Copierea de continut din prezentul site este supusa regulilor precizate in Termeni si conditii! Click aici.
Prin utilizarea siteului sunteti de acord, in mod implicit cu Termenii si conditiile! Orice abatere de la acestea constituie incalcarea dreptului nostru de autor si va angajeaza raspunderea!
X
NORMA VETERINARA din 10 iunie 2004 privind metode nationale de analiza pentru controlul oficial al furajelor cu referire la continutul in aflatoxina*)
*) Aprobata prin <>Ordinul nr. 14 din 10 iunie 2004 , publicat in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I, nr. 1020 din 4 noiembrie 2004.
ART. 1 Analizele pentru controalele oficiale ale furajelor, cu privire la continutul acestora de aflatoxina B(1), trebuie sa fie efectuate in conformitate cu metodele descrise in Anexa la prezenta norma veterinara. ART. 2 (1) Autoritatea veterinara centrala a Romaniei poate adopta acte normative sau prevederi administrative suplimentare prezentei norme veterinare, pentru a dispune implementarea si respectarea prevederilor acesteia. (2) Autoritatea veterinara centrala a Romaniei va lua masurile necesare si va sanctiona, potrivit legii orice incalcare a prevederilor prezentei norme veterinare. (3) Atunci cand autoritatea veterinara centrala a Romaniei adopta cele mentionate la alineatele precedente, trebuie sa se faca o referire expresa la prezenta norma veterinara.
ANEXA ------ la norma veterinara --------------------
DETERMINAREA AFLATOXINEI B(1)
A. Metoda cromatografica monodimensionala in strat subtire 1. Domeniu si scop Metoda face posibil sa se determine nivelul aflatoxinei B(1) din urmatoarele furaje: turte de arahide, copra, samanta de in, soia, susan, palmier de babassu si germeni de porumb, cereale si produse din cereale, faina de mazare, pulpa de cartof si amidon. Limita inferioara a determinarii este 0,01 mg/kg (10 ppb). Daca prezenta substantelor de interferare impiedica determinarea aflatoxinei B(1), este necesar sa se refaca analiza utilizand metoda B (cromatografia bidimensionala in strat subtire). 2. Principiu Proba este supusa extractiei cu cloroform. Extractul este filtrat si o portiune de alicota este preluata si purificata pe coloana cromatografica pe silicagel. Eluatul este evaporat si reziduul redizolvat intr-un volum specific de cloroform sau intr-un amestec de benzen si acetonitril. O portiune de alicota din aceasta solutie este supusa cromatografiei in strat subtire (CSS). Cantitatea de aflatoxina B(1) este determinata, sub iradierea cu UV a cromatogramei, fie vizual fie prin fluorodensitometrie, prin comparare cu cantitati cunoscute de aflatoxina standard B(1). Identitatea aflatoxinei B(1) extrasa din furaj trebuie sa fie confirmata prin procedura indicata. 3. Reactivi NB: Toti reactivii trebuie sa fie de calitatea "reactivului analitic" numai daca nu s-a stabilit altfel. 3.1. Acetona 3.2. Cloroform, stabilizat cu 0,5 pana la 1,0% de 96% etanol (v/v). 3.3. N-hexane. 3.4. Metanol 3.5. Eter etilic anhidru, liber de peroxid 3.6. Amestec de benzen si acetonitril: 98/2 (v/v). 3.7. Amestec de cloroform (3.2.) si metanol (3.4.): 97/3 (v/v) 3.8. Silicagel, pentru coloana cromatografica, masura particulei 0,05 pana la 0,20 mm. 3.9. Vata de bumbac absorbanta, degresata anterior cu cloroform, sau vata de sticla 3.10. Sulfat de sodiu, anhidru, granular 3.11. Gaz inert, de ex. nitrogen 3.12. Acid clorhidric 1 N 3.13. acid sulfuric 50% (v/v) 3.14. Diatomit (hyflosupercel), spalat in acid 3.15. Silicagel G-HR sau echivalent, pentru CSS 3.16. Solutie standard cu aproximativ 0,1 æg de aflatoxina B(1) per ml in cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.), preparat si verificat asa cum s-a indicat la Sectiunea 7. 3.17. Solutie standard pentru scopuri de testare calitativa ce contine aproximativ 0,1 æg de aflatoxina B(1) si B(2) per ml in cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.). Aceste concentratii sunt prezentate ca un ghid. Acestea trebuie sa fie ajustate astfel incat sa se obtina aceeasi intensitate de fluorescenta pentru ambele aflatoxine. 3.18. Solventi de developare: 3.18.1. Cloroform (3.2.)/acetona (3.1.): 9/1 (v/v), solutie mama nesaturata; 3.18.2. Eter etilic (3.5.)/melanol (3.4.)/apa: 96/3/1 (v/v/v, solutie mama nesaturata); 3.18.3. Eter etilic (3.5.)/metanol (3.4.)/apa: 94/4.5/1.5 (v/v/v), solutie mama nesaturata; 3.18.4. Cloroform (3.2.)/metanol (3.4.): 94/6 (v/v), solutie mama saturata; 3.18.5. Cloroform (3.2.)/metanol (3.4.): 97/3 (v/v), solutie mama saturata; 4. Aparatura. 4.1. Rasnita-mixer 4.2. Se scutura aparatul sau se agita magnetic 4.3. Hartie de filtru canelata, Schleicher si Schull nr. 588 sau echivalent, diametru: 24 cm 4.4. Tub de sticla pentru cromatografie (diametru intern: 22 mm, lungime: 300 mm), cu un robinet PTFE si un rezervor de 250 ml. 4.5. Evaporator rotativ in vacuum, cu un balon cu fund rotund de 500 ml 4.6. balon conic de 500 ml, cu buson de sticla rodat. 4.7. Aparatura pentru CSS 4.8. Placi de sticla pentru CSS, 200 x 200 mm, preparate dupa cum urmeaza (cantitatile indicate sunt suficiente pentru a acoperi cinci placi). Se pun 30 g de silicagel G-HR (3.15.) intr-un balon conic. Se adauga 60 ml apa, se astupa si se agita timp de un minut. Se imprastie suspensia pe placi astfel incat sa se obtina un strat uniform de grosime 0,25 mm. Se lasa sa se usuce la aer si apoi se depoziteaza intr-un exicator ce contine silicagel. In momentul utilizarii, se activeaza placile prin tinerea acestora in cuptor la 110°C timp de o ora. Gata de utilizare, placile sunt corespunzatoare daca acestea dau rezultate similare celor obtinute cu placi preparate asa cum s-a indicat mai sus. 4.9. Lampa UV de lungime de unda (360 nm). Intensitatea iradierii trebuie sa faca posibil, pentru un spot de 1 ng de aflatoxina B(1) sa fie distins cu claritate pe o placa CSS la o distanta de 10 cm de lampa. 4.10. Tuburi gradate de 10 ml cu dopuri de polietilena. 4.11. Spectrofotometru UV. 4.12. Fluorodensitometru (optional) 5. Procedura. 5.1. Prepararea probei (vezi "Observatii", Partea C, punctul 1). Se rasneste proba astfel incat intreaga cantitate sa treaca printr-o sita cu ochiuri de 1 mm (in concordanta cu recomandarea ISO R 565) 5.2. Extractie Se pun 50 g de proba rasnita, omogenizata intr-un tub conic de 500 ml. Se adauga 25 g de diatomit (3.14.), 25 ml de apa si 250 ml de cloroform (3.2.). Se astupa balonul, se scutura sau se agita pentru 30 de minute cu aparatul (4.2.) si se filtreaza printr-o hartie de filtru canelata (4.3.). Se inlatura primii 10 ml din filtrat si apoi se colecteaza 50 ml. 5.3. Curatarea coloanei Se insereaza in capatul inferior al unui tub de cromatografie (4.4.) un dop de vata de bumbac sau de sticla (3.9.), se umple doua treimi din tub cu cloroform (3.2.) si se adauga 5 g de sulfat de sodiu (3.10.). Se verifica daca suprafata superioara a stratului de sulfat de sodiu este neteda, apoi se adauga 10 g de silicagel (3.8.) in portiuni mici. Se agita cu atentie dupa fiecare aditie, pentru a elimina bulele de aer. Se lasa in repaos timp de 15 minute si apoi se adauga cu atentie 15 g de sulfat de sodiu (3.10.). Se lasa lichidul sa cada pana cand acesta este tocmai deasupra suprafetei superioare a stratului de sulfat de sodiu. Se amesteca 50 ml de extract colectat la 5.2. cu 100 ml de n-hexan (3.3.) si se transfera cantitatea din amestecul coloanei. Se lasa lichidul sa cada pana cand acesta este tocmai deasupra suprafetei superioare a stratului de sulfat de sodiu. Se elimina aceasta spalare. Apoi se adauga 100 ml de eter etilic (3.5.) si se lasa din nou sa cada pana la suprafata superioara a stratului de sulfat de sodiu. In timpul acestor operatiunii se observa ca debitul este 8 pana la 12 ml per minut si coloana nu devine uscata. Se elimina lichidul care iese. Se elueaza apoi cu 150 ml de amestec de cloroform/metanol (3.7.) si se colecteaza intregul eluat. Se evapora cel din urma pana aproape de uscare la o temperatura ce nu depaseste 50°C si sub un jet de gaz inert (3.11.) cu evaporator rotativ (4.5.). Se transfera in mod cantitativ reziduul, utilizand cloroform (3.2.) sau amestec de benzen-acetonitril (3.6.), intr-un tub gradat de 10 ml (4.10.). Se concentreaza solutia sub un jet de gaz inert (3.11.) si apoi se ajusteaza volumul pana la 2 ml cu cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.). 5.4. Cromatografie in strat subtire Se efectueaza un spot pe o placa pentru cromatografie in strat subtire (4.8.), 2 cm de la marginea inferioara si la distante de 2 cm, cu volume indicate mai jos din solutia standard si din extract: - 10, 15, 20, 30 si 40 æl din solutia standard de aflatoxina B(1) (3.16.); - 10 æl din extractul obtinut la 5.3 si, suprapus pe acelasi punct, - 20 æl de solutie standard (3.16.); - 10 si 20 æl de extras obtinut la 5.3. Se developeaza cromatograma la intuneric cu unul din solventii de developare (3.18.). Alegerea solventului trebuie sa fie efectuata in prealabil, prin depozitare de 25 æl de solutie standard calitativa (3.17.) pe placa si verificand ca atunci cand se developeaza, aflatoxinele B(1) si B(2) sunt complet separate. Se lasa solventii sa se evapore la intuneric si apoi se iradiaza cu lumina UV, plasand placa la 10 cm de lampa (4.9.). Spoturile de aflatoxina B(1) dau o fluorescenta albastra. 5.5. Determinari cantitative Se determina fie vizual, fie prin fluorodensitometrie, asa cum s-a indicat mai jos. 5.5.1. Masurari vizuale Se determina cantitatea de aflatoxina B(1) din extract, prin compararea intensitatii fluorescentei din spoturile de extract cu cea a unuia din spoturile solutiei standard. Se interpoleaza daca este necesar. Fluorescenta obtinuta prin suprapunerea extractului din solutia standard trebuie sa fie mai intensa decat cea a cantitatii de 10 æl de extract si nu trebuie sa fie mai mare decat un spot vizibil. Daca intensitatea fluorescentei data de cantitatea de 10 æl de extras este mai mare decat cea de 40 æl din solutia standard, se dilueaza extractul de 10 sau 100 de ori cu cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.) inainte sa fie supus din nou cromatografiei in strat subtire. 5.5.2. Masurari prin fluorodensitometrie Se masoara intensitatea fluorescentei spoturilor de aflatoxina B(1) cu fluorodensitometru (4.12.) la o excitatie a lungimii de unda de 365 nm si o emisie a lungimii de unda de 443 nm. Se determina cantitatea de aflatoxina B(1) din spoturile de extract, prin compararea intensitatilor fluorescentei acestora cu cea a spoturilor de aflatoxina B(1) standard. 5.6. Confirmarea identitatii aflatoxinei B(1) Confirmarea identitatii aflatoxinei B(1) din extract se efectueaza prin procesele indicate mai jos. 5.6.1. Tratare cu acid sulfuric Se pulverizeaza acid sulfuric (3.13.) pe cromatograma obtinuta la 5.4. Fluorescenta spoturilor de aflatoxina B(1) trebuie sa devina, sub iradierea UV din albastra, galbena. 5.6.2. Cromatografie bidimensionala implicand formarea de aflatoxina B(1)-hemiacetat (aflatoxina B(2)a) NB: Operatiunile descrise mai jos trebuie sa fie efectuate urmand cu atentie diagrama din figura 3.
NOTA(CTCE) Figura 3, se gaseste in Monitorul Oficial al Romanie, Partea I, nr. 1020 bis din 4 noiembrie 2004.
5.6.2.1. Aplicarea solutiilor Se traseaza pe o placa (4.8.) doua linii drepte paralele la doua parti marginale (6 cm de fiecare parte) pana la limita migratiei fronturilor de solvent. Se marcheaza solutiile urmatoare pe placa utilizandu-se pipete capilare sau microseringi: - in punctul A: un volum al probei de extract purificat, obtinuta la 5.3, continand aproximativ 2,5 ng de aflatoxina B(1); - in punctele B si C: solutie standard de 25 æl 5.6.2.2. Developare Se developeaza cromatograma in directia I, la intuneric, utilizand solvent de developare (3.18.1.) (un strat de 1 cm dintr-o solutie mama nesaturata) pana cand frontul de solvent atinge linia limita a solventului. Se indeparteaza solutia mama de pe placa si se lasa sa se usuce la intuneric, la temperatura ambianta, timp de cinci minute. Se pulverizeaza apoi cu acid clorhidric (3.12.) de-a lungul unei bande de 2,5 cm inaltime ce acopera punctele A si B (indicata prin zona hasurata in figura 3) pana cand se intuneca, protejand restul placii cu o foaie de sticla. Se lasa sa reactioneze timp de 10 minute la intuneric si se usuca cu un curent de aer la temperatura ambianta. Se developeaza apoi cromatograma in directia II, la intuneric, utilizand solvent de developare (3.18.1.) (un strat de 1 cm dintr-o solutie mama nesaturata) pana cand frontul de solvent ajunge la linia limita a solventului. Se indeparteaza solutia mama de pe placa si se lasa sa se usuce la temperatura ambianta. 5.6.2.3. Interpretarea cromatogramei. Se examineaza cromatograma sub lumina UV (4.9.) si se verifica urmatoarele caracteristici: (a) Aparitia unui spot albastru de aflatoxina B(1) ce provine de la solutia standard aplicata in punctul C (migrare in directia I). (b) Aparitia unui spot fluorescent albastru de aflatoxina B(1) (nu reactioneaza cu acid clorhidric) si un spot fluorescent albastru mai intens de aflatoxina B(1)-hemiacetat, ambele originare din solutia standard aplicata in punctul B (migrarea in directia II). (c) Aparitia de spoturi asemanatoare celor descrise la (b) ce provin din proba extract aplicata in punctul A. Pozitia acestor spoturi este definita mai intai prin distanta de migrare a aflatoxinei B(1) de la punctul A in directia I (aceeasi ca cea lucrata prin standardul aplicat la C) si apoi prin distantele de migrare de acolo in directia II a aflatoxinei B(1)-hemiacetat (aceeasi ca cele lucrate prin standardul aplicat la B). Trebuie comparate intensitatile fluorescentei spoturilor hemiacetate ce provin din extract si din standardul aplicat in punctul B. 6. Calcularea rezultatelor 6.1. De la masurarile vizuale Continutul in micrograme de aflatoxina B(1) per kg de proba (ppb) este dat prin formula:
S x Y x V
W x X
in care: Y si X sunt volumele in microlitri ale solutiei standard de aflatoxina B(1) (3.16.) si ale extractului avand o intensitate a fluorescentei similara S = concentratia in micrograme de aflatoxina B(1) per ml in solutia standard (3.16.); V = volumul final al extractului in microlitri, permitand orice dilutie ce a fost necesara; W = greutatea in grame a probei corespondente volumului din extractul supus la curatarea coloanei 6.2. De la masurarile fluorodensitometrice Continutul in micrograme de aflatoxina B(1) per kg de proba este data prin formula:
S x V
W x Y
in care: Y = volumul in microlitri de extract depus pe placa (10 sau 20 æl); S = cantitatea in nanograme de aflatoxina B(1) din spotul de extras (proportional valorii Y luate) dedusa din masuratori; V = volumul final al extractului in microlitri, permitand orice dilutie ce a fost necesara; W = greutatea in grame a probei corespondente volumului din extractul supus la curatarea coloanei. 7. Prepararea si testarea solutiei standard (3.16.) 7.1. Determinarea concentratiei de aflatoxina B(1) Se prepara o solutie standard de aflatoxina B(1) in cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.) cu o concentratie de 8 la 10 æg/ml. Se determina spectrul de absorbtie intre lungimile de unda de 330 si 370 nm cu ajutorul spectrofotometrului (4.11.). Se masoara densitatea optica (A) la lungimea de unda de 363 nm, in cazul solutiei de cloroform; sau la lungimea de unda de 348 nm, in cazul solutiei de amestec de benzen/acetonitril. Se calculeaza concentratia in micrograme de aflatoxina B(1) per ml de solutie prin formula de mai jos:
312 x A x 1000
20600
312 x A x 1000 -------------- pentru solutia din amestecul benzen/acetonitril 19800
Se dilueaza dupa cum este corespunzator, departe de lumina zilei, pentru a obtine o solutie de lucru standard cu o concentratie de aflatoxina B(1) de aproximativ 0,1 æg/ml. Daca se pastreaza intr-un refrigerator la 4°C aceasta solutie este stabila timp de doua saptamani. 7.2. Testarea puritatii cromatografice Se depune pe o placa (4.8.) 5 æl de solutie standard de aflatoxina B(1) ce contine 8 pana la 10 æg/ml (7.1.). Se developeaza cromatograma asa cum s-a indicat la 5.4. In lumina UV cromatograma trebuie sa indice numai un spot si nu trebuie sa fie perceptibila nici o fluorescenta in zona de depozitare originala. 8. Repetabilitate Diferenta dintre rezultatele celor doua determinari paralele, efectuate pe aceeasi proba, prin aceeasi analiza, nu trebuie sa depaseasca: - 25% corelata cu rezultatul cel mai mare pentru un continut de aflatoxina B(1) de la 10 si pana la 20 æg/kg - 5 æg, in valoare absoluta, pentru un continut mai mare de 20 si pana la 50 æg/kg - 10% corelata cu valoarea cea mai mare pentru un continut de aproximativ 50 æg/kg 9. Reproductibilitate A se vedea "Observatii", Partea C, punctul 2 B. Metoda cromatografica bidimensionala in strat subtire 1. Domeniu si scop Metoda face posibil sa se determine nivelul de aflatoxina B(1) din furaje ce nu sunt in domeniul de aplicare al metodei A. Limita inferioara a determinarii este 0,01 mg/kg (10 ppb). Metoda nu este aplicabila furajelor ce contin pulpa de fructe citrice. 2. Principiu Proba este supusa extractiei cu cloroform. Extractul este filtrat si o portiune alicota este prelevata si purificata prin cromatografie in coloana pe silicagel. Eluatul este evaporat si reziduul redizolvat intr-un volum specific de cloroform sau intr-un amestec de benzen cu acetonitril. O portiune alicota din aceasta solutie este supusa cromatografiei bidimensionale in strat subtire (CSS). Cantitatea de aflatoxina B(1) este determinata in baza iradierii cu radiatie UV a cromatogramei, fie vizual fie prin fluorodensitometrie, prin comparare cu cantitati cunoscute de aflatoxina standard B(1). Identitatea aflatoxinei B(1) extrasa din furaj trebuie sa fie confirmata prin procedura indicata. 3. Reactivi NB: Toti reactivii trebuie sa fie de calitate "reactivi analitici" numai daca nu s-a stabilit altfel. 3.1. Acetona 3.2. Cloroform, stabilizat cu 0,75 pana la 1% la 96% etanol (v/v). 3.3. N-hexan 3.4. Metanol 3.5. Eter etilic anhidru, liber de peroxidaze 3.6. Amestec de benzen si acetonitril: 98/2 (v/v) 3.7. Amestec de cloroform (3.2.) si metanol (3.4.): 97/3 (v/v) 3.8. Silicagel pentru cromatografie in coloana, particule de marime 0,705 pana la 0,720 mm. 3.9. Vata de bumbac absorbanta, anterior degresata cu cloroform, sau vata de sticla 3.10. Sulfat de sodiu, anhidru, granular 3.11. Gaz inert, de ex. azot 3.12. Acid clorhidric 1 N 3.13. Diatomit, (hyflosupercel), spalat in acid. 3.14. Silicagel G-HR sau echivalent pentru CSS 3.15. Solventi de developare 3.15.1. Eter etilic (3.5.)/metanol (3.4.)/apa: 94/4.5/1.5 (v/v/v), solutie mama nesaturata 3.15.2. Cloroform (3.2.)/acetona (3.1.): 9/1 (v/v), solutie mama nesaturata 3.16. Solutie standard cu aproximativ 0,1 æg aflatoxina B(1) per ml in cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.), preparata si verificata asa cum este descris la punctul 7 al metodei A. 4. Aparatura A se vedea punctul 4 al metodei A 5. Procedura 5.1. Prepararea probei 5.2. Extractie vezi punctele 5.1., 5.2. si 5.3. ale metodei A
5.3. Curatarea coloanei 5.4. CCS bidimensionala 5.4.1. Aplicarea solutiilor (urmariti diagrama din figura 1)
NOTA(CTCE) Figura 1, se gaseste in Monitorul Oficial al Romanie, Partea I, nr. 1020 bis din 4 noiembrie 2004.
Se traseaza pe o placa (4.8.) doua linii drepte paralele cu cele doua margini drepte (respectiv 5 si 6 cm de fiecare parte), pentru a se limita migrarea fronturilor de solvent. Se depun urmatoarele solutii pe placa utilizand pipete capilare sau microseringi: - in punctul A, 20 æl de extract de proba purificat obtinut la 5.3; - in punctul B, 20 æl de solutie standard (3.16.); - in punctul C, 10 æl de solutie standard (3.16.); - in punctul D, 20 æl de solutie standard (3.16.); - in punctul E, 40 æl de solutie standard (3.16.); Se usuca sub jet usor de aer sau gaz inert (3.11.). Spoturile obtinute trebuie sa aiba un diametru de aproximativ 5 mm. 5.4.2. Developare (se urmareste diagrama din figura 1) Se developeaza cromatograma in directia I, la intuneric, utilizand solvent de developare (3.15.1.) (strat de 1 cm intr-o solutie mama nesaturata) pana cand frontul de solvent atinge linia limita a solventului. Se indeparteaza solutia mama de pe placa si se lasa sa se usuce la intuneric, la temperatura ambianta, timp de cincisprezece minute. Se developeaza apoi cromatograma in directia II, la intuneric, utilizand solvent de developare (3.15.2.) (un strat de 1 cm intr-o solutie mama nesaturata) pana cand frontul de solvent ajunge la linia limita a solventului. Se muta placa de la recipient si se lasa sa se usuce la intuneric, la temperatura ambianta. 5.4.3. Interpretarea cromatogramei (se urmareste diagrama din figura 2)
NOTA(CTCE) Figura 2, se gaseste in Monitorul Oficial al Romanie, Partea I, nr. 1020 bis din 4 noiembrie 2004.
Se iradiaza cromatograma cu lumina UV, prin plasarea placii la 10 cm de (4.9.). Se localizeaza pozitia spoturilor albastre fluorescente din punctele B, C, D si E ale aflatoxinei B(1) din solutia standard. Se proiecteaza doua linii imaginare ce trec prin aceste spoturi si perpendiculare pe directiile de developare. Intersectia P a acestor linii este locul in care se asteapta sa se gaseasca spotul aflatoxinei B(1) ce provine din extractul proba aplicat in punctul A (figura 1). Totusi, locatia actuala a spotului de aflatoxina poate fi la un punct Q la intersectia celor doua linii imaginare drepte ce formeaza un unghi de aproximativ 100°C intre ele ce trec pin spoturile B si respectiv C. Se determina cantitatea de aflatoxina B(1) din extractul proba asa cum s-a indicat la 5.5. 5.4.4. Cromatografie suplimentara Se traseaza pe o placa noua (4.8.) doua linii drepte paralele cu cele doua margini drepte, asa cum s-a indicat in diagrama din figura 1, si se aplica la punctul A (vezi figura 1) 20 æl de extract de proba purificat obtinut la 5.3 si superpozitionata pe aceasta, 20 æl de solutie standard (3.16.). Se developeaza asa cum s-a indicat la 5.4.2. Se iradiaza cromatograma cu lumina UV (4.9.) si se verifica daca: - spoturile de aflatoxina B(1) din extract si din solutia standard se suprapun, - fluorescenta acestui spot este mult mai intensa decat cea a aflatoxinei B(1), spot developat la Q pe prima placa. 5.5. Determinari cantitative Se determina fie vizual fie prin fluorodensitometru asa cum s-a indicat mai jos. 5.5.1. Masurari vizuale Se determina cantitatea de aflatoxina B(1) din extract prin compararea intensitatii fluorescentei din spotul extract cu cea a spoturilor din punctele C, D si E din solutia standard. Se interpoleaza daca este necesar. Daca intensitatea fluorescentei obtinuta prin intermediul a 20 æl de extract este mai mare decat cea obtinuta cu 40 æl de solutie standard, se dilueaza extractul de 10 sau 100 de ori cu cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.) inainte sa fie supus din nou cromatografiei in strat subtire. 5.5.2. Masurari prin fluorodensitometru Se masoara intensitatea fluorescentei spoturilor de aflatoxina B(1) cu fluorodensitometru (4.12.), utilizand o excitatie a lungimii de unda de 365 nm si o emisiune a lungimii de unda de 443 nm. Se determina cantitatea de aflatoxina B(1) din spotul extract, prin compararea intensitatii fluorescente cu cea din spoturile din punctele C, D si E din solutia standard. 5.6. Confirmarea identitatii aflatoxinei B(1) A se vedea punctul 5.6 al metodei A. 6. Calcularea rezultatelor A se vedea punctul 6 al metodei A. 7. Repetabilitate A se vedea punctul 8 al metodei A 8. Reproductibilitate A se vedea "Observatii", Partea C, punctul 2 C. Observatii privind metodele A si B. 1. Degresare Probele ce contin mai mult de 5% grasimi trebuie sa fie degresate cu eter de petrol (bp 40 pana la 60°C) dupa prepararile indicate la 5.1. In astfel de cazuri, rezultatele analitice trebuie sa fie exprimate in functie de greutatea probei nedegresate. 2. Reproductibilitatea rezultatelor pentru metoda A Reproductibilitatea rezultatelor, de ex. variatia dintre rezultatele obtinute in doua sau mai multe laboratoare privind aceeasi proba a fost estimata la: ± 50% din valoarea medie pentru valorile medii ale aflatoxinei B(1) de la 10 si pana la 20 mg/kg; ± 10 mg/kg din valoarea medie pentru valori medii mai mari de 20 si pana la 50 mg/kg; ± 20% din valoarea medie pentru valori medii peste 50 mg/kg.
------------
Newsletter GRATUIT
Aboneaza-te si primesti zilnic Monitorul Oficial pe email
