Comunica experienta
MonitorulJuridic.ro
*) Aprobata prin <>Ordinul nr. 21 din 10 iunie 2004 , publicat in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I, nr. 1020 din 4 noiembrie 2004. ART. 1 Analizele pentru continutul in halofuginona in scopul controlului oficial al furajelor trebuie sa fie efectuate utilizand metodele descrise de anexa la prezenta norma veterinara. ART. 2 (1) Autoritatea veterinara centrala a Romaniei poate adopta acte normative sau prevederi administrative suplimentare prezentei norme veterinare, pentru a dispune implementarea si respectarea prevederilor acesteia. (2) Autoritatea veterinara centrala va lua masurile necesare si va sanctiona, potrivit legii, orice incalcare a prevederilor prezentei norme veterinare. (3) Atunci cand autoritatea veterinara centrala a Romaniei adopta cele mentionate la alineatele precedente, trebuie sa se faca o referire expresa la prezenta norma veterinara. ANEXA -----la norma veterinara------------------- DETERMINAREA HALOFUGINONEI DL-trans-7-bromo-6-cloro-3-[3-(3-hidroxi-2-piperidil) acetonil]-quinazolin-4-(3H)-1 bromhidrat 1. Scop si aplicabilitate Aceasta metoda are ca scop determinarea halofuginonei din furaje. Limita minima a determinarii este de 1 mg/kg. 2. Principiu Dupa tratare cu apa fierbinte, halofuginona este extrasa ca baza libera in acetat de etil si dupa aceea separata ca si clorhidrat, intr-o solutie acida apoasa. Extractul este purificat prin cromatografie de schimb ionic. Continutul in halofuginona este determinat prin cromatografie lichida de inalta performanta in faza inversa (RP-HPLC) ce utilizeaza un detector cu UV. 3. Reactivi 3.1. Acetonitril, grade HPLC 3.2. Rasina Amberlite XAD-2 3.3. Acetat de amoniu 3.4. Acetat de etil 3.5. Acid acetic glacial 3.6. Substanta standard halofuginona (DL-trans-7-bromo-6-cloro-3-[3-(3- hidroxi-2-piperidil) acetonil]-quinazolin-4-(3H)-1 bromhidrat, E 764) 3.6.1. Solutie standard (etalon) stoc de halofuginona, 100 mg/ml. Se cantaresc, cu aproximatie de 0,1 mg, 50 mg halofuginona (3.6) intr-un balon cotat de 500 ml, se dizolva in solutie tampon de acetat de amoniu (3.18), se aduce la semn cu solutie tampon si se amesteca. Aceasta solutie este stabila timp de 3 saptamani, la 5°C daca este pastrata la intuneric. 3.6.2. Calibrarea (etalonarea) solutiilor Intr-o serie de baloane cotate de 100 ml se transfera 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 si 6,0 ml din solutia standard (etalon) stoc (3.6.1). Se aduce la semn cu faza mobila (3.2.1) si se amesteca. Aceste solutii corespund concentratiilor de 2,0, 3,0, 4,0, si 6,0 mg/ml de halofuginona. Aceste solutii trebuie sa fie proaspat preparate, inainte de utilizare. 3.7. Acid clorhidric (r 20 aproximativ 1,16 g/ml) 3.8. Metanol 3.9. Azotat de argint 3.10. Ascorbat de sodiu 3.11. Carbonat de sodiu 3.12. Clorura de sodiu 3.13. EDTA (sare disodica a acidului etilendiamintetrcetic) 3.14. Apa distilata grade HPLC 3.15. Solutie de carbonat de sodiu, v = 10 g/100 ml 3.16. Solutie de carbonat de sodiu saturata in clorura de sodiu, v = 5 g/100 ml Se dizolva 50 g carbonat de sodiu (3.11) in apa, se dilueaza pana la 1 litru si se adauga clorura de sodiu (3.12) pana cand solutia devine saturata. 3.17. Acid clorhidric, aproximativ 0,1 mol/l Se dilueaza 10 ml HCl (3.7) cu apa pana la 1 litru. 3.18. Solutie tampon de acetat de amoniu, aproximativ 0,25 Se dizolva 19,3 g acetat de amoniu (3.3) si 30 ml acid acetic (3.5) in apa (3.14) si se dilueaza pana la 1 litru. 3.19. Prepararea rasinii Amberlite XAD-2 Se spala o cantitate corespunzatoare de Amberlite (3.2) cu apa pana se elimina toti ionii de clorura, asa cum este indicat printr-un test cu nitrat de argint efectuat in faza apoasa eliminata. Apoi se spala rasina cu 50 ml metanol (3.8), se inlatura metanolul si se pastreaza rasina in metanol proaspat. 3.20. Solutie nitrat de argint, aproximativ 0,1 mol/l Se dizolva 0,17 g nitrat de argint (3.9) in 10 ml apa. 3.21. Faza mobila HPLC Se amesteca 500 ml acetonitril (3.1) cu 300 ml solutie tampon acetat de amoniu (3.18) si 1200 ml apa (3.14), pH-ul se ajusteaza la 4,3 utilizandu-se acid acetic (3.5). Se filtreaza prin filtru de 0,22 mm (4.8) si se degazeaza solutia (ex. prin ultrasunete timp de 10 minute). Aceasta solutie este stabila timp de o luna, daca este pastrata la intuneric intr-un recipient inchis. 4. Aparatura 4.1. Baie de ultrasunete 4.2. Evaporator cu film rotativ 4.3. Centrifuga 4.4. Echipament HPLC cu detector UV cu lungimi de unda variabile sau detector cu sistem de diode in linie. 4.4.1. Coloana de cromatografie lichida: 300 mm x 4 mm, C 18, 10 mm sau o coloana echivalenta. 4.5. Coloana de sticla (300 mm x 10 mm) prevazuta cu filtru din sticla sinterizata si robinet. 4.6. Filtre din fibre de sticla, diametru 150 mm 4.7. Filtru cu membrana de 0,45 mm 4.8. Filtru cu membrana de 0,22 mm 5. Metoda de lucru Nota: Halofuginona ca baza libera este instabila in solutii alcaline si de acetat de etil. Aceasta nu trebuie sa ramana in acetat de etil mai mult de 30 minute. 5.1. Generalitati 5.1.1. Trebuie analizat un furaj martor pentru a se verifica absenta halofuginonei si interferenta substantelor. 5.1.2. Trebuie efectuat un test de randament prin care se analizeaza un furaj martor ce a fost imbogatit prin adaugarea unei cantitati de halofuginona identica cu cea prezenta in proba. Pentru a se imbogati la un nivel de 3 mg/kg, se adauga 300 ml solutie standard (etalon) stoc (3.6.1) la 10 g din furajul martor, se amesteca si se asteapta timp de 10 minute inainte de procedura de extractie (5.2). Nota: In cadrul acestei metode, furajul martor trebuie sa fie similar, ca tip, cu cel al probei de cercetat, iar cu privire la analiza, nu trebuie sa fie detectata halofuginona. 5.2. Extractie Se cantaresc, cu o precizie de 0,1 g, 10 g din proba preparata intr-un tub de centrifuga de 200 ml, se adauga 0,5 g ascorbat de sodiu (3.10), 0,5 ml EDTA (3.13) si 20 ml apa si se amesteca. Se transfera intr-un pahar conic de 250 ml si se adauga 100,0 ml metanol acidifiat (3.2). Se introduce tubul timp de 5 minute intr-o baie de apa (80°C). Dupa racire la temperatura camerei, se adauga 20 ml solutie carbonat de sodiu (3.15) si se amesteca. Imediat se adauga 100 ml acetat de etil (3.4) si se agita energic timp de 15 secunde. Apoi se introduce tubul timp de trei minute in baia de ultrasunete (4.1) si se desface dopul. Se centrifugheaza timp de 2 minute si se decanteaza faza de acetat de etil prin filtrul din fibra de sticla (4.6), intr-o palnie de separare de 500 ml. Se repeta extractia probei cu a doua parte de 100 ml de acetat de etil. Se spala extractele combinate timp de un minut cu 50 ml solutie de carbonat de sodiu saturata in clorura de sodiu (3.16) si se inlatura faza apoasa. Se extrage faza organica timp de 1 minut cu 5 ml acid clorhidric (3.17). Se transfera faza acida inferioara intr-o palnie de separare de 250 ml. Se extrage din nou faza organica timp de 1,5 minute cu o alta parte de 50 ml acid clorhidric si se combina cu primul extract. Se spala extractele acide combinate prin agitare timp de aproximativ 10 secunde cu 10 ml acetat de etil (3.4). Se transfera cantitativ faza apoasa intr-un balon cu fund rotund de 250 ml si se elimina faza organica. Se evapora tot restul de acetat de etil din solutia acida utilizand un evaporator cu film rotativ (2.4) temperatura baii de apa nu trebuie sa depaseasca 40°C. Sub un vid de aproximativ 25 mbar toate reziduurile de acetat de etil trebuie sa se elimine in 5 minute, la 38°C. 5.3. Purificarea 5.3.1. Prepararea coloanei de Amberlite Pentru fiecare extract de proba se prepara o coloana XAD-2. (3.8). Se transfera 10 g de Amberlite preparat intr-o coloana de sticla cu metanol (4.5). Se adauga un mic tampon de vata de sticla deasupra stratului de rasina. Se scurge metanolul din coloana cu metanol si se spala rasina cu 100 ml apa, oprind scurgerea in momentul in care lichidul ajunge la suprafata stratului de rasina. Coloana se lasa sa se stabilizeze timp de 10 minute inainte de utilizare. Niciodata nu se lasa coloana sa se usuce. 5.3.2. Purificarea probei Extractul se transfera (5.2) la suprafata coloanei de Amberlite preparata (5.3.1) si se elueaza, indepartand eluantul. Viteza de elutie nu trebuie sa depaseasca 20 ml/minut. Se clateste balonul cu fund rotund cu 20 ml acid clorhidric (3.17) si se utilizeaza aceasta solutie la spalarea coloanei rasinii. Se sufla asupra solutiei de acid ce a ramas cu un curent de aer. Se indeparteaza lichidele de spalare. Se adauga 100 ml metanol (3.8), in coloana si se lasa sa elueze 5-10 ml colectand eluantul intr-un balon cu fund rotund de 250 ml. Metanolul ramas se lasa timp de zece minute sa se stabilizeze cu rasina si se continua elutia la o viteza ce nu depaseste 20 ml/minut, colectand eluantul in acelasi balon cu fund rotund. Se evapora metanolul cu ajutorul evaporatorului cu film rotativ (4.2), temperatura baii de apa nu trebuie sa depaseasca 40°C. Se transfera cantitativ reziduul intr-un balon cotat de 10 ml utilizand faza mobila (3.21). Se aduce la semn cu faza mobila si se amesteca. O parte alicota este filtrata prin membrana filtrului (4.7). Aceasta solutie se stocheaza pentru determinare HPLC (5.4). 5.4. Determinare HPLC 5.4.1. Parametri Urmatoarele conditii sunt oferite pentru orientare, putand fi utilizate, cu conditia sa ofere rezultate echivalente: Coloana de cromatografie lichida (4.4.1), faza mobila HPLC (3.21), Debit: 1,5-2 ml/minut, Lungime de unda: 243 nm, Volum injectat: 40-100 ml. Se verifica stabilitatea sistemului cromatografic, se injecteaza solutia de etalonare (3.9.3) ce contine 3,0 mg/ml, de cate ori este nevoie, pana cand sunt obtinute inaltimi sau arii ale picului si timpi de retentie constanti. 5.4.2. Curba de etalonare Se injecteaza fiecare solutie de etalonare (3.6.2.) de cate ori este nevoie si se masoara inaltimile picurilor (ariilor) pentru fiecare concentratie. Se reprezinta grafic o curba de etalonare utilizand mediile picurilor sau ariilor principale ale solutiilor de etalonare ca ordonate si concentratiile corespunzatoare in mg/ml ca abscise. 5.4.3. Solutia probei Se injecteaza extractul probei (5.3.2) de cate ori este necesar, utilizand aceleasi volume luate drept solutii de etalonare si se determina inaltimea (aria) medie a picului de halofuginona. 6. Calcularea rezultatelor Se determina concentratia probelor in mg/ml din media inaltimilor (ariilor) picurilor de halofuginona a probelor, prin referire la curba de etalonare (5.4.2). Continutul probei in halofuginona w (mg/ml) este dat de urmatoarea formula:
m
in care: c = concentratia probei in halofuginona, in mg/ml, m = masa probei exprimata in g 7. Validarea rezultatelor 7.1. Identitate Identitatea produsului analizat poate fi confirmata prin cocromatografie sau prin utilizarea unui detector cu sistem de diode, prin care sunt comparate spectrul extractului probei si al solutiei de calibrare (3.6.2) ce contine 6 mg/ml. 7.1.1. Co-cromatografia Un extract al probei este imbogatit prin adaugarea unei cantitati corespunzatoare din solutia etalon (3.9.3). Cantitatea de halofuginona adaugata trebuie sa fie similara cantitatii estimate de halofuginona detectata in extractul probei. Numai inaltimea picurilor de halofuginona trebuie sa creasca dupa luarea in calcul a ambelor cantitati adaugate si diluarea extractului. Largimea picului, la jumatate din inaltimea maxima, trebuie sa se incadreze in maxim ±10% din largimea initiala. 7.1.2. Detectarea prin sistemul de diode Rezultatele sunt evaluate in conformitate cu urmatoarele criterii: a) lungimea de unda a absorbtiei maxime a probei si a spectrelor standard, inregistrate pe cromatograma la varful picului, trebuie sa fie aceeasi cu o limita de siguranta determinata prin puterea de rezolutie a sistemului de detectare. Pentru detectare prin sistemul de diode, aceasta este tipica in cadrul a ±2 nm. b) intre 225 si 300 nm, spectrul standard si al probei, inregistrate pe cromatograma, la varful picului, nu trebuie sa fie diferite pentru acele parti ale spectrului cuprinse intre 10 si 100% ale absorbtiei relative. Acest criteriu este indeplinit cand sunt prezente aceleasi maxime si cand la nici un punct observat deviatia intre cele doua spectre nu depaseste 15% din absorbtia probei de analizat standard. c) intre 225 si 300 nm, spectrul curbei ascendente, al varfului si al curbei descendente a picului, produse de extractul probei nu trebuie sa fie diferit unul de celalalt pentru acele parti ale spectrului in interiorul gamei de la 10 la 100% de absorbtie relativa. Acest criteriu este indeplinit cand sunt prezente aceleasi maxime si cand la toate punctele observate deviatia intre spectre nu depaseste 15% din absorbtia spectrului varfului. Daca unul din aceste criterii nu este indeplinit, prezenta substantei de analizat nu este confirmata. 7.2. Repetabilitate Diferenta intre rezultatele a 2 determinari paralele, efectuate pe aceeasi proba, nu trebuie sa depaseasca 0,5 mg/kg pentru un continut in halofuginona, pana la 3 mg/kg. 7.3. Randament Pentru proba martor imbogatita, randamentul trebuie sa fie de minim 80%. 8. Rezultatele unui studiu de colaborare A fost organizat un studiu de colaborare(1) in care trei probe au fost analizate in opt laboratoare. Rezultate
┌───────────────────┬────────────┬──────────────────────┬──────────────────────┐
│ │ Proba A │ Proba B (Faina) │ Proba C (Pelete) │
│ │ (Martor) ├──────────┬───────────┼──────────┬───────────┤
│ │ la primire │la primire│dupa 2 luni│la primire│dupa 2 luni│
├───────────────────┼────────────┼──────────┼───────────┼──────────┼───────────┤
│ Media(1) │ n.d. │ 2,80 │ 2,42 │ 2,89 │ 2,45 │
├───────────────────┼────────────┼──────────┼───────────┼──────────┼───────────┤
│ Sr │ - │ 0,45 │ 0,43 │ 0,40 │ 0,42 │
├───────────────────┼────────────┼──────────┼───────────┼──────────┼───────────┤
│ CV(R) │ - │ 16 │ 18 │ 14 │ 17 │
├───────────────────┼────────────┼──────────┼───────────┼──────────┼───────────┤
│ rec. │ │ 86 │ 74 │ 88 │ 75 │
└───────────────────┴────────────┴──────────┴───────────┴──────────┴───────────┘
(1) unitati: in mg/kg
n.d.: nedetectata
SR: deviatia standard a reproductibilitatii
CV(R): coeficient de variatie (%)
rec.: randament (%)
Newsletter GRATUIT
Aboneaza-te si primesti zilnic Monitorul Oficial pe email
Comentarii
Fii primul care comenteaza.
