţiilor de etalonare ca ordonate şi concentratiile corespunzãtoare în mg/ml ca abscise. 5.4.3. Soluţia probei Se injecteaza extractul probei (5.3.2) de câte ori este necesar, utilizând aceleaşi volume luate drept soluţii de etalonare şi se determina înãlţimea (aria) medie a picului de halofuginona. 6. Calcularea rezultatelor Se determina concentratia probelor în mg/ml din media inaltimilor (ariilor) picurilor de halofuginona a probelor, prin referire la curba de etalonare (5.4.2). Conţinutul probei în halofuginona w (mg/ml) este dat de urmãtoarea formula:
m
în care: c = concentratia probei în halofuginona, în mg/ml, m = masa probei exprimatã în g 7. Validarea rezultatelor 7.1. Identitate Identitatea produsului analizat poate fi confirmatã prin cocromatografie sau prin utilizarea unui detector cu sistem de diode, prin care sunt comparate spectrul extractului probei şi al soluţiei de calibrare (3.6.2) ce conţine 6 mg/ml. 7.1.1. Co-cromatografia Un extract al probei este imbogatit prin adãugarea unei cantitãţi corespunzãtoare din soluţia etalon (3.9.3). Cantitatea de halofuginona adãugatã trebuie sa fie similarã cantitãţii estimate de halofuginona detectata în extractul probei. Numai înãlţimea picurilor de halofuginona trebuie sa creascã dupã luarea în calcul a ambelor cantitãţi adãugate şi diluarea extractului. Largimea picului, la jumãtate din înãlţimea maxima, trebuie sa se încadreze în maxim ±10% din largimea iniţialã. 7.1.2. Detectarea prin sistemul de diode Rezultatele sunt evaluate în conformitate cu urmãtoarele criterii: a) lungimea de unda a absorbtiei maxime a probei şi a spectrelor standard, înregistrate pe cromatograma la varful picului, trebuie sa fie aceeaşi cu o limita de siguranta determinata prin puterea de rezoluţie a sistemului de detectare. Pentru detectare prin sistemul de diode, aceasta este tipica în cadrul a ±2 nm. b) între 225 şi 300 nm, spectrul standard şi al probei, înregistrate pe cromatograma, la varful picului, nu trebuie sa fie diferite pentru acele pãrţi ale spectrului cuprinse între 10 şi 100% ale absorbtiei relative. Acest criteriu este îndeplinit când sunt prezente aceleaşi maxime şi când la nici un punct observat deviatia între cele doua spectre nu depãşeşte 15% din absorbtia probei de analizat standard. c) între 225 şi 300 nm, spectrul curbei ascendente, al varfului şi al curbei descendente a picului, produse de extractul probei nu trebuie sa fie diferit unul de celãlalt pentru acele pãrţi ale spectrului în interiorul gamei de la 10 la 100% de absorbţie relativã. Acest criteriu este îndeplinit când sunt prezente aceleaşi maxime şi când la toate punctele observate deviatia între spectre nu depãşeşte 15% din absorbtia spectrului varfului. Dacã unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezenta substanţei de analizat nu este confirmatã. 7.2. Repetabilitate Diferenţa între rezultatele a 2 determinãri paralele, efectuate pe aceeaşi proba, nu trebuie sa depãşeascã 0,5 mg/kg pentru un conţinut în halofuginona, pana la 3 mg/kg. 7.3. Randament Pentru proba martor imbogatita, randamentul trebuie sa fie de minim 80%. 8. Rezultatele unui studiu de colaborare A fost organizat un studiu de colaborare(1) în care trei probe au fost analizate în opt laboratoare. Rezultate
┌───────────────────┬────────────┬──────────────────────┬──────────────────────┐
│ │ Proba A │ Proba B (Fãina) │ Proba C (Pelete) │
│ │ (Martor) ├──────────┬───────────┼──────────┬───────────┤
│ │ la primire │la primire│dupã 2 luni│la primire│dupã 2 luni│
├───────────────────┼────────────┼──────────┼───────────┼──────────┼───────────┤
│ Media(1) │ n.d. │ 2,80 │ 2,42 │ 2,89 │ 2,45 │
├───────────────────┼────────────┼──────────┼───────────┼──────────┼───────────┤
│ Sr │ - │ 0,45 │ 0,43 │ 0,40 │ 0,42 │
├───────────────────┼────────────┼──────────┼───────────┼──────────┼───────────┤
│ CV(R) │ - │ 16 │ 18 │ 14 │ 17 │
├───────────────────┼────────────┼──────────┼───────────┼──────────┼───────────┤
│ rec. │ │ 86 │ 74 │ 88 │ 75 │
└───────────────────┴────────────┴──────────┴───────────┴──────────┴───────────┘
(1) unitãţi: în mg/kg
n.d.: nedetectata
SR: deviatia standard a reproductibilitatii
CV(R): coeficient de variatie (%)
rec.: randament (%)
Newsletter GRATUIT
Aboneaza-te si primesti zilnic Monitorul Oficial pe email
Comentarii
Fii primul care comenteaza.
