ANEXA
la norma sanitarã veterinara
PARTEA A: Determinarea vitaminei A (retinol)
1. Scop şi domeniu
Aceasta metoda se foloseşte pentru determinarea vitaminei A (retinol) din furaje şi premixuri. Vitamina A include toţi compusii alcool trans-retinol şi izomerii cis. Conţinutul de vitamina A este exprimat în unitãţi internaţionale (UI)/kg. O unitate internationala corespunde activitãţii a 0,300 f2æg a tuturor compusilor alcoolici trans ai vitaminei A sau 0,344 æg a tuturor compusilor acetati trans ai vitaminei A ori 0,550 æg a tuturor compusilor palmitati trans ai vitaminei A. Limita de determinare este de 2.000 UI vitamina A/kg.
2. Principiul metodei
Proba este hidrolizata cu soluţie etanolica de hidroxid de potasiu, iar vitamina A este extrasa în eter de petrol. Solventul este înlãturat prin evaporare, iar reziduul este diluat în metanol şi, dacã este necesar, diluat pana la concentratia necesarã. Conţinutul de vitamina A este determinat prin lichid cromatografie de inalta performanta cu faza inversa (RP-HPLC), folosindu-se un detector cu UV sau cu fluorescenta. Parametrii cromatografici sunt aleşi astfel încât sa nu existe nicio diferenţa între toţi compusii alcoolici trans ai vitaminei A şi izomerii cis.
3. Reactivi:
3.1. Etanol, c = 96%, anhidru
3.2. Eter de petrol, interval de fierbere 40°-60°C
3.3. Metanol
3.4. Soluţie de hidroxid de potasiu, f2â = 50 g/100 ml
3.5. Soluţia de ascorbat de sodiu, f2â = 10 g/100 ml (a se vedea observaţiile de la pct. 7.7)
3.6. Sulfit de sodiu, Na(2)S x H(2)O (x = 7-9)
3.6.1. Soluţie de sulfit de sodiu, c = 0,5 mol/l în glicerol, f2â = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observaţiile de la pct. 7.8)
3.7. Soluţie de fenoftaleina, f2â = 2 g/100 ml în etanol (pct. 3.1)
3.8. 2-Propanol
3.9. Faza mobila pentru HPLC: amestec de metanol (pct. 3.3) şi apa, de exemplu 980 + 20 (v + v). Raportul exact trebuie determinat prin intermediul caracteristicilor coloanei folosite.
3.10. Azot, liber de oxigen
3.11. Acetat de vitamina A trans total, extrapur, cu activitate certificatã, de exemplu 2,80 x 10^6 UI/g
3.11.1. Soluţie stoc din vitamina A acetat trans total: se cantaresc, cu aproximatie de 0,1 mg, 50 mg din acetat de vitamina A (pct. 3.11) într-un balon cotat de 100 ml. Se dizolva în 2-propanol (pct. 3.8) şi se completeazã pana la semn cu acelaşi solvent. Concentratia nominalã a acestei soluţii este de 1.400 UI vitamina A/ml. Conţinutul exact trebuie determinat în conformitate cu pct. 5.6.3.1.
3.12. Palmitat de vitamina A, extrapur, cu activitate certificatã, de exemplu 1,80 x 10^6 UI/g
3.12.1. Soluţie stoc din retinol palmitat trans total: se cantaresc, cu aproximatie de 0,1 mg, 80 mg din palmitat de vitamina A (pct. 3.12) într-un balon cotat de 100 ml. Se dizolva în 2-propanol (pct. 3.8) şi se completeazã pana la semn cu acelaşi solvent. Concentratia nominalã a acestei soluţii este de 1.400 UI vitamina A/ml. Conţinutul exact trebuie determinat în conformitate cu pct. 5.6.3.2.
3.13. 2,6-di-terţ-butil-4-metilfenol (BHT) (a se vedea observaţiile de la pct. 7.5).
4. Aparatura:
4.1. Evaporator rotativ cu vacuum
4.2. Sticlarie bruna
4.2.1. Baloane cu fund plat sau conice de 500 ml, cu slif
4.2.2. Baloane cotate cu dopuri rodate, cu gat ingust, cu capacitate de 10, 25, 100 şi 500 ml
4.2.3. Palnii de separare, conice, de 1.000 ml, cu dopuri din sticla
4.2.4. Baloane piriforme din sticla de 250 ml cu slif
4.3. Condensator Allihn, de 300 mm, cu legatura din sticla, cu adaptator pentru o pipa de aprovizionare cu gaz
4.4. Hârtie de filtru pentru separarea fazica, cu diametrul de 185 mm (de exemplu Schleicher & Schuell 597 HY(1/2) sau similar)
4.5. Lichid cromatografie de inalta presiune (echipament HPLC cu sistem de injecţie)
4.5.1. Coloana de lichid cromatografie, 250 mm x 4 mm, C(18), de 5 sau 10 f2æm sau echivalent (criteriu de performanta: doar un singur peak pentru toţi izomerii retinolului în baza condiţiilor HPLC)
4.5.2. Detector UV sau de fluorescenta, cu ajustare variabila a lungimii de unda
4.6. Spectrofotometru cu cuve de cuart de 10 mm
4.7. Baie de apa cu agitator magnetic
4.8. Aparat de extracţie ce consta din:
4.8.1. Cilindru de sticla cu capacitate de 1 l, echipat cu gat şi dop rodat;
4.8.2. Mufa rodata, echipata cu un braţ exterior şi un tub ajustabil ce trece prin centru. Tubul ajustabil trebuie sa aibã un capãt în forma de U în partea de jos şi o parte efilata la partea opusã, astfel încât stratul superior de lichid din cilindru sa poatã fi transferat într-un tub de separare.
5. Procedura
NOTA:
Vitamina A este sensibila la lumina (UV) şi oxidare. Toate operaţiunile trebuie efectuate în absenta luminii (folosindu-se sticlarie bruna sau sticlarie protejata cu folie de aluminiu) şi a oxigenului (a se purja cu azot). În timpul extractiei aerul de deasupra lichidului trebuie înlocuit cu azot (evitati presiunea în exces prin lãrgirea dopului din când în când).
5.1. Pregãtirea probei
Se marunteste proba astfel încât sa treacã printr-o sita cu ochiuri de 1 mm, avându-se grija sa se evite generarea de caldura. Maruntirea trebuie efectuatã imediat înainte de cantarire şi saponificare, altfel ar putea avea loc pierderi de vitamina A.
5.2. Saponificarea
În funcţie de conţinutul de vitamina A, se cantaresc, cu aproximatie de 0,01 g, 2 pana la 25 g din proba, într-un balon de 500 ml cu fundul plat sau conic (pct. 4.2.1). Se adauga în continuare, prin amestecare, 130 ml etanol (pct. 3.1), aproximativ 100 mg BHT (pct. 3.13), 2 ml soluţie de ascorbat de sodiu (pct. 3.5) şi 2 ml soluţie de sulfit de sodiu (pct. 3.6). Se potriveste un condensator (pct. 4.3) la balon şi se scufunda balonul într-o baie de apa cu agitator magnetic (pct. 4.7). Se incalzeste pana la fierbere şi se lasa la reflux timp de 5 minute. Se adauga apoi 25 ml soluţie de hidroxid de potasiu (pct. 3.4) prin condensator (pct. 4.3) şi se lasa la reflux timp de 25 de minute, agitandu-se sub un flux uşor de azot. Apoi se clateste condensatorul cu aproximativ 20 ml apa şi se raceste conţinutul balonului la temperatura camerei.
5.3. Extracţie
Se transfera prin decantare intreaga soluţie saponificata, prin clatire cu un volum total de 250 ml apa într-o palnie de separare de 1.000 ml (pct. 4.2.3) sau în aparatul de extracţie (pct. 4.8). Se clateste balonul de saponificare în continuare cu 25 ml etanol (pct. 3.1) şi 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) şi se transfera soluţiile de clatire în palnia de separare sau în aparatul de extracţie. Proporţia de apa şi etanol în soluţiile combinate ar trebui sa fie de 2:1. Se agita viguros timp de doua minute şi se lasa sa se sedimenteze timp de doua minute.
5.3.1. Extracţie folosind un tub de separare (pct. 4.2.3)
Când straturile de lichid s-au separat (a se vedea observatia de la pct. 7.3), se transfera stratul de eter de petrol într-o alta palnie de separare (pct. 4.2.3). Se repeta aceasta extracţie de doua ori, cu 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) şi de doua ori cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2). Se spala extractele combinate în palnia de separare, de doua ori, prin amestecare uşoarã - pentru a se evita formarea emulsiilor - cu cantitãţi de 100 ml apa şi dupã agitare repetatã alte cantitãţi de 100 ml apa, pana când apa rãmâne incolora la adãugarea soluţiei de fenoftaleina (pct. 3.7) - spalarea de patru ori este suficienta. Se filtreaza extractul spãlat printr-un filtru de hârtie pentru separare fazica (pct. 4.4), pentru a se inlatura orice cantitate de apa în suspensie, într-un balon cotat de 500 ml (pct. 4.2.2). Se spala palnia de separare şi filtrul cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2), se umple pana la semn cu eter de petrol (pct. 3.2) şi se amesteca bine.
5.3.2. Extracţie folosind un aparat de extracţie (pct. 4.8)
Când straturile s-au separat (a se vedea observatia de la pct. 7.3), se înlocuieşte dopul cilindrului de sticla (pct. 4.8.1) prin insertie din sticla mata (pct. 4.8.2) şi se aranjeaza capatul de mai jos în forma de U al tubului ajustabil, astfel încât sa se afle deasupra nivelului interfetei. Prin aplicarea unei presiuni de la generatorul de azot prin bratul exterior, se transfera stratul superior de eter de petrol într-un tub de separare de 1.000 ml (pct. 4.2.3). Se adauga 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) în cilindrul de sticla (al aparatului), se ataşeazã dopul şi se agita bine. Se lasa straturile sa se separe şi se transfera stratul de deasupra în tubul de separare, la fel ca înainte. Se repeta procedura extractiei cu încã 100 ml eter de petrol (pct. 3.2), apoi de doua ori cu cantitãţi de 50 ml eter de petrol (pct. 3.2) şi se adauga straturile de eter de petrol în tubul de separare. Se spala extractele combinate din eter de petrol, dupã cum este descris la pct. 5.3.1, şi se procedeazã dupã cum este descris la acel punct.
5.4. Prepararea soluţiei proba pentru HPLC
Se pipeteaza o cantitate alicota din soluţia de eter de petrol (de la pct. 5.3.1 la pct. 5.3.2) într-un balon în forma de para de 250 ml (pct. 4.2.4). Se evapora solventul pana aproape de sec, la evaporatorul rotativ (pct. 4.1), cu presiune redusã, la o temperatura a baii de apa ce nu depãşeşte 40°C. Se restabileste presiunea atmosferica prin admisie de nitrogen (pct. 3.10) şi se indeparteaza balonul de pe evaporatorul rotativ. Se inlatura solventul rãmas în curent de azot (pct. 3.10) şi se dizolva imediat reziduul cu un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (pct. 3.3) (concentratia de vitamina A trebuie sa fie între 5 UI/ml şi 30 UI/ml).
5.5. Efectuarea determinãrii prin HPLC
Vitamina A este separatã pe o coloana C(18) cu faza inversa (pct. 4.5.1), iar concentratia este masurata printr-un detector de UV (325 nm) sau un detector de fluorescenta (excitatie: 325 nm, emisie: 475 nm) (pct. 4.5.2). Se injecteaza o cantitate alicota (de exemplu 20 f2æl) de soluţie metanolica obţinutã conform pct. 5.4 şi se elueaza cu faza mobila (pct. 3.9). Se calculeazã media peak-urilor inaltimii mai multor injectii din aceeaşi soluţie de proba şi media peak-urilor inaltimii mai multor injectii ale soluţiilor de calibrare (pct. 5.6.2).
Condiţii de separare HPLC
Sunt oferite urmãtoarele condiţii pentru instruire; pot fi folosite alte condiţii, cu obligaţia ca acestea sa ofere rezultate echivalente.
Coloana de lichid cromatografie (pct. 4.5.1): 250 mm x 4 mm, C(18) de 5 sau 10 f2æm ori echivalent
Faza mobila (pct. 3.9): amestec de metanol (pct. 3.3) şi apa, de exemplu 980 + 20 (v + v)
Rata de curgere: 1-2 ml/min.
Detector (pct. 4.5.2): detector cu UV (325 nm) sau detector cu fluorescenta (excitatie: 325 nm/emisie: 475 nm)
5.6. Calibrare
5.6.1. Prepararea soluţiilor standard de lucru
Se pipeteaza 20 ml soluţie stoc de acetat vitamina A (pct. 3.11) sau 20 ml soluţie stoc de palmitat vitamina A (pct. 3.12.1) într-un balon cu fund plat sau conic (pct. 4.2.1) şi se hidrolizeaza dupã cum este descris la pct. 5.2, dar fãrã a se adauga BHT. Se aplica apoi extractia cu eter de petrol (pct. 3.2) în conformitate cu pct. 5.3 şi se completeazã pana la 500 ml cu eter de petrol (pct. 3.2). Se evapora 100 ml din acest extract pe evaporatorul rotativ (a se vedea pct. 5.4) pana aproape de sec, se inlatura solventul rãmas cu un curent de azot (pct. 3.10) şi se redizolva reziduul în 10,0 ml metanol (pct. 3.3). Concentratia nominalã a acestei soluţii este 560 UI vitamina A/ml. Conţinutul exact trebuie determinat în conformitate cu pct. 5.6.3.3. Soluţia standard de lucru trebuie preparata proaspãta, înainte de folosire. Se pipeteaza 2,0 ml din aceasta soluţie standard de lucru, într-un balon cotat de 20 ml, se completeazã cu metanol pana la semn (pct. 3.3) şi se amesteca. Concentratia nominalã a acestei soluţii standard de lucru diluate este de 56 UI de vitamina A/ml.
5.6.2. Prepararea soluţiilor de calibrare şi a graficului de calibrare: se transfera 1,0; 2,0; 5,0 şi 10,0 ml din soluţia standard de lucru, diluata într-o serie de baloane cotate de 20 ml, se completeazã pana la semn cu metanol (pct. 3.3) şi se amesteca. Concentratiile nominale ale acestor soluţii sunt 2,8; 5,6; 14,0 şi 28,6 UI de vitamina A/ml. Se injecteaza 20 f2æl din fiecare soluţie de calibrare de mai multe ori şi se determina media inaltimilor peack-urilor. Folosindu-se media inaltimilor peack-urilor, se întocmeşte o curba de calibrare, luându-se în considerare rezultatele obţinute în UV (pct. 5.6.3.3).
5.6.3. Standardizarea UV a soluţiilor standard
5.6.3.1. Soluţie stoc acetat de vitamina A
Se pipeteaza 2,0 ml din soluţia stoc acetat de vitamina A (pct. 3.11.1) într-un balon cotat de 50 ml (pct. 4.2.2) şi se completeazã pana la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentratia nominalã a acestei soluţii este de 56 UI vitamina A/ml. Se pipeteaza 3,0 ml din aceasta soluţie de acetat de vitamina A într-un balon cotat de 25 ml şi se completeazã pana la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentratia nominalã a acestei soluţii este de 6,72 UI vitamina A/ml. Se mãsoarã spectrul UV al acestei soluţii fata de 2-propanol (pct. 3.8) cu un spectrofotometru (pct. 4.6), la o lungime de unda între 300 nm şi 400 nm. Extinctia maxima trebuie sa fie între 325 nm şi 327 nm.
Calcularea conţinutului de vitamina A:
UI vitamina A/ml = E 326 x 19,0
[E(1cm) 1% pentru vitamina A acetat = 1.530 la 326 nm în 2-propanol]
5.6.3.2. Palmitatul de vitamina A soluţia stoc
Se pipeteaza 2,0 ml de vitamina A palmitat din soluţia stoc (pct. 3.12.1) într-un balon cotat de 50 ml (4.2.2) şi se completeazã pana la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentratia nominalã a acestei soluţii este de 56 UI vitamina A/ml. Se pipeteaza 3,0 ml din aceasta soluţie diluata de vitamina A palmitat într-un balon cotat de 25 ml şi se completeazã pana la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentratia nominalã a acestei soluţii este de 6,72 UI vitamina A/ml. Se mãsoarã spectrul UV al acestei soluţii fata 2-propanolului (pct. 3.8) cu spectrofotometrul (pct. 4.6) fixat la o lungime de unda între 300 nm şi 400 nm. Extinctia maxima trebuie sa fie între 325 nm şi 327 nm.
Calcularea conţinutului de vitamina A:
UI vitamina A/ml = E 326 x 19,0
[E(1cm) 1% pentru vitamina A palmitat = 1.530 la 326 nm în 2-propanol]
5.6.3.3. Vitamina A = Soluţie standard de lucru. Se pipeteaza 3,0 ml din soluţia standard de vitamina A nediluata, preparata în conformitate cu pct. 5.6.1, într-un balon cotat de 50 ml (pct. 4.2.2) şi se completeazã pana la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Se pipeteaza 5 ml din aceasta soluţie într-un balon cotat de 25 ml şi se aduce la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentratia nominalã a acestei soluţii este de 6,72 UI de vitamina A/ml. Se mãsoarã spectrul acestei soluţii fata de 2-propanol (pct. 3.8) cu spectrofotometrul (pct. 4.6) la lungime de unda între 300 nm şi 400 nm. Extinctia maxima trebuie sa fie între 325 nm şi 327 nm.
Calcularea conţinutului în vitamina A:
UI vitamina A/ml = E 325 x 18,3
[E(1cm) 1% pentru retinol = 1.821 la 325 nm în 2-propanol]
6. Calcularea rezultatelor
Pornindu-se de la înãlţimea medie a peak-urilor de vitamina A a soluţiei de proba, se determina concentratia soluţiei de proba în UI/ml, prin referire fata de curba de calibrare (pct. 5.6.2).
Conţinutul w de vitamina A în UI/kg al probei este dat de urmãtoarea formula:
500 x f2â x V(2)
w = ---------------- x 1.000 [UI/kg],
V(1) x m
în care:
f2â = concentratia de vitamina A din soluţia de proba (pct. 5.4) la UI/ml;
V(1) = volumul soluţiei de proba (pct. 5.4), în ml;
V(2) = volumul cantitãţii alicote luate conform pct. 5.4, în ml;
m = masa de proba luatã în lucru, în g.
7. Observaţii
7.1. Pentru probe cu concentraţie redusã de vitamina A poate fi util sa se combine extractele de eter de petrol din doua incarcaturi de saponificare (cantitate cantarita = 25 g) într-o soluţie de proba pentru determinare HPLC.
7.2. Cantitatea probei utilizate pentru analiza nu ar trebui sa conţinã mai mult de 2 g grasime.
7.3. Dacã separarea fazica nu are loc, adaugati aproximativ 10 ml etanol (pct. 3.1) pentru a întrerupe emulsia.
7.4. Pentru ulei din ficat de cod şi alte grãsimi pure timpul de saponificare trebuie sa fie extins la 45-60 de minute.
7.5. Poate fi folositã hidrochinona în loc de BHT.
7.6. Folosindu-se o coloana fazica normalã, este posibila separarea de izomeri de retinol.
7.7. Se pot folosi aproximativ 150 mg de acid ascorbic în loc de soluţie de ascorbat de sodiu.
7.8. Se pot folosi aproximativ 50 mg EDTA în loc de soluţia de sulfit de sodiu.
8. Repetabilitate
Diferenţa dintre rezultatele a doua determinãri paralele, efectuate pe aceeaşi proba, nu trebuie sa depãşeascã 15%, valoare relativã fata de cel mai mare rezultat.
9. Rezultate ale unui studiu de colaborare*)
------
*) = Realizat de grupul de lucru pentru furaje din Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs-und Forschungsanstalten (VDLUFA)
┌────────────┬────────────┬────────────┬────────────┬────────────┬───────────┐
│ │ Premix │ Furaj │ Concentrat │ Furaj │ Purcel │
│ │ │ cu premix │ mineral │ proteic │ │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│ L │ 13 │ 12 │ 13 │ 12 │ 13 │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│ n │ 48 │ 45 │ 47 │ 46 │ 49 │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│medie ,02 x 10^6│ 1,21 x 10^6│ 537.100 │ 151.800 │ 18.070 │
│[UI/kg] │ │ │ │ │ │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│s(r) 𗈔,51 x 10^6 𗈔,039 x 10^6│ 22.080 │ 12.280 │ 682 │
│[UI/kg] │ │ │ │ │ │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│r 𗈕,43 x 10^6 𗈔,109 x 10^6│ 61.824 │ 34.384 │ 1.910 │
│[UI/kg] │ │ │ │ │ │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│CV(r)[%] │ 3,0 │ 3,5 │ 4,1 │ 8,1 │ 3,8 │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│s(R) 𗈕,36 x 10^6 𗈔,069 x 10^6│ 46.300 │ 23.060 │ 3.614 │
│[UI/kg] │ │ │ │ │ │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│R [UI/kg] 𗈗,81 x 10^6 𗈔,193 x 10^6│ 129.640 │ 64.568 │ 10.119 │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│CV(R) │ 8,0 │ 6,2 │ 8,6 │ 15 │ 20 │
│[%] │ │ │ │ │ │
└────────────┴────────────┴────────────┴────────────┴────────────┴───────────┘
L: numãr de laboratoare
n: numãr de valori singulare
S(r): deviatia standard a repetabilitatii
s(R): deviatia standard a reproductibilitatii
r: repetabilitate
R: reproductibilitate
CV(r): coeficient de variatie al repetabilitatii
CV(R): coeficient de variatie al reproductibilitatii
Fig. 1. Aparatul de extracţie (4.8.)
NOTA(CTCE)
Fig. 1. Aparatul de extracţie (4.8.), se gãseşte în Monitorul Oficial al României, Partea I, Nr. 147 din 28.02.2007, la pagina 6 (a se vedea imaginea asociata).
PARTEA B: Determinarea vitaminei E (tocoferol)
1. Scop şi domeniu
Aceasta metoda se foloseşte pentru determinarea vitaminei E din furaje şi premixuri. Conţinutul de vitamina E este exprimat ca mg de DL acetat de tocoferol/kg. Astfel, 1 mg DL acetat de tocoferol corespunde la 0,91 mg DL tocoferol (vitamina E).
Limita de determinare este de 2 mg vitamina E/kg.
2. Principiu
Proba este hidrolizata cu soluţie de hidroxid de potasiu etanolic, iar vitamina E este extrasa în eter de petrol. Solventul este înlãturat prin evaporare, iar reziduul este dizolvat în metanol şi, dacã este necesar, diluat pana la concentratia necesarã. Conţinutul de vitamina E este determinat prin lichid cromatografie de inalta performanta cu faza inversata (RP-HPLC), folosindu-se un detector cu fluorescenta sau UV.
3. Reactivi
3.1. Etanol, c = 96%
3.2. Eter de petrol, fractia 40°C - 60°C
3.3. Metanol
3.4. Soluţie de hidroxid de potasiu, f2â = 50 g/100 ml
3.5. Soluţie de ascorbat de sodiu, f2â = 10 g/100 ml (a se vedea observaţiile de la pct. 7.7)
3.6. Sulfit de sodiu, Na(2)S x H(2)O (x = 7-9)
3.6.1. Soluţie de sulfit de sodiu, c = 0,5 mol/l în glicerol, f2â = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observaţiile de la pct. 7.8)
3.7. Soluţie de fenolftaleina, f2â = 2 g/100 ml în etanol (pct. 3.1)
3.8. Faza mobila pentru HPLC: amestec de metanol (pct. 3.3) şi apa, de exemplu: 980 + 20 (v + v). Raportul exact trebuie sa fie determinat prin intermediul caracteristicilor coloanei folosite.
3.9. Azot liber de oxigen
3.10. DL-f2α-tocoferol acetat, extrapur, cu activitate certificatã
3.10.1. Soluţie stoc din DL-f2α-acetat de tocoferol: se cantaresc, cu aproximatie de 0,1 mg, 100 mg DL-α-acetat de tocoferol (pct. 3.10) într-un balon cotat de 100 ml. Se dizolva în etanol (pct. 3.1) şi se completeazã pana la semn cu acelaşi solvent. Astfel, 1 ml din aceasta soluţie conţine 1 mg DL-a-acetat de tocoferol (pentru control UV, a se vedea pct. 5.6.2.3; pentru stabilizare, a se vedea observaţiile de la pct. 7.4)
3.11. DL-f2α-tocoferol, extrapur, cu activitate certificatã
3.11.1. Se cantaresc, cu aproximatie de 0,1 mg, 100 mg de DL-f2α-tocoferol (pct. 3.10) într-un balon gradat de 100 ml. Se dizolva în etanol (pct. 3.1) şi se completeazã pana la semn cu acelaşi solvent. Astfel, 1 ml din aceasta soluţie conţine 1 mg DL-f2α-tocoferol (pentru control UV, a se vedea pct. 5.6.2.3; pentru stabilizare, a se vedea observaţiile de la pct. 7.4).
3.12. 2,6 di-terţ-butil-metilfenol (BHT) (a se vedea observaţiile de la pct. 7.5).
4. Aparatura:
4.1. Evaporator rotativ cu vacuum
4.2. Sticlarie bruna
4.2.1. Baloane cu fund plat sau conice de 500 ml, cu slif
4.2.2. Baloane cotate, cu dopuri rodate, cu gat stramt, cu capacitate de 10, 25, 100 şi 500 ml
4.2.3. Palnii de separare conice, de 1.000 ml, cu dopuri de sticla
4.2.4. Baloane piriforme din sticla de 250 ml cu gat rodat
4.3. Condensator Allihn, de 300 mm, cu legatura din sticla, cu adaptator pentru o pipa de aprovizionare cu gaz
4.4. Hârtie de filtru pentru separare fazica, cu diametrul de 185 mm (de exemplu Schieicher & Schuell 597 HY 1/2 sau similar).
4.5. Echipament HPLC cu sistem de injecţie
4.5.1. Coloana de lichid cromatografie, 250 mm x 4 mm, C(18), de 5 ori 10 f2æm sau echivalent
4.5.2. Detector UV sau de fluorescenta, cu ajustare variabila a lungimii de unda
4.6. Spectrofotometru cu cuve de cuart de 10 mm
4.7. Baie de apa cu agitator magnetic
4.8. Aparat de extracţie constând în:
4.8.1. Cilindru de sticla, de capacitate de 1 l, cãruia i se pun un gat şi dop de sticla
4.8.2. Mufa din sticla mata, echipata cu un braţ exterior şi cu un tub ajustabil ce trece prin centru. Tubul ajustabil trebuie sa aibã un capãt în forma de U situat în partea de jos şi un capãt efilat la partea opusã, astfel încât stratul superior de lichid din cilindru sa poatã fi transferat într-o palnie de separare.
5. Procedura
NOTA:
Vitamina E este sensibila la lumina (UV) şi oxidare. Toate operaţiunile trebuie efectuate în absenta luminii (folosindu-se sticlarie bruna sau sticlarie protejata cu folie de aluminiu) şi a oxigenului (a se spala cu azot). În timpul extractiei, aerul de deasupra lichidului trebuie înlocuit de azot (a se evita presiunea prin lãrgirea dopului din când în când).
5.1. Pregãtirea probei: se marunteste proba astfel încât sa treacã printr-o sita cu ochiuri de 1 mm, avându-se grija sa se evite generarea de caldura. Maruntirea trebuie efectuatã imediat înainte de cantarire şi saponificare, altfel pot avea loc pierderi de vitamina E.
5.2. Saponificare: în funcţie de conţinutul de vitamina E, se cantaresc, cu aproximatie de 0,01 g, 2 pana la 25 g din proba într-un balon de 500 ml cu fundul plat sau conic (pct. 4.2.1). Se adauga în continuare, prin amestecare, 130 ml etanol (pct. 3.1), aproximativ 100 mg BHT (pct. 3.12), 2 ml soluţie de ascorbat de sodiu (pct. 3.5) şi 2 ml soluţie de sulfit de sodiu (pct. 3.6). Se potriveste un condensator (pct. 4.3) la balon şi se scufunda balonul într-o baie de apa cu agitator mecanic (pct. 4.7). Se incalzesc pana la fierbere şi se lasa la reflux timp de 5 minute. Se adauga apoi 25 ml soluţie de hidroxid de potasiu (pct. 3.4) prin condensator (pct. 4.3) şi se lasa la reflux timp de 25 de minute, agitandu-se sub un flux uşor de azot. Apoi se clateste condensatorul cu aproximativ 20 ml apa şi se raceste conţinutul balonului la temperatura camerei.
5.3. Extracţie: se transfera, prin decantare, intreaga soluţie de saponificare, prin clatire cu un volum total de 250 ml apa, într~o palnie de separare de 1.000 ml, (pct.4.2.3) sau în aparatul de extracţie (pct. 4.8). Se clateste balonul de saponificare, în continuare, cu 25 ml etanol (pct. 3.1) şi 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) şi se transfera soluţiile de clatire în tubul de separare sau în aparatul de extracţie. Proporţia de apa şi etanol în soluţiile combinate trebuie sa fie 2:1. Se scutura viguros timp de doua minute şi se lasa sa se sedimenteze timp de doua minute.
5.3.1. Extracţie folosind o palnie de separare (pct. 4.2.3); când straturile de lichid s-au separat (a se vedea pct. 7.3), se transfera stratul de eter de petrol într-o alta palnie de separare (pct. 4.2.3). Se repeta aceasta extracţie de doua ori cu 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) şi de doua ori cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2). Se spala extractele combinate din palnia de separare de doua ori, prin amestecare uşoarã (pentru a se evita formarea emulsiilor), cu cantitãţi de 100 ml apa şi dupã agitare repetatã alte cantitãţi de 100 ml apa, pana când apa rãmâne incolora la adãugarea soluţiei de fenolftaleina (pct. 3.7) (spalarea de 4 ori este de obicei suficienta). Se filtreaza extractul spãlat printr~un filtru impaturit, pentru separare fazica (pct. 4.4), pentru a se inlatura orice cantitate de apa în suspensie, într-un balon cotat de 500 ml (pct. 4.2.2). Se spala palnia de separare şi filtrul cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2), se umple pana la semn cu eter de petrol (pct. 3.2) şi se amesteca bine.
5.3.2. Extracţie folosind un aparat de extracţie (pct. 4.8); când straturile s-au separat (a se vedea observatia de la pct. 7.3) se înlocuieşte dopul cilindrului de sticla (pct. 4.8.1) cu insertie din sticla mata (pct. 4.8.2) şi se aranjeaza capatul de jos în forma de U al tubului ajustabil, astfel încât sa se afle deasupra nivelului interfetei. Prin aplicarea unei presiuni de la generatorul nitrogenului, prin bratul exterior, se transfera stratul superior de eter de petrol într-un tub de separare de 1.000 ml (pct. 4.2.3). Se adauga 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) în cilindrul de sticla, se ataşeazã dopul şi se agita bine. Se lasa straturile sa se separe şi se transfera stratul de deasupra în tubul de separare ca şi mai înainte. Se repeta procedura extractiei cu încã 100 ml eter de petrol (pct. 3.2), apoi de doua ori cu cantitãţi de 50 ml eter de petrol (pct. 3.2) şi se adauga straturile de eter de petrol în tubul de separare. Se spala extractele combinate din eter de petrol, dupã cum este descris la pct. 5.3.1, şi se procedeazã dupã cum este descris acolo.
5.4. Prepararea soluţiei proba pentru HPLC: se pipeteaza o cantitate alicota din soluţia de eter de petrol (de la pct. 5.3.1 la pct. 5.3.2) într-un balon în forma de para, de 250 ml (pct. 4.2.4). Se evapora solventul aproape de uscare pe evaporatorul rotativ (pct. 4.1) cu presiune redusã, la o temperatura a baii ce nu depãşeşte 40°C. Se readuce la presiunea atmosferica prin admisie de azot (pct. 3.9) şi se indeparteaza balonul de pe evaporatorul rotativ. Se inlatura solventul rãmas printr-un curent de azot (pct. 3.9) şi se dizolva imediat reziduul cu un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (pct. 3.3) (concentratia de L-f2α-tocoferol trebuie sa fie între 5 f2æ/ml şi 30 f2æg/ml).
5.5. Determinare prin HPLC: vitamina E este separatã pe o coloana cu faza inversata de C(18) (pct. 4.5.1), iar concentratia este masurata printr-un detector de fluorescenta (excitatie: 295 nm, emisie: 330 nm) sau un detector de UV (292 nm) (pct. 4.5.2). Se injecteaza o fractie alicota (de exemplu: 20 f2æl) de soluţie metanolica obţinutã conform pct. 5.4 şi se realizeazã o elutie cu faza mobila (pct. 3.8). Se calculeazã media inaltimii peak-ului mai multor injectii din aceeaşi soluţie de proba şi mediile inaltimii peak-ului ale mai multor injectii ale soluţiilor de calibrare (pct. 5.6.2).
Condiţii HPLC: Sunt oferite urmãtoarele condiţii pentru orientare; pot fi folosite alte situaţii, cu condiţia ca acestea sa ofere rezultate echivalente.
Coloana de lichid cromatografic (pct. 4.5.1): 250 mm x 4 mm, C(18), ambalaje de 5 f2æm sau 10 æm sau echivalent
Faza mobila (pct. 3.8): amestec de metanol (pct. 3.3) şi apa, de exemplu: 980 + 20 (v + v)
Debit: 1-2 ml/min
Detector (pct. 4.5.2): detector cu fluorescenta
(excitatie: 295 nm, emisie: 330 nm) sau detector de UV (292 nm)
5.6. Calibrare (DL acetat de tocoferol sau DL-f2α-tocoferol)
5.6.1. DL acetat de tocoferol standard de referinta
5.6.1.1. Prepararea soluţiei standard de lucru
Se transfera cu o pipeta 25 ml soluţie de DL acetat de tocoferol (pct. 3.10.1) într-un balon de 500 ml cu fund plat sau conic (pct. 4.2.1) şi se hidrolizeaza dupã cum este descris la pct. 5.2. Apoi se extrage cu eter de petrol (pct. 3.2), în concordanta cu pct. 5.3, şi se completeazã pana la 500 ml cu eter de petrol (pct. 3.2). Se evapora 25 ml din acest extract pe evaporatorul rotativ (a se vedea pct. 5.4) pana aproape de uscare, se inlatura solventul rãmas cu un curent de azot (pct. 3.9) şi se redizolva reziduurile în 25,0 ml metanol (pct. 3.3). Concentratia nominalã a acestei soluţii este 45,5 f2æg DL-α-tocoferol/ml, echivalent cu 50 æg DL-α-tocoferol acetat/ml. Soluţia standard de lucru trebuie preparata proaspãta, înainte de folosire.
5.6.1.2. Prepararea soluţiilor de calibrare sau a curbei de calibrare: se transfera 1,0, 2,0, 4,0 şi 10,0 ml din soluţia standard de lucru într-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completeazã pana la semn cu metanol (pct. 3.3) şi se amesteca. Concentratiile nominale ale acestor soluţii sunt: 2,5; 5,0; 10,0 şi 25,0 f2æg/ml DL-α-tocoferol acetat, de exemplu: 2,28, 4.55, 9,10 æg/ml şi 22,8 f2æg/ml DL-α-tocoferol. Se injecteaza 20 æl din fiecare soluţie de calibrare, de mai multe ori, şi se determina media inaltimii peak-ului. Folosindu-se media inaltimilor peak-ului, se întocmeşte un grafic de calibrare.
5.6.1.3. Standardizarea UV a soluţiei de tocoferol acetat (pct. 3.10.1)
Se dizolva 5,0 ml soluţie de tocoferol acetat (pct. 3.10.1) pana la 25,0 ml cu etanol şi se mãsoarã spectrul UV al soluţiei fata de etanol (pct. 3.1) cu un spectrofotometru (pct. 4.6) la o lungime de unda între 250 nm şi 320 nm.
Absorbtia maxima trebuie sa fie la 284 nm:
E(tcm)^1% = 43,6 la 284 nm în etanol
La aceasta dilutie trebuie obţinutã o valoare de extinctie de 0,84 - 0,88.
5.6.2. DL-f2α-tocoferol standard de referinta
5.6.2.1. Prepararea soluţiei standard de lucru
Se transfera cu pipeta 2,0 ml soluţie de tocoferol acetat (pct. 3.11.1) într-un balon cotat de 50 ml, se dizolva în metanol (pct. 3.3) şi se completeazã pana la semn cu metanol. Concentratia nominalã a acestei soluţii este de 40 f2æg DL-α-tocoferol/ml, echivalent cu 44,0 æg de tocoferol acetat/ml. Soluţia standard de lucru trebuie preparata proaspãta înainte de folosire.
5.6.2.2. Prepararea soluţiilor de calibrare şi a graficului de calibrare
Se transfera 1,0; 2,0; 4,0 şi 10,0 ml din soluţia standard de lucru diluata într-o serie de baloane cotate de 20 ml, se completeazã pana la semn cu metanol (pct. 3.3) şi se amesteca. Concentratiile nominale ale acestor soluţii sunt: 2,0; 4,0; 8,0 şi 20,0 f2æg/ml şi 22,0 f2æg/ml tocoferol acetat. Se injecteaza 20 æl din fiecare soluţie de calibrare de mai multe ori şi se determina mediile inaltimii peak-ului. Folosindu-se mediile inaltimii peak-ului, se întocmeşte un grafic de calibrare.
5.6.2.3. Standardizarea UV a soluţiei DL-f2α-tocoferol (pct. 3.11.1)
Se dizolva 2,0 ml pana la 25,0 ml din soluţia stoc de tocoferol (pct. 3.11.1) cu etanol (pct. 3.1) şi se mãsoarã spectrul UV al acestei soluţii fata de etanol cu spectrofotometru (pct. 4.6) la lungime de unda între 250 nm şi 320 nm.
Absorbtia maxima trebuie sa fie la 292 nm:
E(tcm)^1% = 75,8 la 292 nm în etanol.
La aceasta dilutie trebuie obţinutã o valoare de extinctie de 0,6.
6. Calcularea rezultatelor
Pornindu-se de la media inaltimii peak-ului pentru vitamina E a soluţiei de proba, se determina concentratia soluţiei de proba în f2æg/ml (calculatã ca f2α-tocoferol acetat) fata de curba de calibrara (pct. 5.6.1.2 sau 5.6.2.2).
Conţinutul w de vitamina E în mg/kg de proba este dat de urmãtoarea formula:
w = 500 X f2â X V(2) [mg/kg]/V(1) x m,
în care:
f2â = concentratia de vitamina E din soluţia de proba (pct. 5.4) în UI/ml;
V(1) = volumul soluţiei de proba (pct. 5.4), în f2æg/ml;
V(2) = volumul cantitãţii alicote folosite la pct. 5.4, în ml;
m = masa porţiunii de testat, în g.
7. Observaţii
7.1. Pentru probe cu concentraţie redusã de vitamina E poate fi util sa se combine extractele de eter de petrol din doua incarcaturi de saponificare (cantitate cantarita: 25 g) într-o soluţie de proba, pentru determinare HPLC.
7.2. Masa probei utilizate pentru analiza nu ar trebui sa conţinã mai mult de 2 g grasime.
7.3. Dacã separarea fazica nu are loc, se adauga aproximativ 10 ml l etanol (pct. 3.1), pentru a întrerupe emulsia.
7.4. Dupã mãsurarea cu spectrofotometrul a soluţiei de tocoferol acetat sau DL-f2α-tocoferol, în conformitate cu pct. 5.6.1.3 sau 5.6.2.3, se adauga aproximativ 10 mg BHT (pct. 3.12) la soluţie (3.10.1 sau 3.10.2) şi se pãstreazã soluţia la frigider (perioada de pãstrare de maximum 4 sãptãmâni).
7.5. Poate fi folositã hidrochinona în loc de BHT.
7.6. Folosindu-se o coloana fazica normalã, este posibila separarea unui a-, f2â-, Y şi tocoferol.
7.7. Se pot folosi aproximativ 150 mg acid ascorbic în loc de soluţie de ascorbat de sodiu.
7.8. Se pot folosi aproximativ 50 mg EDTA în loc de soluţie de sulfit de sodiu.
8. Repetabilitate
Diferenţa dintre rezultatele a doua determinãri paralele, efectuate pe aceeaşi proba, nu trebuie sa depãşeascã 15%, valoare relativã fata de cel mai mare rezultat.
9. Rezultatele unui studiu de colaborare*)
------
*) = Realizat de grupul de lucru pentru furaje din Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs-und Forschungsanstalten (VDLUFA)
┌────────────┬────────────┬────────────┬────────────┬────────────┬───────────┐
│ │ Premix │ Furaj │ Concentrat │ Furaj │ Purcel │
│ │ │ cu premix │ mineral │ proteic │ │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│ L │ 12 │ 12 │ 12 │ 12 │ 12 │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│ n │ 48 │ 48 │ 48 │ 48 │ 48 │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│medie │ 17380 │ 1187 │ 926 │ 315 │ 61,3 │
│[UI/kg] │ │ │ │ │ │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│s(r) │ 384 │ 45,3 │ 25,2 │ 13,0 │ 2,3 │
│[UI/kg] │ │ │ │ │ │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│r │ 1075 │ 126,8 │ 70,6 │ 36,4 │ 6,4 │
│[UI/kg] │ │ │ │ │ │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│CV(r)[%] │ 2,2 │ 3,8 │ 2,7 │ 4,1 │ 3,8 │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│s(R) │ 830 │ 65,0 │ 55,5 │ 18,9 │ 7,8 │
│[UI/kg] │ │ │ │ │ │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│R [UI/kg] │ 2324 │ 182,0 │ 155,4 │ 52,9 │ 21,8 │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│CV(R) │ 4,8 │ 5,5 │ 6,0 │ 6,0 │ 12,7 │
│[%] │ │ │ │ │ │
└────────────┴────────────┴────────────┴────────────┴────────────┴───────────┘
L: numãr de laboratoare
n: numãr de valori singulare
S(r): deviatia standard a repetabilitatii
s(R): deviatia standard a reproductibilitatii
r: repetabilitate
R: reproductibilitate
CV(r): coeficient de variatie al repetabilitatii
CV(R): coeficient de variatie al reproductibilitatii
Fig. 1. Aparatul de extracţie (4.8.)
NOTA(CTCE)
Fig. 1. Aparatul de extracţie (4.8.), se gãseşte în Monitorul Oficial al României, Partea I, Nr. 147 din 28.02.2007, la pagina 10 (a se vedea imaginea asociata).
PARTEA C: Determinarea triptofanului
1. Scop şi domeniu
Aceasta metoda se foloseşte pentru determinarea cantitãţii totale şi libere de triptofan din furaje. Nu se face distincţie între formele D şi L.
2. Principiu
Pentru determinarea triptofanului total, proba este hidrolizata în condiţii alcaline cu soluţie saturata de hidroxid de bariu şi incalzita la 110°C, pentru 20 de ore. Dupã hidroliza se adauga standardul intern. Pentru determinarea triptofanului liber proba este extrasa în condiţii de aciditate uşoarã, în prezenta standardului intern. Triptofanul şi standardul intern din hidrolizat sau din extract sunt determinate prin HPLC cu detector cu fluorescenta.
3. Reactivi
3.1. Trebuie folositã apa bidistilata sau apa de calitate echivalenta (conductivitate < 10 f2æS/cm)
3.2. Substanta standard: triptofan (puritate/conţinut > 99%), uscata sub vacuum pe pentoxid de fosfor
3.3. Substanta standard intern: a-metil-triptofan (puritate/conţinut > 99%), uscata sub vacuum pe pentoxid de fosfor
3.4. Hidroxid de bariu octahidrat [trebuie avut grija pentru a nu se expune Ba(OH)(2) x 8H(2)O excesiv la aer, pentru a se evita formarea de BaCO(3) ce ar putea afecta determinarea] (a se vedea observatia de la pct. 9.3)
3.5. Hidroxid de sodiu
3.6. Acid ortofosforic, w = 85%
3.7. Acid clorhidric, 20 = 1,19 g/ml
3.8. Metanol, grade HPLC
3.9. Eter de petrol, domeniu de fierbere 40-60°C
3.10. Soluţie de hidroxid de sodiu, c = 1 mol/l
Se dizolva 40,0 g NaOH (pct. 3.5) în apa şi se completeazã cu apa pana la 1 I (pct. 3.1)
3.11. Acid clorhidric, c = 6 mol/l. Se iau 492 ml HCL (pct. 3.7) şi se completeazã cu apa pana la 1 l.
3.12. Acid clorhidric, c = 1 mol/l. Se iau 82 ml HCL (pct. 3.7) şi se completeazã cu apa pana la 1 l.
3.13. Acid clorhidric, c = 0,1 mol/l. Se iau 8,2 ml HCL (pct. 3.7) şi se completeazã cu apa pana la 1 l.
3.14. Acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l. Se iau 34 ml acid ortofosforic (pct. 3.6) şi se completeazã cu apa pana la 1 l (pct. 3.1).
3.15. Soluţie concentrata de triptofan (pct. 3.2), c = 2,50 mol/ml: într-un balon cotat de 500 ml se dizolva 0,2553 g triptofan (pct. 3.2) în acid clorhidric (pct. 3.13) şi se completeazã pana la semn cu acid clorhidric (pct. 3.13). Se depoziteaza la -18°C pentru maximum 4 sãptãmâni.
3.16. Soluţie concentrata standard intern, c = 2,50 f2æmol/ml.
Într-un balon cotat de 500 ml se dizolva 0,2728 g a-metil-triptofan (pct. 3.3) în acid clorhidric (pct. 3.13) şi se completeazã pana la semn cu acid clorhidric (pct. 3.13). Se depoziteaza la -18°C pentru maximum 4 sãptãmâni.
3.17. Soluţie de triptofan standard de calibrare şi standard intern: se iau 2,00 ml soluţie concentrata de triptofan (pct. 3.15) şi 2,00 ml soluţie standard intern concentrat (a-metil-triptofan) (pct. 3.16). Se dilueaza cu apa (pct. 3.1) şi metanol (pct. 3.8) cu aproximativ acelaşi volum şi pana la aproximativ aceeaşi concentraţie de metanol (10-30%) ca şi hidrolizatul final finisat. Soluţia standard trebuie sa fie proaspãt preparata înainte de folosire.
3.18. Acid acetic
3.19. 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol
3.20. Etanolamina > 98%
3.21. Soluţie de 1 g - 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (pct. 3.19) în 100 ml metanol 1% (pct. 3.8)
3.22. Faza mobila pentru HPLC: 3,00 g acid acetic (pct. 3.18) + 900 ml apa (pct. 3.1) + 50,0 ml soluţie (pct. 3.21) de 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (pct. 3.19) în metanol (pct. 3.8) (1 g/100 ml). Se ajusteaza pH-ul la 5,00, folosindu-se etanolamina (pct. 3.20). Se completeazã pana la 1.000 ml cu apa (pct. 3.1).
4. Aparatura
4.1. Echipament HPLC cu un detector spectrofluorimetric
4.2. Coloana de lichid cromatografie, 125 mm x 4 mm, C(18), în ambalaje de 3 f2æm sau echivalent
4.3. pH-metru
4.4. Balon de polipropilena, capacitate 125 ml, cu gat larg şi dop cu surub
4.5. Membrana filtranta, 0,45 f2æm
4.6. Autoclav sau etuva cu vid 110(±2)°C,1,4(±0,1) bar.
4.7. Agitator mecanic sau agitator magnetic
4.8. Agitator vortex
5. Procedura
5.1. Prepararea probelor
Proba trebuie sa treacã printr-o sita de 0,5 mm. Probele cu umiditate ridicatã trebuie sa fie uscate în aer, la o temperatura ce nu depãşeşte 50°C, sau uscate cu gheaţa, înainte de maruntire. Probele cu conţinut ridicat de grãsimi trebuie extrase cu eter de petrol (pct. 3.9) înainte de maruntire.
5.2. Determinarea triptofanului liber (extract)
Se cantareste, cu aproximatie de 1 mg, o cantitate de proba (1-5 g) (pct. 5.1) într-un balon conic. Se adauga 100,0 ml acid clorhidric, c = 0,1 mol/l (pct. 3.13) şi 5,00 ml din soluţie standard interna concentrata (pct. 3.16). Se agita sau se amesteca timp de 60 de minute, folosindu-se un agitator mecanic sau un agitator magnetic (pct. 4.7). Se permite sedimentului sa se depunã şi se pipeteaza 10,0 ml din soluţia de supernatant într-un pahar de laborator. Se adauga 5 ml acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l. Se ajusteaza pH-ul la 3,0 folosind hidroxid de sodiu, c = 1,0 mol/l. Se adauga suficient metanol (pct. 3.8) pentru a se realiza o concentraţie între 10 şi 30% de metanol volum final. Se transfera într-un balon cotat de volum corespunzãtor şi se dilueaza cu apa pana la un volum necesar pentru cromatografie [aproximativ acelaşi volum ca şi soluţia de calibrare standard (pct. 3.17)].
Se filtreaza cativa ml de soluţie printr-un filtru de membrana de 0,45 f2æm (pct. 4.5), înaintea injectarii pe coloana HPLC. Se trece la etapa cromatografiei, în conformitate cu pct. 5.4. Se protejeaza soluţia standard şi extrasele fata de lumina directa a soarelui. Dacã nu este posibil sa se analizeze extractele în aceeaşi zi, acestea pot fi pãstrate la 5°C pentru maximum 3 zile.
5.3. Determinarea triptofanului total (hidrolizat)
Se cantareste cu aproximatie 0,2 mg, de la 0,1 la 1 g din proba preparata (pct. 5.1), în balonul de propilenã (pct. 4.4). Cantitatea de proba cantarita trebuie sa aibã un conţinut de azot de 10 mg. Se adauga 8,4 g de octahidrat de hidroxid de bariu (pct. 3.4) şi 10 ml de apa. Se amesteca cu un agitator vortex (pct. 4.8) sau cu un agitator magnetic (pct. 4.7). Se lasa magnetul acoperit cu teflon, în amestec. Se spala pereţii vasului cu 4 ml de apa. Se pune dopul cu surub şi se închide uşor balonul. Se transfera într-o autoclava (pct. 4.6) cu apa ce fierbe şi se lasa la aburi pentru 30-60 de minute). Se închide autoclava şi se realizeazã autoclavare la 110(^+2)°C pentru 20 de ore. Înaintea deschiderii autoclavei se reduce temperatura pana la 100°C. Pentru a evita cristalizarea Ba(OH)(2) x 8H(2)O, se adauga la amestecul cald 30 ml de apa la temperatura camerei. Se scutura sau se agita uşor. Se adauga 2,00 ml soluţie standard intern concentrata (de a-metil-triptofan) (pct. 3.16). Se racesc paharele pe baie de apa timp de 15 minute. Se adauga apoi 5 ml de acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l (pct. 3.14). Se pãstreazã vasul la baia de rãcire şi se neutralizeaza cu HCl, c = 6 mol/l (pct. 3.11) în timp ce se agita şi se ajusteaza pH-ul la 3,0 folosindu-se HCl, c = 1 mol/l (pct. 3.12). Se adauga suficient metanol pentru a se realiza o concentraţie între 10 şi 30% de metanol în volumul final. Se transfera într-un balon cotat de volum corespunzãtor şi se dilueaza cu apa pana la semn, necesar pentru cromatografie (de exemplu 100 ml). Adãugarea de metanol nu trebuie sa ducã la apariţia precipitatului.
Se filtreaza cativa ml din soluţie printr-un filtru de membrana de 0,45 f2æm (pct. 4.5) înaintea injectarii pe coloana HPLC, se trece la etapa cromatografiei, în conformitate cu pct. 5.4. Se protejeaza soluţia standard şi hidrolizatele fata de lumina directa a soarelui. Dacã nu este posibil sa se analizeze hidrolizatele în aceeaşi zi, acestea pot fi depozitate la 5°C, pentru maximum 3 zile.
5.4. Determinare prin HPLC
Sunt oferite pentru instruire urmãtoarele condiţii de elutie isocratica; pot fi folosite alte situaţii, cu condiţia ca acestea sa ofere rezultate echivalente (a se vedea, de asemenea, observaţiile de la pct. 9.1 şi 9.2).
Coloana de lichid cromatografie (pct. 4.2): 125 mm x 4 mm, C(18), ambalaj de 3 f2æm.
Temperatura coloanei: temperatura camerei.
Faza mobila (pct. 3.22): 3,00 g acid acetic apa (pct. 3.1) + 50,0 ml soluţie (pct. 3.21) de 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (pct. 3.19) în metanol (pct. 3.8) (1 g/100 ml).
Se ajusteaza pH-ul la 5,00, folosindu-se etanolamina (pct. 3.20).
Se completeazã pana la 1.000 ml cu apa [pct. 3.1; de exemplu: 980+20 (v + v)].
Debitul: 1 ml/min.
Timpul total de funcţionare: aproximativ 34 minute.
Detectia la lungimea de unda: excitatie: 280 nm, emisie: 356 nm.
Volumul de injecţie: 20 f2æl
6. Calcularea rezultatelor
F x G x H x 10000 x W
A = zona peak-ului pentru standardul intern, soluţie standard de calibrare ( pct. 3.17);
B = zona peak-ului triptofanului, extract (pct. 5.2) sau hidrolizat (pct. 3.3);
C = volumul, în ml (2 ml), al soluţiei de triptofan concentrat (pct. 3.15) adãugat soluţiei de calibrare (pct. 3.17);
D = concentratia, în/f2æmol/ml (= 2,50), din soluţia de triptofan concentrat (pct. 3.15) adãugatã soluţiei de calibrare (pct. 3.17);
E = volumul, în ml, al soluţiei concentrate standard intern (pct. 3.16), adãugatã la extract (pct. 5.2) (= 5,00 ml) sau hidrolizat (pct. 5.3) (= 2,00 ml);
F = zona peak-ului pentru standardul intern, extract (pct. 5.2) sau hidrolizat (pct. 5.3);
G = zona peak-ului triptofanului, soluţie standard de calibrare (pct. 3.17);
H = volumul în ml (= 2,00) al soluţiei standard intern concentrata (pct. 3.16), adãugatã la soluţia standard de calibrare (pct. 3.17);
W = greutatea probei în g (corectatã la greutatea originala, dacã este uscata şi/sau degresata);
MW = greutatea moleculara a triptofanului (= 204,23).
7. Repetabilitate
Diferenţa dintre rezultatele a doua determinãri paralele, efectuate pe aceeaşi proba, nu trebuie sa depãşeascã 10% valoare relativã fata de cel mai mare rezultat.
8. Rezultate ale unui studiu de colaborare
A fost realizat un studiu de colaborare la nivelul comunitar (a patra intercomparatie) în cadrul cãruia s-au analizat 3 probe, de cãtre 12 laboratoare, pentru a certifica metoda pentru hidroliza. Au fost efectuate 5 replicate din fiecare proba. Rezultatele sunt oferite de tabelul urmãtor:
┌────────────────┬──────────────┬────────────────────┬────────────────┐
│ │ Proba 1 │ Proba 2 │ Proba 3 │
│ │ Furaj │ Furaj pentru │ Concentrat │
│ │ pentru │porcine suplimentat │ de furaj │
│ │ porcine │ cu L-triptofan │ pentru porcine │
├────────────────┼──────────────┼────────────────────┼────────────────┤
│L │ 12 │ 12 │ 12 │
├────────────────┼──────────────┼────────────────────┼────────────────┤
│N │ 50 │ 55 │ 50 │
├────────────────┼──────────────┼────────────────────┼────────────────┤
│medie [g/kg] │ 2,42 │ 3,40 │ 4,22 │
├────────────────┼──────────────┼────────────────────┼────────────────┤
│S(r)[g/kg] │ 0,05 │ 0,05 │ 0,08 │
├────────────────┼──────────────┼────────────────────┼────────────────┤
│r[g/kg] │ 0,14 │ 0,14 │ 0,22 │
├────────────────┼──────────────┼────────────────────┼────────────────┤
│CV(r)[%] │ 1,9 │ 1,6 │ 1,9 │
├────────────────┼──────────────┼────────────────────┼────────────────┤
│s(R)[g/kg] │ 0,15 │ 0,20 │ 0,09 │
├────────────────┼──────────────┼────────────────────┼────────────────┤
│R[g/kg] │ 0,42 │ 0,56 │ 0,25 │
├────────────────┼──────────────┼────────────────────┼────────────────┤
│CV(R)[%] │ 6,3 │ 6,0 │ 2,2 │
└────────────────┴──────────────┴────────────────────┴────────────────┘
L: numãr de laboratoare
n: numãr de valori singulare
S(r): deviatia standard a repetabilitatii
S(R): deviatia standard a reproductibilitatii
r: repetabilitate
R: reproductibilitate
CV(r): coeficient de variatie al repetabilitatii
CV(R): coeficient de variatie al reproductibilitatii
A fost realizat un alt studiu de colaborare la nivelul comunitar (a treia intercomparatie) în cadrul cãruia s-au analizat doua probe de cãtre 13 laboratoare, pentru a se certifica metoda de extracţie pentru triptofanul liber. Au fost efectuate analize replicate (5) din fiecare proba. Rezultatele sunt oferite de tabelul urmãtor:
┌────────────────┬──────────────────────┬─────────────────────┐
│ │ Proba 4 │ Proba 5 │
│ │ Amestec de grâu │ Amestec de grâu şi │
│ │ şi soia │ soia (= proba 4) │
│ │ │ cu triptofan adãugat│
│ │ │ (0,457 g/kg) │
├────────────────┼──────────────────────┼─────────────────────┤
│L │ 12 │ 12 │
├────────────────┼──────────────────────┼─────────────────────┤
│N │ 55 │ 60 │
├────────────────┼──────────────────────┼─────────────────────┤
│medie [g/kg] │ 0,391 │ 0,931 │
├────────────────┼──────────────────────┼─────────────────────┤
│S(r)[g/kg] │ 0,005 │ 0,012 │
├────────────────┼──────────────────────┼─────────────────────┤
│r[g/kg] │ 0,014 │ 0,034 │
├────────────────┼──────────────────────┼─────────────────────┤
│CV(r)[%] │ 1,34 │ 1,34 │
├────────────────┼──────────────────────┼─────────────────────┤
│s(R)[g/kg] │ 0,018 │ 0,048 │
├────────────────┼──────────────────────┼─────────────────────┤
│R[g/kg] │ 0,050 │ 0,134 │
├────────────────┼──────────────────────┼─────────────────────┤
│CV(R)[%] │ 4,71 │ 5,11 │
└────────────────┴──────────────────────┴─────────────────────┘
L: numãr de laboratoare
n: numãr de valori singulare
S(r): deviatia standard a repetabilitatii
S(R): deviatia standard a reproductibilitatii
r: repetabilitate
R: reproductibilitate
CV(r): coeficient de variatie al repetabilitatii
CV(R): coeficient de variatie al reproductibilitatii
A fost realizat un alt studiu de colaborare la nivel comunitar, în cadrul cãruia s-au analizat 4 probe de cãtre 7 laboratoare, cu scopul unei certificari a triptofanului prin hidroliza. Rezultatele sunt oferite mai jos. Analize replicate (5) au fost efectuate pe fiecare proba.
┌────────────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┐
│ │ Proba 1 │ Proba 2 │ Proba 3 │ Proba 4 │
│ │ Furaj │ Hrana pentru │ Hrana din │ Pudra de │
│ │ amestecat │ peste, cu │ soia-fasole │ lapte │
│ │ pentru │ nivel scãzut │ (CRM 119) │ ecremat │
│ │ porcine │ de grasime │ │ (CRM 120) │
│ │ (CRM 117) │ (CRM 118) │ │ │
├────────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│L │ 7 │ 7 │ 7 │ 7 │
├────────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│N │ 25 │ 30 │ 30 │ 30 │
├────────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│medie [g/kg] │ 2,064 │ 8,801 │ 6,882 │ 5,236 │
├────────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│S(r)[g/kg] │ 0,021 │ 0,101 │ 0,089 │ 0,040 │
├────────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│r[g/kg] │ 0,059 │ 0,283 │ 0,249 │ 0,112 │
├────────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│CV(r)[%] │ 1,04 │ 1,15 │ 1,30 │ 0,76 │
├────────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│s(R)[g/kg] │ 0,031 │ 0,413 │ 0,283 │ 0,221 │
├────────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│R[g/kg] │ 0,087 │ 1,156 │ 0,792 │ 0,619 │
├────────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│CV(R)[%] │ 1,48 │ 4,69 │ 4,11 │ 4,22 │
└────────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┘
L: numãr de laboratoare
n: numãr de valori singulare
S(r): deviatia standard a repetabilitatii
S(R): deviatia standard a reproductibilitatii
r: repetabilitate
R: reproductibilitate
CV(r): coeficient de variatie al repetabilitatii
CV(R): coeficient de variatie al reproductibilitatii
9. Observaţii
9.1. Folosirea unor condiţii cromatografice speciale poate crea o mai buna separare între tiptofan şi a-metil-triptofan.
Elutie isocratica urmatã de spalarea gradientului de coloana lichid cromatografie cu: 125 mm x 4 mm, C(18), ambalaje de 5 f2æm sau echivalent.
Temperatura coloanei: 32°C
Faza mobila: A: 0,01 mol/KH(2)PO(4)/metanol, 95 + 5 (V + V) 1
B: Metanol
Program gradient: 0 min. ....... 100% A 0% B
15 min. ....... 100% A 0% B
17 min. ....... 60% A 40% B
19 min. ....... 60% A 40% B
21 min. ....... 100% A 0% B
33 min. ....... 100% A 0% B
Debit: 1,2 ml/min.
Timpul total de separare: aproximativ 33 de minute
9.2. Cromatografia variaza în concordanta cu tipul de HPLC şi de materialul de impachetare a coloanei folosit.
Sistemul ales trebuie sa fie capabil sa ofere o separare de baza între tiptofan şi standardul intern. Mai mult, este important ca produsele de degradare sa fie bine separate de triptofan şi de standardul intern. Hidrolizatele fãrã standard intern trebuie testate pentru a se verifica linia de baza pentru impuritati sub standardul intern. Este important ca timpul de achiziţie sa fie suficient de lung pentru elutia tuturor produselor de degradare, altfel pot interfera limite cu elutie tarzie cu utilizãri cromatografice ulterioare. În domeniul functionarii sistemul de cromatografie trebuie sa ofere rãspuns linear. Rãspunsul linear trebuie mãsurat cu o concentraţie constanta (normalã) a standardului intern şi a concentratiilor variate de triptofan. Este important şi faptul ca mãrimea atât a peak-urilor triptofanului, cat şi a peak-urilor standardelor interne este cuprinsã în domeniul linear al sistemului HPLC/fluorescenta. Dacã peak-ul triptofanului şi/sau al standardului intern este prea mic sau ridicat, analiza trebuie repetatã cu o alta cantitate de proba şi/sau cu un volum final schimbat.
9.3. Hidroxid de bariu
Cu timpul hidroxidul de bariu devine mai dificil de dizolvat.
Aceasta duce la o soluţie neclara pentru determinarea HPLC ce poate produce rezultate scãzute pentru triptofan.
---------
