Copierea de continut din prezentul site este supusa regulilor precizate in Termeni si conditii! Click aici.
Prin utilizarea siteului sunteti de acord, in mod implicit cu Termenii si conditiile! Orice abatere de la acestea constituie incalcarea dreptului nostru de autor si va angajeaza raspunderea!
X
ORDIN nr. 14 din 10 iunie 2004 pentru aprobarea Normei veterinare privind metode nationale de analiza pentru controlul oficial al furajelor cu referire la continutul in aflatoxina
În temeiul prevederilor <>art. 10 lit. b) din Ordonanta Guvernului nr. 42/2004 privind organizarea activitãţii veterinare, în baza <>Hotãrârii Guvernului nr. 308/2004 privind organizarea şi funcţionarea Agenţiei Veterinare şi pentru Siguranta Alimentelor şi a unitãţilor din subordinea acesteia, vazand Referatul de aprobare nr. 153.598 din 25 mai 2004 al Direcţiei generale veterinare,
preşedintele Agenţiei Veterinare şi pentru Siguranta Alimentelor emite urmãtorul ordin:
ART. 1 Se aproba Norma veterinara privind metode naţionale de analiza pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conţinutul în aflatoxina, prevãzutã în anexa care face parte integrantã din prezentul ordin. ART. 2 Institutele centrale de profil, direcţiile veterinare şi pentru siguranta alimentelor judeţene şi a municipiului Bucureşti vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin. ART. 3 Agenţia Veterinara şi pentru Siguranta Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin. ART. 4 Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.
Preşedintele Agenţiei Veterinare şi pentru Siguranta Alimentelor, Liviu Harbuz
Bucureşti, 10 iunie 2004. Nr. 14.
ANEXA
NORMA VETERINARA privind metode naţionale de analiza pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conţinutul în aflatoxina
ART. 1 Analizele pentru controalele oficiale ale furajelor, cu privire la conţinutul acestora de aflatoxina B(1), trebuie sa fie efectuate în conformitate cu metodele descrise în Anexa la prezenta norma veterinara. ART. 2 (1) Autoritatea veterinara centrala a României poate adopta acte normative sau prevederi administrative suplimentare prezentei norme veterinare, pentru a dispune implementarea şi respectarea prevederilor acesteia. (2) Autoritatea veterinara centrala a României va lua mãsurile necesare şi va sanctiona, potrivit legii orice încãlcare a prevederilor prezentei norme veterinare. (3) Atunci când autoritatea veterinara centrala a României adopta cele menţionate la alineatele precedente, trebuie sa se facã o referire expresã la prezenta norma veterinara.
ANEXA ------ la norma veterinara --------------------
DETERMINAREA AFLATOXINEI B(1)
A. Metoda cromatografica monodimensionala în strat subtire 1. Domeniu şi scop Metoda face posibil sa se determine nivelul aflatoxinei B(1) din urmãtoarele furaje: turte de arahide, copra, samanta de în, soia, susan, palmier de babassu şi germeni de porumb, cereale şi produse din cereale, fãina de mazare, pulpa de cartof şi amidon. Limita inferioarã a determinãrii este 0,01 mg/kg (10 ppb). Dacã prezenta substanţelor de interferare impiedica determinarea aflatoxinei B(1), este necesar sa se refacã analiza utilizând metoda B (cromatografia bidimensionala în strat subtire). 2. Principiu Proba este supusã extractiei cu cloroform. Extractul este filtrat şi o porţiune de alicota este preluatã şi purificata pe coloana cromatografica pe silicagel. Eluatul este evaporat şi reziduul redizolvat într-un volum specific de cloroform sau într-un amestec de benzen şi acetonitril. O porţiune de alicota din aceasta soluţie este supusã cromatografiei în strat subtire (CSS). Cantitatea de aflatoxina B(1) este determinata, sub iradierea cu UV a cromatogramei, fie vizual fie prin fluorodensitometrie, prin comparare cu cantitãţi cunoscute de aflatoxina standard B(1). Identitatea aflatoxinei B(1) extrasa din furaj trebuie sa fie confirmatã prin procedura indicatã. 3. Reactivi NB: Toţi reactivii trebuie sa fie de calitatea "reactivului analitic" numai dacã nu s-a stabilit altfel. 3.1. Acetona 3.2. Cloroform, stabilizat cu 0,5 pana la 1,0% de 96% etanol (v/v). 3.3. N-hexane. 3.4. Metanol 3.5. Eter etilic anhidru, liber de peroxid 3.6. Amestec de benzen şi acetonitril: 98/2 (v/v). 3.7. Amestec de cloroform (3.2.) şi metanol (3.4.): 97/3 (v/v) 3.8. Silicagel, pentru coloana cromatografica, mãsura particulei 0,05 pana la 0,20 mm. 3.9. Vata de bumbac absorbanta, degresata anterior cu cloroform, sau vata de sticla 3.10. Sulfat de sodiu, anhidru, granular 3.11. Gaz inert, de ex. nitrogen 3.12. Acid clorhidric 1 N 3.13. acid sulfuric 50% (v/v) 3.14. Diatomit (hyflosupercel), spãlat în acid 3.15. Silicagel G-HR sau echivalent, pentru CSS 3.16. Soluţie standard cu aproximativ 0,1 æg de aflatoxina B(1) per ml în cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.), preparat şi verificat asa cum s-a indicat la Secţiunea 7. 3.17. Soluţie standard pentru scopuri de testare calitativã ce conţine aproximativ 0,1 æg de aflatoxina B(1) şi B(2) per ml în cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.). Aceste concentratii sunt prezentate ca un ghid. Acestea trebuie sa fie ajustate astfel încât sa se obţinã aceeaşi intensitate de fluorescenta pentru ambele aflatoxine. 3.18. Solventi de developare: 3.18.1. Cloroform (3.2.)/acetona (3.1.): 9/1 (v/v), soluţie mama nesaturata; 3.18.2. Eter etilic (3.5.)/melanol (3.4.)/apa: 96/3/1 (v/v/v, soluţie mama nesaturata); 3.18.3. Eter etilic (3.5.)/metanol (3.4.)/apa: 94/4.5/1.5 (v/v/v), soluţie mama nesaturata; 3.18.4. Cloroform (3.2.)/metanol (3.4.): 94/6 (v/v), soluţie mama saturata; 3.18.5. Cloroform (3.2.)/metanol (3.4.): 97/3 (v/v), soluţie mama saturata; 4. Aparatura. 4.1. Rasnita-mixer 4.2. Se scutura aparatul sau se agita magnetic 4.3. Hârtie de filtru canelata, Schleicher şi Schull nr. 588 sau echivalent, diametru: 24 cm 4.4. Tub de sticla pentru cromatografie (diametru intern: 22 mm, lungime: 300 mm), cu un robinet PTFE şi un rezervor de 250 ml. 4.5. Evaporator rotativ în vacuum, cu un balon cu fund rotund de 500 ml 4.6. balon conic de 500 ml, cu buson de sticla rodat. 4.7. Aparatura pentru CSS 4.8. Plãci de sticla pentru CSS, 200 x 200 mm, preparate dupã cum urmeazã (cantitãţile indicate sunt suficiente pentru a acoperi cinci plãci). Se pun 30 g de silicagel G-HR (3.15.) într-un balon conic. Se adauga 60 ml apa, se astupa şi se agita timp de un minut. Se imprastie suspensia pe plãci astfel încât sa se obţinã un strat uniform de grosime 0,25 mm. Se lasa sa se usuce la aer şi apoi se depoziteaza într-un exicator ce conţine silicagel. În momentul utilizãrii, se activeazã plãcile prin ţinerea acestora în cuptor la 110°C timp de o ora. Gata de utilizare, plãcile sunt corespunzãtoare dacã acestea dau rezultate similare celor obţinute cu plãci preparate asa cum s-a indicat mai sus. 4.9. Lampa UV de lungime de unda (360 nm). Intensitatea iradierii trebuie sa facã posibil, pentru un spot de 1 ng de aflatoxina B(1) sa fie distins cu claritate pe o placa CSS la o distanta de 10 cm de lampa. 4.10. Tuburi gradate de 10 ml cu dopuri de polietilena. 4.11. Spectrofotometru UV. 4.12. Fluorodensitometru (optional) 5. Procedura. 5.1. Prepararea probei (vezi "Observaţii", Partea C, punctul 1). Se rasneste proba astfel încât intreaga cantitate sa treacã printr-o sita cu ochiuri de 1 mm (în concordanta cu recomandarea ISO R 565) 5.2. Extracţie Se pun 50 g de proba rasnita, omogenizata într-un tub conic de 500 ml. Se adauga 25 g de diatomit (3.14.), 25 ml de apa şi 250 ml de cloroform (3.2.). Se astupa balonul, se scutura sau se agita pentru 30 de minute cu aparatul (4.2.) şi se filtreaza printr-o hârtie de filtru canelata (4.3.). Se inlatura primii 10 ml din filtrat şi apoi se colecteazã 50 ml. 5.3. Curatarea coloanei Se insereaza în capatul inferior al unui tub de cromatografie (4.4.) un dop de vata de bumbac sau de sticla (3.9.), se umple doua treimi din tub cu cloroform (3.2.) şi se adauga 5 g de sulfat de sodiu (3.10.). Se verifica dacã suprafata superioarã a stratului de sulfat de sodiu este neteda, apoi se adauga 10 g de silicagel (3.8.) în porţiuni mici. Se agita cu atentie dupã fiecare aditie, pentru a elimina bulele de aer. Se lasa în repaos timp de 15 minute şi apoi se adauga cu atentie 15 g de sulfat de sodiu (3.10.). Se lasa lichidul sa cada pana când acesta este tocmai deasupra suprafeţei superioare a stratului de sulfat de sodiu. Se amesteca 50 ml de extract colectat la 5.2. cu 100 ml de n-hexan (3.3.) şi se transfera cantitatea din amestecul coloanei. Se lasa lichidul sa cada pana când acesta este tocmai deasupra suprafeţei superioare a stratului de sulfat de sodiu. Se elimina aceasta spalare. Apoi se adauga 100 ml de eter etilic (3.5.) şi se lasa din nou sa cada pana la suprafata superioarã a stratului de sulfat de sodiu. În timpul acestor operaţiunii se observa ca debitul este 8 pana la 12 ml per minut şi coloana nu devine uscata. Se elimina lichidul care iese. Se elueaza apoi cu 150 ml de amestec de cloroform/metanol (3.7.) şi se colecteazã întregul eluat. Se evapora cel din urma pana aproape de uscare la o temperatura ce nu depãşeşte 50°C şi sub un jet de gaz inert (3.11.) cu evaporator rotativ (4.5.). Se transfera în mod cantitativ reziduul, utilizând cloroform (3.2.) sau amestec de benzen-acetonitril (3.6.), într-un tub gradat de 10 ml (4.10.). Se concentreaza soluţia sub un jet de gaz inert (3.11.) şi apoi se ajusteaza volumul pana la 2 ml cu cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.). 5.4. Cromatografie în strat subtire Se efectueazã un spot pe o placa pentru cromatografie în strat subtire (4.8.), 2 cm de la marginea inferioarã şi la distanţe de 2 cm, cu volume indicate mai jos din soluţia standard şi din extract: - 10, 15, 20, 30 şi 40 æl din soluţia standard de aflatoxina B(1) (3.16.); - 10 æl din extractul obţinut la 5.3 şi, suprapus pe acelaşi punct, - 20 æl de soluţie standard (3.16.); - 10 şi 20 æl de extras obţinut la 5.3. Se developeaza cromatograma la intuneric cu unul din solventii de developare (3.18.). Alegerea solventului trebuie sa fie efectuatã în prealabil, prin depozitare de 25 æl de soluţie standard calitativã (3.17.) pe placa şi verificand ca atunci când se developeaza, aflatoxinele B(1) şi B(2) sunt complet separate. Se lasa solventii sa se evapore la intuneric şi apoi se iradiaza cu lumina UV, plasand placa la 10 cm de lampa (4.9.). Spoturile de aflatoxina B(1) dau o fluorescenta albastra. 5.5. Determinãri cantitative Se determina fie vizual, fie prin fluorodensitometrie, asa cum s-a indicat mai jos. 5.5.1. Masurari vizuale Se determina cantitatea de aflatoxina B(1) din extract, prin compararea intensitatii fluorescentei din spoturile de extract cu cea a unuia din spoturile soluţiei standard. Se interpoleaza dacã este necesar. Fluorescenta obţinutã prin suprapunerea extractului din soluţia standard trebuie sa fie mai intensa decât cea a cantitãţii de 10 æl de extract şi nu trebuie sa fie mai mare decât un spot vizibil. Dacã intensitatea fluorescentei data de cantitatea de 10 æl de extras este mai mare decât cea de 40 æl din soluţia standard, se dilueaza extractul de 10 sau 100 de ori cu cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.) înainte sa fie supus din nou cromatografiei în strat subtire. 5.5.2. Masurari prin fluorodensitometrie Se mãsoarã intensitatea fluorescentei spoturilor de aflatoxina B(1) cu fluorodensitometru (4.12.) la o excitatie a lungimii de unda de 365 nm şi o emisie a lungimii de unda de 443 nm. Se determina cantitatea de aflatoxina B(1) din spoturile de extract, prin compararea intensitatilor fluorescentei acestora cu cea a spoturilor de aflatoxina B(1) standard. 5.6. Confirmarea identitãţii aflatoxinei B(1) Confirmarea identitãţii aflatoxinei B(1) din extract se efectueazã prin procesele indicate mai jos. 5.6.1. Tratare cu acid sulfuric Se pulverizeaza acid sulfuric (3.13.) pe cromatograma obţinutã la 5.4. Fluorescenta spoturilor de aflatoxina B(1) trebuie sa devinã, sub iradierea UV din albastra, galbena. 5.6.2. Cromatografie bidimensionala implicând formarea de aflatoxina B(1)-hemiacetat (aflatoxina B(2)a) NB: Operaţiunile descrise mai jos trebuie sa fie efectuate urmând cu atentie diagrama din figura 3.
NOTA(CTCE) Figura 3, se gãseşte în Monitorul Oficial al Romanie, Partea I, nr. 1020 bis din 4 noiembrie 2004.
5.6.2.1. Aplicarea soluţiilor Se traseaza pe o placa (4.8.) doua linii drepte paralele la doua pãrţi marginale (6 cm de fiecare parte) pana la limita migratiei fronturilor de solvent. Se marcheaza soluţiile urmãtoare pe placa utilizându-se pipete capilare sau microseringi: - în punctul A: un volum al probei de extract purificat, obţinutã la 5.3, conţinând aproximativ 2,5 ng de aflatoxina B(1); - în punctele B şi C: soluţie standard de 25 æl 5.6.2.2. Developare Se developeaza cromatograma în direcţia I, la intuneric, utilizând solvent de developare (3.18.1.) (un strat de 1 cm dintr-o soluţie mama nesaturata) pana când frontul de solvent atinge linia limita a solventului. Se indeparteaza soluţia mama de pe placa şi se lasa sa se usuce la intuneric, la temperatura ambianta, timp de cinci minute. Se pulverizeaza apoi cu acid clorhidric (3.12.) de-a lungul unei bande de 2,5 cm înãlţime ce acoperã punctele A şi B (indicatã prin zona hasurata în figura 3) pana când se intuneca, protejand restul placii cu o foaie de sticla. Se lasa sa reactioneze timp de 10 minute la intuneric şi se usucã cu un curent de aer la temperatura ambianta. Se developeaza apoi cromatograma în direcţia II, la intuneric, utilizând solvent de developare (3.18.1.) (un strat de 1 cm dintr-o soluţie mama nesaturata) pana când frontul de solvent ajunge la linia limita a solventului. Se indeparteaza soluţia mama de pe placa şi se lasa sa se usuce la temperatura ambianta. 5.6.2.3. Interpretarea cromatogramei. Se examineazã cromatograma sub lumina UV (4.9.) şi se verifica urmãtoarele caracteristici: (a) Apariţia unui spot albastru de aflatoxina B(1) ce provine de la soluţia standard aplicatã în punctul C (migrare în direcţia I). (b) Apariţia unui spot fluorescent albastru de aflatoxina B(1) (nu reactioneaza cu acid clorhidric) şi un spot fluorescent albastru mai intens de aflatoxina B(1)-hemiacetat, ambele originare din soluţia standard aplicatã în punctul B (migrarea în direcţia II). (c) Apariţia de spoturi asemãnãtoare celor descrise la (b) ce provin din proba extract aplicatã în punctul A. Poziţia acestor spoturi este definitã mai întâi prin distanta de migrare a aflatoxinei B(1) de la punctul A în direcţia I (aceeaşi ca cea lucrata prin standardul aplicat la C) şi apoi prin distanţele de migrare de acolo în direcţia II a aflatoxinei B(1)-hemiacetat (aceeaşi ca cele lucrate prin standardul aplicat la B). Trebuie comparate intensitatile fluorescentei spoturilor hemiacetate ce provin din extract şi din standardul aplicat în punctul B. 6. Calcularea rezultatelor 6.1. De la masurarile vizuale Conţinutul în micrograme de aflatoxina B(1) per kg de proba (ppb) este dat prin formula:
S x Y x V
W x X
în care: Y şi X sunt volumele în microlitri ale soluţiei standard de aflatoxina B(1) (3.16.) şi ale extractului având o intensitate a fluorescentei similarã S = concentratia în micrograme de aflatoxina B(1) per ml în soluţia standard (3.16.); V = volumul final al extractului în microlitri, permitand orice dilutie ce a fost necesarã; W = greutatea în grame a probei corespondente volumului din extractul supus la curatarea coloanei 6.2. De la masurarile fluorodensitometrice Conţinutul în micrograme de aflatoxina B(1) per kg de proba este data prin formula:
S x V
W x Y
în care: Y = volumul în microlitri de extract depus pe placa (10 sau 20 æl); S = cantitatea în nanograme de aflatoxina B(1) din spotul de extras (proporţional valorii Y luate) dedusã din mãsurãtori; V = volumul final al extractului în microlitri, permitand orice dilutie ce a fost necesarã; W = greutatea în grame a probei corespondente volumului din extractul supus la curatarea coloanei. 7. Prepararea şi testarea soluţiei standard (3.16.) 7.1. Determinarea concentratiei de aflatoxina B(1) Se prepara o soluţie standard de aflatoxina B(1) în cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.) cu o concentraţie de 8 la 10 æg/ml. Se determina spectrul de absorbţie între lungimile de unda de 330 şi 370 nm cu ajutorul spectrofotometrului (4.11.). Se mãsoarã densitatea optica (A) la lungimea de unda de 363 nm, în cazul soluţiei de cloroform; sau la lungimea de unda de 348 nm, în cazul soluţiei de amestec de benzen/acetonitril. Se calculeazã concentratia în micrograme de aflatoxina B(1) per ml de soluţie prin formula de mai jos:
312 x A x 1000
20600
312 x A x 1000 -------------- pentru soluţia din amestecul benzen/acetonitril 19800
Se dilueaza dupã cum este corespunzãtor, departe de lumina zilei, pentru a obţine o soluţie de lucru standard cu o concentraţie de aflatoxina B(1) de aproximativ 0,1 æg/ml. Dacã se pãstreazã într-un refrigerator la 4°C aceasta soluţie este stabilã timp de doua sãptãmâni. 7.2. Testarea puritatii cromatografice Se depune pe o placa (4.8.) 5 æl de soluţie standard de aflatoxina B(1) ce conţine 8 pana la 10 æg/ml (7.1.). Se developeaza cromatograma asa cum s-a indicat la 5.4. În lumina UV cromatograma trebuie sa indice numai un spot şi nu trebuie sa fie perceptibila nici o fluorescenta în zona de depozitare originala. 8. Repetabilitate Diferenţa dintre rezultatele celor doua determinãri paralele, efectuate pe aceeaşi proba, prin aceeaşi analiza, nu trebuie sa depãşeascã: - 25% corelata cu rezultatul cel mai mare pentru un conţinut de aflatoxina B(1) de la 10 şi pana la 20 æg/kg - 5 æg, în valoare absolutã, pentru un conţinut mai mare de 20 şi pana la 50 æg/kg - 10% corelata cu valoarea cea mai mare pentru un conţinut de aproximativ 50 æg/kg 9. Reproductibilitate A se vedea "Observaţii", Partea C, punctul 2 B. Metoda cromatografica bidimensionala în strat subtire 1. Domeniu şi scop Metoda face posibil sa se determine nivelul de aflatoxina B(1) din furaje ce nu sunt în domeniul de aplicare al metodei A. Limita inferioarã a determinãrii este 0,01 mg/kg (10 ppb). Metoda nu este aplicabilã furajelor ce conţin pulpa de fructe citrice. 2. Principiu Proba este supusã extractiei cu cloroform. Extractul este filtrat şi o porţiune alicota este prelevata şi purificata prin cromatografie în coloana pe silicagel. Eluatul este evaporat şi reziduul redizolvat într-un volum specific de cloroform sau într-un amestec de benzen cu acetonitril. O porţiune alicota din aceasta soluţie este supusã cromatografiei bidimensionale în strat subtire (CSS). Cantitatea de aflatoxina B(1) este determinata în baza iradierii cu radiaţie UV a cromatogramei, fie vizual fie prin fluorodensitometrie, prin comparare cu cantitãţi cunoscute de aflatoxina standard B(1). Identitatea aflatoxinei B(1) extrasa din furaj trebuie sa fie confirmatã prin procedura indicatã. 3. Reactivi NB: Toţi reactivii trebuie sa fie de calitate "reactivi analitici" numai dacã nu s-a stabilit altfel. 3.1. Acetona 3.2. Cloroform, stabilizat cu 0,75 pana la 1% la 96% etanol (v/v). 3.3. N-hexan 3.4. Metanol 3.5. Eter etilic anhidru, liber de peroxidaze 3.6. Amestec de benzen şi acetonitril: 98/2 (v/v) 3.7. Amestec de cloroform (3.2.) şi metanol (3.4.): 97/3 (v/v) 3.8. Silicagel pentru cromatografie în coloana, particule de mãrime 0,705 pana la 0,720 mm. 3.9. Vata de bumbac absorbanta, anterior degresata cu cloroform, sau vata de sticla 3.10. Sulfat de sodiu, anhidru, granular 3.11. Gaz inert, de ex. azot 3.12. Acid clorhidric 1 N 3.13. Diatomit, (hyflosupercel), spãlat în acid. 3.14. Silicagel G-HR sau echivalent pentru CSS 3.15. Solventi de developare 3.15.1. Eter etilic (3.5.)/metanol (3.4.)/apa: 94/4.5/1.5 (v/v/v), soluţie mama nesaturata 3.15.2. Cloroform (3.2.)/acetona (3.1.): 9/1 (v/v), soluţie mama nesaturata 3.16. Soluţie standard cu aproximativ 0,1 æg aflatoxina B(1) per ml în cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.), preparata şi verificata asa cum este descris la punctul 7 al metodei A. 4. Aparatura A se vedea punctul 4 al metodei A 5. Procedura 5.1. Prepararea probei 5.2. Extracţie vezi punctele 5.1., 5.2. şi 5.3. ale metodei A
5.3. Curatarea coloanei 5.4. CCS bidimensionala 5.4.1. Aplicarea soluţiilor (urmãriţi diagrama din figura 1)
NOTA(CTCE) Figura 1, se gãseşte în Monitorul Oficial al Romanie, Partea I, nr. 1020 bis din 4 noiembrie 2004.
Se traseaza pe o placa (4.8.) doua linii drepte paralele cu cele doua margini drepte (respectiv 5 şi 6 cm de fiecare parte), pentru a se limita migrarea fronturilor de solvent. Se depun urmãtoarele soluţii pe placa utilizând pipete capilare sau microseringi: - în punctul A, 20 æl de extract de proba purificat obţinut la 5.3; - în punctul B, 20 æl de soluţie standard (3.16.); - în punctul C, 10 æl de soluţie standard (3.16.); - în punctul D, 20 æl de soluţie standard (3.16.); - în punctul E, 40 æl de soluţie standard (3.16.); Se usucã sub jet uşor de aer sau gaz inert (3.11.). Spoturile obţinute trebuie sa aibã un diametru de aproximativ 5 mm. 5.4.2. Developare (se urmãreşte diagrama din figura 1) Se developeaza cromatograma în direcţia I, la intuneric, utilizând solvent de developare (3.15.1.) (strat de 1 cm într-o soluţie mama nesaturata) pana când frontul de solvent atinge linia limita a solventului. Se indeparteaza soluţia mama de pe placa şi se lasa sa se usuce la intuneric, la temperatura ambianta, timp de cincisprezece minute. Se developeaza apoi cromatograma în direcţia II, la intuneric, utilizând solvent de developare (3.15.2.) (un strat de 1 cm într-o soluţie mama nesaturata) pana când frontul de solvent ajunge la linia limita a solventului. Se muta placa de la recipient şi se lasa sa se usuce la intuneric, la temperatura ambianta. 5.4.3. Interpretarea cromatogramei (se urmãreşte diagrama din figura 2)
NOTA(CTCE) Figura 2, se gãseşte în Monitorul Oficial al Romanie, Partea I, nr. 1020 bis din 4 noiembrie 2004.
Se iradiaza cromatograma cu lumina UV, prin plasarea placii la 10 cm de (4.9.). Se localizeaza poziţia spoturilor albastre fluorescente din punctele B, C, D şi E ale aflatoxinei B(1) din soluţia standard. Se proiecteazã doua linii imaginare ce trec prin aceste spoturi şi perpendiculare pe direcţiile de developare. Intersectia P a acestor linii este locul în care se asteapta sa se gãseascã spotul aflatoxinei B(1) ce provine din extractul proba aplicat în punctul A (figura 1). Totuşi, locaţia actuala a spotului de aflatoxina poate fi la un punct Q la intersectia celor doua linii imaginare drepte ce formeazã un unghi de aproximativ 100°C între ele ce trec pin spoturile B şi respectiv C. Se determina cantitatea de aflatoxina B(1) din extractul proba asa cum s-a indicat la 5.5. 5.4.4. Cromatografie suplimentarã Se traseaza pe o placa noua (4.8.) doua linii drepte paralele cu cele doua margini drepte, asa cum s-a indicat în diagrama din figura 1, şi se aplica la punctul A (vezi figura 1) 20 æl de extract de proba purificat obţinut la 5.3 şi superpozitionata pe aceasta, 20 æl de soluţie standard (3.16.). Se developeaza asa cum s-a indicat la 5.4.2. Se iradiaza cromatograma cu lumina UV (4.9.) şi se verifica dacã: - spoturile de aflatoxina B(1) din extract şi din soluţia standard se suprapun, - fluorescenta acestui spot este mult mai intensa decât cea a aflatoxinei B(1), spot developat la Q pe prima placa. 5.5. Determinãri cantitative Se determina fie vizual fie prin fluorodensitometru asa cum s-a indicat mai jos. 5.5.1. Masurari vizuale Se determina cantitatea de aflatoxina B(1) din extract prin compararea intensitatii fluorescentei din spotul extract cu cea a spoturilor din punctele C, D şi E din soluţia standard. Se interpoleaza dacã este necesar. Dacã intensitatea fluorescentei obţinutã prin intermediul a 20 æl de extract este mai mare decât cea obţinutã cu 40 æl de soluţie standard, se dilueaza extractul de 10 sau 100 de ori cu cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.) înainte sa fie supus din nou cromatografiei în strat subtire. 5.5.2. Masurari prin fluorodensitometru Se mãsoarã intensitatea fluorescentei spoturilor de aflatoxina B(1) cu fluorodensitometru (4.12.), utilizând o excitatie a lungimii de unda de 365 nm şi o emisiune a lungimii de unda de 443 nm. Se determina cantitatea de aflatoxina B(1) din spotul extract, prin compararea intensitatii fluorescente cu cea din spoturile din punctele C, D şi E din soluţia standard. 5.6. Confirmarea identitãţii aflatoxinei B(1) A se vedea punctul 5.6 al metodei A. 6. Calcularea rezultatelor A se vedea punctul 6 al metodei A. 7. Repetabilitate A se vedea punctul 8 al metodei A 8. Reproductibilitate A se vedea "Observaţii", Partea C, punctul 2 C. Observaţii privind metodele A şi B. 1. Degresare Probele ce conţin mai mult de 5% grãsimi trebuie sa fie degresate cu eter de petrol (bp 40 pana la 60°C) dupã prepararile indicate la 5.1. În astfel de cazuri, rezultatele analitice trebuie sa fie exprimate în funcţie de greutatea probei nedegresate. 2. Reproductibilitatea rezultatelor pentru metoda A Reproductibilitatea rezultatelor, de ex. variatia dintre rezultatele obţinute în doua sau mai multe laboratoare privind aceeaşi proba a fost estimatã la: ± 50% din valoarea medie pentru valorile medii ale aflatoxinei B(1) de la 10 şi pana la 20 mg/kg; ± 10 mg/kg din valoarea medie pentru valori medii mai mari de 20 şi pana la 50 mg/kg; ± 20% din valoarea medie pentru valori medii peste 50 mg/kg.
------------
Newsletter GRATUIT
Aboneaza-te si primesti zilnic Monitorul Oficial pe email
