────────── Aprobat prin Ordinul nr. 6 din 4 ianuarie 2018, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 88 din 30 ianuarie 2018────────── 2017 Autori: Daniela HOMORODEAN, medic primar microbiologic, doctor în ştiinţe medicale, coordonator al reţelei naţionale a laboratoarelor de micobacteriologie, şef Laboratorul Naţional de Referinţă Cluj Napoca, Spitalul Clinic de Pneumoftiziologie Leon Daniello Cluj Napoca. Adriana MOISOIU, medic primar medicină de laborator, doctor în ştiinţe medicale, şef Laboratorul Naţional de Referinţă Bucureşti, Institutul Naţional de Pneumoftiziologie Marius Nasta Bucureşti. Anexa nr. 1 Prepararea reactivilor Abrevieri ABG: antibiogramă ADS: Apă Distilată Sterilă Ag: antigen AS: supliment antibiotic BAAR: bacili acido-alcoolo-rezistenţi CAP: Capreomicină CC: controlul creşterii CIC-M: control intern al calităţii pentru examenul microscopic CPM: Cabinet de Protecţie Microbiologică EDTA: Etilen-Diamina Tetra-Acetică EMB: Etambutol ENC: Extraction Negative Control FRC: forţă relativă de centrifugare GS: supliment de creştere IL: instrucţiune de lucru INH: izoniazidă LBS3: laborator cu nivel 3 de biosiguranţă LBS2: laborator cu nivel 2 de biosiguranţă LJ: mediul de cultură Lowenstein Jensen LPA: (Line Probe Assay), metodă de hibridizare pe suport de nitroceluloză MGIT: Mycobacterium Growth Indicator Tube MOX: Moxifloxacină MTB: Mycobacterium tuberculosis NTM: micobacterii netuberculoase OADC: Oleic acid, Albumină, Dextroză, Catalază OFL: Ofloxacină PANTA: Polymixin B, Amphotericin B, Nalidixic Acid, Trimethoprim, Azlocillin PCR: (Polimerase Chain Reaction) reacţie de polimerizare în lanţ PNPSCT: Programul Naţional de Prevenire, Supraveghere şi Control al Tuberculozei RIE: RMP, INH, EMB RMP: rifampicină RT-PCR: (Real Time PCR) reacţie de polimerizare în lanţ în timp real SFS: Ser Fiziologic Steril SIRE: SM, INH, RMP, EMB TB: tuberculoză TB-MDR: tuberculoză multidrog rezistentă TDD: timp de detecţie UC: unităţi de creştere UFC: unităţi formatoare de colonii U.V.: ultra-violet VT: VersaTREK VTM: VersaTREK Myco ZN: coloraţia Zichl Neelsen 1. Recoltarea, păstrarea şi transportul probelor la laborator Se pot obţine rezultate de laborator de calitate bună doar dacă probele de la pacienţi sunt de calitate bună, recoltate de personal instruit, iar pacienţii au fost instruiţi asupra recoltării corecte. Probele trebuie să fie corect identificate şi etichetate, păstrate şi apoi transportate la laborator în condiţii corespunzătoare^1,2,2b. Recoltarea sputei de la persoanele suspecte de tuberculoză (TB) se face înainte de începerea tratamentului specific antituberculos. În cazul terapiei intermitente din faza de continuare a tratamentului, când medicaţia anti-TB se administrează de 2 sau 3 ori pe săptămână, se va recolta sputa în dimineaţa dinaintea administrării medicaţiei anti-tuberculoase^3,4,5,5a. Se recoltează câte două eşantioane de spută de la pacienţii suspecţi de TB atât pentru diagnostic, cât şi pentru monitorizarea tratamentului, la intervale de timp stabilite pentru fiecare categorie de bolnavi^5. Pentru recoltare vor fi respectate recomandările din Ghidul metodologic de implementare a PNPSCT^5, prezentate în continuare. 1. Recoltarea şi mânuirea produselor patologice se fac astfel încât să fie evitată: ● contaminarea cu bacterii şi fungi a produsului patologic; ● diseminarea germenilor în mediul ambiant; ● infectarea personalului medical implicat. 2. Recoltarea şi mânuirea produselor patologice se face sub supravegherea unui cadru medical instruit pentru practicile referitoare la Controlul infecţiei, care trebuie să se asigure că produsul recoltat provine de la un pacient corect identificat şi corespunde recomandărilor naţionale şi internaţionale. 3. Respectarea normelor generate de recoltare şi anume: ● în cazul persoanelor suspecte de TB, produsele se recoltează înainte de începerea tratamentului antituberculos. ● repetarea examenului bacteriologic în zile succesive. La suspecţii de TB pulmonară, dacă primele două examinări au fost negative iar suspiciunea de TB se menţine, se poate solicita recoltare şi examinare pentru încă 2 eşantioane de spută (dar până la maxim 4 spute suplimentare). ● caracteristicile recipientelor pentru recoltarea sputei: o confecţionate din material plastic, incasabil, transparent - pentru a putea aprecia cantitatea şi calitatea produsului patologic fără a deschide recipientul; o cu deschidere largă (minim 35 mm diametru) - pentru evitarea contaminării pereţilor exteriori ai recipientului în timpul recoltării; o capacitate de 30-50 ml pentru spută şi adaptată pentru fiecare tip de produs patologic; o cu capac cu filet care închide etanş recipientul; o cu posibilitatea de a fi marcate cu uşurinţă pe corpul recipientului. Laboratorul poate să primească spre prelucrare pentru examen bacteriologic o varietate de produse biologice. Acestea se pot împărţi în 2 categorii: ● Produse biologice polimicrobiene care conţin floră normală de colonizare (spută, urină, secreţii din leziuni cutanate, sau produse care nu au fost recoltate aseptic). ● Material biologic steril, de obicei fără microorganisme de contaminare, provenit din colecţii închise. Factorii care pot influenţa viabilitatea micobacteriilor trebuie cunoscuţi şi evitaţi, indiferent de categoria de produs care va fi recoltat: ● administrarea de antibiotice cu efect antituberculos: rifampicină, streptomicină, kanamicină, amikacina, ciprofloxacină, ofloxacină, levofloxacina, moxifloxacină, claritromicină, amoxicilină + acid clavulanic, azitromicina, imipenem, clofazimina, tetracicline, sulfonamide, minociclina. ● conservarea în formol sau recoltarea pe EDTA; ● contactul prelungit cu sucul gastric (peste 3-4 ore); ● păstrarea probelor la căldură sau lumină; ● întârzierea prelucrării produselor patologice (peste 5 zile); ● congelarea prelevatelor. Recoltarea sputei expectorate spontan ● se efectuează ori de câte ori se suspectează TB pulmonară; ● se efectuează în spaţiu special amenajat, "camera de recoltare"; ● se face după instruirea prealabilă a pacientului; ● se face sub supravegherea unui cadru medical (geam/vizor la camera de recoltare); ● se respectă măsurile de control al infecţiilor şi condiţiile optime de păstrare a produselor patologice: ventilaţie corespunzătoare (fereastră), lămpi U.V., măşti, frigider pentru păstrarea probelor (până la maximum 4 zile), uşă cu geam pentru supravegherea recoltării. Pacientul trebuie instruit cu privire la etapele recoltării, înaintea acesteia: ● clătirea gurii cu apă pentru îndepărtarea resturilor alimentare şi a bacteriilor contaminante; ● efectuarea a 2 inspiraţii profunde urmate de reţinerea respiraţiei după fiecare dintre ele timp de câteva secunde, apoi o a treia inspiraţie profundă, urmată de un expir forţat vor declanşa tusea care va uşura expectoraţia; ● depunerea sputei în recipientul/flaconul care se ţine sub buza inferioară. ● spălarea mâinilor după recoltare Cadrul mediu sau persoana instruită care asistă recoltarea: ● instruieşte pacientul asupra modului de recoltare a sputei, deschiderea şi închiderea flaconului; ● înmânează pacientului flacon etichetat cu numele acestuia, scris clar (pe corp, nu pe capac); ● dacă sputa recoltată este insuficientă cantitativ, pacientul trebuie încurajat să expectoreze din nou până la obţinerea rezultatului dorit (la unii pacienţi este nevoie de timp mai îndelungat pentru această manevră); ● dacă nu se obţine o expectoraţie de calitate, ci salivă, recipientul folosit va fi considerat deşeu infecţios şi trebuie îndepărtat ca atare; ● dacă s-a recoltat corect, asiguraţi-vă că recipientul este bine închis. ● spălaţi-vă mâinile cu apă şi săpun; ● daţi un alt recipient etichetat pacientului şi asiguraţi-vă că acesta a înţeles că a doua zi va recolta un nou produs imediat după trezirea de dimineaţă (în caz de recoltare nesupravegheată, la domiciliu); ● arătaţi pacientului cum se închide etanş recipientul. ● se recoltează 2 probe pentru fiecare examinare bacteriologică, ambele sub supraveghere medicală sau una dintre ele emisă spontan în dimineaţa zilei următoare, după instruirea pacientului suspect de TB asupra recoltării corecte.^6,7 Sputa de bună calitate este: în cantitate de 3-5 ml, cu particule purulente; este frecvent vâscoasă şi mucoidă; poate fi fluidă, dar să conţină fragmente de ţesut necrozat; poate fi stratificată în culori de la alb mat la verde^4. Metode speciale de recoltare în caz de suspiciune de tuberculoză pulmonară În cazul pacienţilor care nu expectorează, dar sunt suspecţi de TB pulmonară activă se folosesc alte metode de recoltare: ● sputa indusă cu aerosoli expectoranţi; ● lavajul laringo-traheal cu ser fiziologic steril (SFS); ● aspiratul gastric; ● aspiratul bronşic sau lavajul bronho-alveolar prin bronhoscopie. Pe buletinul de solicitare se menţionează metoda de recoltare/produsul biologic. Sputa indusă Inhalarea de aerosoli calzi salini-hipertoni (soluţie de NaCl 5-10%) irită căile respiratorii şi determină tuse cu expectorarea unui produs apos, cu aspect asemănător salivei, dar provenit din profunzimea arborelui bronşic. Recoltarea: ● se începe cu o primă şedinţă de aerosoli cu durata de 10 minute; ● dacă nu este provocată tusea, se recomandă bolnavului să facă efort de tuse voluntară în următoarele 10 minute. ● în caz de insucces, se reia aerosolizarea cu durata de încă 10-20 minute sau se recurge la altă procedură de recoltare. Lavajul laringo-traheal ● pacientul face gargară cu xilină 1%, repetat de 2 ori; ● cu o seringă cu canulă curbă, sub controlul oglinzii laringiene se introduc 5-10 ml ser fiziologic steril; ● tusea productivă apare în cursul manevrei sau după dispariţia anesteziei; ● se recoltează proba, se verifică volumul şi calitatea ei (aspect grunjos, tulbure); ● se va recolta şi sputa eliminată spontan în următoarele 24 ore. Aspiratul bronşic şi lavajul bronho-alveolar Se efectuează numai în unităţile care au instrumentarul necesar (bronhoscop) şi personal cu competenţă în acest domeniu. Produsul se recoltează direct în recipiente sterile, în timpul manevrei de lavaj, prin bronhoscop. Se va recolta şi sputa eliminată spontan în următoarele 24 de ore. Lavajul laringo-traheal (spălătura bronşică), lavajul bronho-alveolar şi aspiratul bronşic au avantajul că ulterior acestora este posibil să se elimine spontan spută de bună calitate, care se colectează pentru examinare de laborator. Lavajul gastric/aspiratul gastric este recomandat atunci când niciuna dintre metodele menţionate anterior nu este posibilă, pentru următoarele categorii de pacienţi suspecţi de TB: ● pacienţi necooperanţi sau care îşi înghit sputa; ● pacienţi care nu expectorează din cauza unor condiţii coexistente: comă, boli neurologice etc.; ● copiii mici care nu ştiu să expectoreze. Recoltarea se face dimineaţa la trezire, după repaus alimentar de 8-10 ore, înainte ca pacientul să mănânce, de către personal instruit pentru această procedură. ● se aspiră conţinutul stomacului dimineaţa la trezirea din somn (aspirat gastric) cu sondă de unică folosinţă adaptată la seringă (sonda Nelaton la copii sau sonda Einhorn la adulţi); ● dacă volumul de lichid recoltat este redus, se introduc pe sondă 5-10 ml SFS la copii, respectiv 20-30 ml la adulţi; ● se aspiră conţinutul gastric cu o seringă sterilă de 50 ml; ● lichidul aspirat se colectează în recipient steril, cu capac filetat, cu capacitate adecvată. Proba trebuie prelucrată cât mai curând după recoltare deoarece micobacteriile sunt distruse rapid datorită acidităţii gastrice. Dacă nu se poate prelucra în primele 4 ore, se ajustează pH-ul fluidului la valori neutre cu bicarbonat de sodiu sau fosfat disodic. Neutralizarea se face prin amestec în părţi egale de aspirat gastric şi fosfat disodic 15 % steril sau bicarbonat de sodiu 10%, steril, în prezenţa unui indicator de pH. Sensibilitatea metodei scade cu creşterea vârstei. Combinarea inducerii sputei prin folosirea de aerosoli urmată în 30 de minute de lavaj/aspirat gastric creşte procentul de culturi pozitive, comparativ cu utilizarea fiecăreia dintre cele două metode separat.^5a Recoltarea de produse biologice pentru diagnosticul tuberculozei extrapulmonare Colecţiile închise Fluidele (cefalorahidian, pleural, pericardic, sinovial, ascitic, sânge), precum şi alte produse (puroi, măduvă osoasă), sunt recoltate de către medic, utilizând tehnici de aspiraţie sau proceduri chirurgicale. În majoritatea cazurilor de TB extrapulmonară numărul micobacteriilor din leziuni este mic, dar însămânţarea pe medii de cultură cu calităţi nutritive diferite poate creşte şansa izolării acestora. Se folosesc mediul solid Lowenstein - Jensen şi, în funcţie de dotarea laboratorului, mediul lichid Middlebrook 7H9 în sistem automat de cultivare. Dacă produsele patologice cu consistenţă lichidă nu pot fi însămânţate imediat pe medii de cultură, pentru a preveni formarea flocoanelor de fibrină, la 10 ml lichid biologic se va adăuga o picătură de citrat de sodiu 20% steril sau 0,2 mg/ml heparină^2. Nu se va folosi EDTA, care inhibă creşterea micobacteriilor. Transportul la laborator trebuie făcut cât mai repede. Dacă nu se poate asigura transportul imediat către laborator sau se întârzie prelucrarea, se vor păstra la frigider la 4-8°C, dar nu se vor congela. Hemocultura, măduva osoasă Izolarea micobacteriilor din sânge sau măduvă osooasă, în mod particular la cazurile cu infecţie HIV, la care şansa infecţiei diseminate cu micobacterii este mare, se face prin prelucrare specială, folosind sisteme de recoltare şi cultivare dedicate. Este vorba de sistem de centrifugare-liză, în care se realizează liza celulelor sanguine, urmată de centrifugare şi însămânţarea pe medii de cultură, preferabil lichide tip Middlebrook 7H9 (dar nu în sistem MGIT 960). Fragmente tisulare (piese de biopsie) Produsul recoltat trebuie pus după recoltare în recipient steril, fără soluţie de fixare sau conservare. Pentru a preveni deshidratarea în cazul fragmentelor mici, se admite adăugarea unei cantităţi de 0,5 ml ser fiziologic steril, cu menţinerea la temperatură sub +10° C^2,2b. Urina Examinarea mai multor eşantioane (3-4) creşte şansa izolării micobacteriilor. Recoltarea urinei pentru suspiciunea de TB uro-genitală trebuie să fie precedată de: ● excluderea unei infecţii urinare netuberculoase prin efectuarea de uroculturi pentru microbii cu creştere rapidă. ● cu 24-48 ore înaintea recoltării se recomandă regim hiposodat, reducerea cantităţii de lichide ingerate şi suspendarea administrării de produse care acidifiază urina şi influenţează viabilitatea MTB (vitamina C, aspirină, streptomicină, amikacină, kanamicină, chinolone, rifampicină, claritromicină, amoxicilină-clavulanat, imipenem). Recoltarea urinei: ● se face toaleta riguroasă a organelor genitale externe prin spălare cu apă şi săpun; ● se recoltează prima urină de dimineaţă, în 2-4 zile succesive; ● se aruncă primul jet de urină, apoi se colectează într-un recipient steril de 120 ml restul urinii eliminate; ● se transportă imediat la laborator pentru a fi prelucrat; ● dacă nu se poate prelucra imediat se admite păstrarea urinei la frigider (+4 -8°C) cel mult 24 ore. Păstrarea probelor Dacă nu pot fi prelucrate imediat după recoltare, probele sunt păstrate la sediul recoltării (până la organizarea transportului la laborator) sau în laborator după recepţionare şi până la momentul prelucrării, în frigider special dedicat păstrării produselor biologice, la temperatura de +4-8° C, pentru cel mult 3-4 zile de la recoltare, în tăvi sau cutii care pot fi uşor dezinfectate. Urina trebuie prelucrată cât mai curând posibil după recoltare, în aceeaşi zi. Nu se folosesc nici un fel de substanţe cu rol de conservare a probelor păstrate în vederea expedierii pentru prelucrare. Pentru evitarea deshidratării pieselor mici de biopsie, acestea se pot umecta cu câteva picături de SFS. Trimiterea probelor la laborator se face: ● împreună cu formularul de solicitare standardizat, ultima revizuire aprobată în uz (anexa 8 din Ghidul metodologic de implementare a PNPSCT^5 sau revizia comunicată ulterior), completat la toate rubricile; ● un singur formular pentru toate probele, cu date de identificare identice pe recipient şi pe formular. ● etichetarea flacoanelor cu numele şi prenumele bolnavului pe corpul recipientului, nu pe capacul acestuia. ● de către persoana desemnată, instruită, în cutii speciale din plastic, prevăzute cu compartimente pentru separarea şi fixarea flacoanelor cu spută sau alte produse. ● transportul probelor către laborator trebuie realizat imediat după recoltare sau, dacă nu este posibil, acestea se păstrează la frigider (la +4° -8°C maxim 3-4 zile pentru a minimaliza multiplicarea florei de asociaţie). Face excepţie urina, care trebuie recoltată şi prelucrată în aceeaşi zi. Transportul la distanţă a probelor de la pacienţi sau al culturilor Produsele recoltate de la pacienţi şi culturile de M. tuberculosis destinate testării pentru sensibilitate se încadrează în categoria B de marfa din punctul de vedere al riscului pe care îl reprezintă, fiind necesară ambalarea în sistem triplu stratificat^8. La pregătirea unui transport de material categoria B este necesar să fie verificate etapele menţionate în tabelul I.^8 Tabel I. Verificarea ambalării corecte a materialelor din categoria B în vederea transportului
┌────────┬─────────────────────────────┐
│Verifică│Activitate │
├────────┼─────────────────────────────┤
│ │Recipientul PRIMAR, care │
│1 │CONŢINE PROBA (sputa, cultura│
│ │etc.) este │
│ │bine închis cu capac filetat │
├────────┼─────────────────────────────┤
│2 │Fiecare capac este înfăşurat │
│ │cu bandă adezivă │
├────────┼─────────────────────────────┤
│ │Fiecare flacon este numerotat│
│3 │cu numărul complet din │
│ │tabelul │
│ │însoţitor │
├────────┼─────────────────────────────┤
│ │Pentru probele lichide, │
│4 │recipientul este încasabil şi│
│ │conţine maxim │
│ │500 ml. │
├────────┼─────────────────────────────┤
│ │Pentru probele solide (ex. cu│
│5 │mediu de cultură solid) │
│ │recipientele │
│ │primare să fie rezistente, să│
│ │conţină maxim 500g │
├────────┼─────────────────────────────┤
│ │Recipientele primare să fie │
│ │învelite individual sau │
│ │separat şi │
│6 │plasate în RECIPIENTUL │
│ │SECUNDAR. Acesta trebuie să │
│ │fie complet │
│ │închis, să nu permită │
│ │scurgerea în caz de spargere │
│ │accidentală sau │
│ │prelingere din recipientul │
│ │primar. │
├────────┼─────────────────────────────┤
│ │Recipientul secundar să fie │
│7 │certificat de producător │
│ │înainte de │
│ │folosire. │
├────────┼─────────────────────────────┤
│ │Materialul absorbant a fost │
│ │plasat între recipientele │
│8 │primar şi │
│ │secundar în cantitate │
│ │suficientă ca să poată │
│ │absorbi tot conţinutul │
│ │tuturor recipientelor │
│ │primare. │
├────────┼─────────────────────────────┤
│ │Recipientul secundar nu este │
│ │prea plin (poate fi introdus │
│9 │un creion │
│ │între recipientele primare │
│ │după introducerea │
│ │materialului │
│ │absorbant). │
├────────┼─────────────────────────────┤
│ │Între ambalajul secundar şi │
│10 │terţiar se plasează │
│ │acumulatorul rece │
│ │furnizat odată cu cutia. │
├────────┼─────────────────────────────┤
│ │Este inclusă o listă cu │
│ │conţinutul pentru fiecare │
│11 │transport. Lista │
│ │(tabel) să includă şi nr. de │
│ │telefon, fax, adresa de │
│ │e-mail a │
│ │expeditorului şi │
│ │destinatarului │
├────────┼─────────────────────────────┤
│ │AMBALAJUL EXTERIOR, care │
│ │conţine ambalajul primar şi │
│12 │secundar să │
│ │fie robust, incasabil, │
│ │rezistent, cu dimensiuni │
│ │adecvate │
│ │conţinutului. │
├────────┼─────────────────────────────┤
│ │Ambalajul exterior nu trebuie│
│13 │să fie mai mare de 4 litri │
│ │pentru │
│ │transportul de lichide. │
├────────┼─────────────────────────────┤
│ │În cazul probelor solide, │
│ │ambalajul extern să nu fie │
│14 │mai mare decât │
│ │pentru un total de 4 kg, iar │
│ │fiecare din recipientele │
│ │primare să nu │
│ │conţină mai mult de 500 g. │
├────────┼─────────────────────────────┤
│15 │Pachetele se plasează în │
│ │pungile de plastic oferite de│
│ │transportator. │
├────────┼─────────────────────────────┤
│ │Se vor folosi doar ambalaje │
│ │autorizate, care au │
│ │inscripţionată │
│16 │categoria B de material │
│ │biologic şi marca UN 3373. Nu│
│ │mai este │
│ │necesară adăugarea │
│ │pictogramei de pericol │
│ │biologic. │
├────────┼─────────────────────────────┤
│17 │În afara ambalajului terţiar │
│ │se plasează punga/plicul cu │
│ │documentele însoţitoare. │
└────────┴─────────────────────────────┘
Notă: Pentru situaţiile în care este necesar transportul internaţional, acesta se face pe cale aeriană şi se consideră ca material infecţios de categoric A (UN2814), recipientul primar şi secundar trebuie să reziste fără spargere, la o diferenţă de presiune internă de până la 95kPa (14psi), la temperaturi de la -40°C la 55°C (-40°F la 130°F). Sistemul de bază al ambalajului triplu Se utilizează pentru toate substanţele infecţioase şi se compune din trei straturi, astfel: ● Recipientul primar. Conţine proba învelită într-o cantitate suficientă de material absorbant care ar putea absorbi întreaga cantitate de lichid în caz de spargere. ● Ambalajul secundar. Rezistent la şocuri mecanice şi înţepare, etanş, care conţine şi protejează recipientul (ele) primar(e). Mai multe recipiente primare protejate cu material de amortizare pot fi plasate într-un singur ambalaj secundar, cu suficient material suplimentar absorbant pentru a absorbi întreaga cantitate de lichid în caz de spargere. ● Ambalajul exterior. Ambalajele secundare sunt introduse în ambalaje exterioare de transport, protejate cu material adecvat de amortizare. Ambalajele exterioare protejează conţinutul lor de influenţele externe, respectiv deteriorarea fizică în timpul transportului şi trebuie să fie rigid. Cel puţin una dintre suprafeţele exterioare trebuie să aibă dimensiunea de minim 10x10 cm. Pe ambalajul exterior trebuie să fie scrise clar numele şi adresa completă a destinatarului şi expeditorului, inclusiv numerele de telefon. Trebuie să fie menţionat faptul că are în interior material infecţios din categoria B^9,10,11,12. Refolosirea ambalajelor şi expedierea ambalajelor goale Ambalajele de transport pot fi refolosite numai după ce au fost dezinfectate corespunzător. Înainte de reutilizarea ambalajului, expeditorul trebuie să se asigure că toate marcajele şi etichetele indică substanţele care sunt expediate în acel transport. Dacă expeditorul trimite un colet gol, acesta trebuie să fie dezinfectat/sterilizat în prealabil, iar toate marcajele şi etichetele care nu mai sunt necesare trebuie să fie îndepărtate sau acoperite. Transportul trebuie să fie planificat, destinatarul fiind înştiinţat despre intenţia de expediere a coletului, iar destinatarul trebuie să confirme primirea lui. La recepţia probelor în laborator acestea sunt verificate. Nu vor fi prelucrate şi vor fi raportate ca neconformităţi care se comunică imediat medicului solicitant, următoarele situaţii^2,2b: ● Prezintă recipiente sparte sau fisurate, sau din care s-a scurs prelevatul clinic. ● Recipientul este neetichetat sau datele de pe eticheta prelevatului nu corespund cu datele de pe buletinul de cerere de analiză. ● Recipientul cu prelevat clinic nu este însoţit de buletin cu cererea de analiză. ● Prelevatul clinic a fost recoltat într-un recipient neconform (tub de medicamente, tub destinat recoltării sângelui etc.). ● Prelevatul clinic a fost recoltat pe formalină sau EDTA. ● Cantitatea de prelevat clinic este mult prea mică pentru efectuarea analizelor solicitate sau este uscat. ● Nu este corespondenţă între prelevatul clinic trimis şi prelevatul menţionat în foaia de cerere de analiză. ● Timpul scurs de la recoltarea sputei până la predarea la laborator este mai mare de 4 zile. ● Timpul scurs de la recoltarea urinei până la predarea la laborator este mai mare de 1 zi. ● Vor fi respinse de la prelucrare doar sputele intens sanghinolente deoarece există şanse mici de a obţine un rezultat de calitate. Criterii de acceptare a produselor pentru prelucrare^2,2b ● Spută în cantitate de 3-5 ml, cu aspect purulent sau muco-purulent ● Produs recoltat în recipient adecvat produsului recoltat, fără conservanţi ● Recipient corect etichetat ● Transportul s-a realizat în condiţii care nu au afectat proba ● Formularul de însoţire este corect completat Se acceptă spre prelucrare proba, dar este necesară menţionarea situaţiei particulare pe formularul de solicitare^2b: ● Spută cu striuri discrete de sânge - consemnată pe formular ● Spută în cantitate mai mică de 2 ml, dar cu aspect purulent - menţionare pe formular ● Aspect apos al produsului trimis ca spută, fără particule în suspensie - când se scrie pe formularul de solicitare aceasta şi se solicită un eşantion corespunzător de spută sau recoltarea prin altă metodă. ● Piesele de biopsie recoltate pe formalină pot fi folosite doar pentru metodele de biologie moleculară^2a ● LCR în cantitate mai mică de 2 ml 2. Măsuri de biosiguranţă şi controlul infecţiilor M. tuberculosis este inclus în grupa III de risc, care cuprinde microorganisme asociate căii aeriene de pătrundere în organism. Controlul infecţiei în laborator presupune ansamblul măsurilor de reducere a producerii şi răspândirii aerosolilor şi particulelor infecţioase (1-5 μm diametru), cu prevenirea inhalării în timpul activităţii profesionale^2. Măsurile pentru controlul infecţiei se pot grupa în: ● Administrative: reguli, reglementări şi practici pentru reducerea riscului de expunere la infecţie; ● Ecologice (sau inginereşti): reducerea concentraţiei aerosolilor infecţioşi prin ventilaţie naturală sau artificială, filtrare, iradiere; ● Protecţia personală folosind echipament adecvat; ● Evaluarea riscului şi instruirea personalului. Fiecare unitate sanitară trebuie să aibă reguli pentru controlul infecţiei în conformitate cu reglementările naţionale, iar acestea să fie cunoscute de către toţi angajaţii. La recoltarea probelor de la pacient este necesar să fie asigurate şanse maxime ca acestea să fie de bună calitate, dar în acelaşi timp să fie redus la minim riscul contaminării mediului ambiant sau al persoanelor care asistă recoltarea. Nu este acceptată recoltarea sputei în laborator^6. Camerele/boxele de recoltare trebuie să fie prevăzute cu sistem de exhaustare/aerisire, lampă UV, chiuvetă cu apă curentă, fereastră pentru observarea recoltării din exterior. Pe tot traseul probelor recoltate de la pacienţi până la laborator, iar aici pe toată durata prelucrării lor până la eliminarea ca deşeu inactivat, fiecare persoană trebuie să respecte normele de protecţie colectivă şi individuală pentru prevenirea infecţiei. Când se mânuieşte material infecţios este obligatorie folosirea echipamentului de protecţie individuală (halat cu mâneci lungi, mănuşi, mască cu filtru HEPA-FFP2 cu supapă, capelină). Probele care conţin sau ar putea conţine micobacterii se mânuiesc exclusiv în cabinet de protecţie microbiologică (CPM) de clasă II sau I^2. Se include aici şi deschiderea coletelor cu probe primite din alt laborator/spital. Nu este permis lucrul cu material potenţial infecţios la masă. Infectarea cu micobacterii se poate produce pe cale aeriană, digestivă sau cutanată^13. Cunoscând căile posibile de infectare, personalul se poate proteja prin folosirea corectă a echipamentului adecvat de protecţie individuală, prezentat în tabelul II^2b. Infectarea pe cale aeriană în laborator are loc atunci când se produc aerosoli infecţioşi iar personalul nu are protecţie respiratorie adecvată. Următoarele activităţi sunt generatoare de aerosoli infecţioşi: ● deschiderea bruscă a recipientelor cu produs patologic sau/şi deschiderea lor imediat după agitare sau scoaterea din centrifugă; ● etalarea produsului pe lamă (prin strivire între 2 lame, cu pipeta sau cu ansa bacteriologică); ● însămânţarea cu pipeta a produsului patologic dar mai ales a suspensiei bacteriene apoase pentru antibiogramă, inclusiv realizarea diluţiilor pentru aceasta; ● pipetarea eşantionului extras pentru identificarea micobacteriilor; ● descărcarea flacoanelor/supernatantului în recipientul pentru colectare şi autoclavare; ● lucrul cu produs infecţios în faţa ferestrei deschise; ● centrifugarea, dar mai ales deschiderea centrifugii imediat după spargerea unui tub în interiorul centrifugii care nu are protecţie anti-aerosoli; ● extragerea acului seringii din dopul de cauciuc al flacoanelor de cultură în mediul lichid; ● spargerea/vărsarea unui recipient cu suspensie micobacteriană apoasă; ● recoltarea sputei în laborator; Infectarea pe cale digestivă (prin înghiţire) ● pipetarea cu gura a suspensiei bacteriene; ● ingestia de alimente şi lichide în laboratorul de micobacteriologie; ● răsfoirea documentelor cu degetele umezite în gură: ● sugerea de bomboane sau gumă de mestecat; Infectarea pe cale cutanată (prin înţepare) ● înţepare cu ace infectate, pipete Pasteur, cioburi de sticlă; ● plăgi cutanate (ale mâinilor în mod special) neprotejate. Tabel II. Protecţia individuală a personalului din laboratorul de diagnostic al TB
┌────────────┬────────────────┬─────────────┬──────────────┐
│Echipament │Caracteristicile│Protejează şi│Comentarii │
│ │echipamentului │previne │ │
├────────────┼────────────────┼─────────────┼──────────────┤
│ │ │ │Purtate tot │
│ │ │ │timpul cât se │
│ │ │ │lucrează în │
│ │ │ │laborator. │
│Salopetele │Să aibă mâneci │ │Halatul cu │
│de │lungi, să fie │Contaminarea │care se │
│laborator, │încheiate │îmbrăcăminţii│lucrează în │
│halatele sau│la spate dacă se│ │LBS3/LBS2 nu │
│uniformele │lucrează la CPM.│ │trebuie să │
│ │ │ │părăsească │
│ │ │ │încăperea. Se │
│ │ │ │pun în cuier │
│ │ │ │diferit de cel│
│ │ │ │în care se ţin│
│ │ │ │halatele │
│ │ │ │purtate în │
│ │ │ │restul │
│ │ │ │laboratorului.│
├────────────┼────────────────┼─────────────┼──────────────┤
│ │ │ │Purtate când │
│Şorţ │Impermeabil │Contaminarea │se lucrează cu│
│ │ │îmbrăcăminţii│soluţii şi │
│ │ │ │există riscul │
│ │ │ │de stropire │
├────────────┼────────────────┼─────────────┼──────────────┤
│ │ │ │Purtate în │
│ │ │ │timpul tuturor│
│ │ │ │procedurilor │
│ │ │ │care pot │
│ │ │ │implica │
│Mănuşile de │Impermeabile, să│Contaminarea │contactul │
│protecţie │acopere manşeta │tegumentelor │direct sau │
│ │halatului │mâinilor, │accidental cu │
│ │ │zgârierea │sânge, alte │
│ │ │ │fluide sau │
│ │ │ │materiale │
│ │ │ │potenţial │
│ │ │ │infecţioase. │
│ │ │ │Mănuşile se │
│ │ │ │scot aseptic │
│ │ │ │şi apoi se │
│ │ │ │spală │
│ │ │ │mâinile. │
├────────────┼────────────────┼─────────────┼──────────────┤
│ │ │ │Purtate ori de│
│ │ │ │câte ori este │
│ │Să nu │ │necesară │
│Ochelarii de│distorsioneze │ │protecţia │
│protecţie, │imaginea, să │Contaminarea │ochilor şi a │
│ecranele de │aibă │ochilor şi a │feţei de │
│protecţie │corecţia optică │feţei │stropi, │
│facială │necesară │ │obiecte │
│ │operatorului │ │impactante şi │
│ │ │ │surse │
│ │ │ │artificiale │
│ │ │ │de radiaţii │
│ │ │ │ultraviolete. │
├────────────┼────────────────┼─────────────┼──────────────┤
│ │ │Protejarea │Purtată │
│Încălţăminte│Talpă flexibilă,│degetelor şi │exclusiv în │
│de laborator│închisă în faţă │a │laborator │
│ │ │labei │ │
│ │ │piciorului │ │
├────────────┼────────────────┼─────────────┼──────────────┤
│ │ │ │Purtată când │
│ │ │Purifică │se prelucrează│
│Mască │FFP2, cu filtru │aerul │material │
│respiratorie│HEPA, cu supapă,│inspirat şi │infecţios în │
│ │pliantă │previne │proceduri cu │
│ │ │contaminarea │risc de │
│ │ │pe cale │generare de │
│ │ │aeriană │aerosoli sau │
│ │ │ │stropi │
│ │ │ │infecţioşi. │
└────────────┴────────────────┴─────────────┴──────────────┘
Se recomandă: ● diminuarea generării de aerosoli infecţioşi, prin manopere corecte, efectuate cu calm ● lucrul în CPM. ● purtarea măştilor tip HEPA - (high efficiency particulate air) - "respirator", FFP2 cu supapă. Masca obişnuită, chirurgicală, nu conferă protecţie. ● exhaustarea aerului (6-12 schimbări ale aerului/oră) şi evitarea formării curenţilor turbulenţi de aer în încăperea de lucru. Aerisirea încăperilor în pauzele de lucru. ● folosirea perelor de cauciuc pentru aspirare/pipetare. ● se va mânca şi bea numai în încăpere special amenajată în acest scop. ● personalul trebuie să se spele pe mâini după mânuirea materialelor infecţioase şi după scoaterea mănuşilor de protecţie, înainte de părăsirea zonei de lucru a laboratorului. ● dezinfectarea meselor la sfârşitul fiecărei etape de lucru. ● toate materialele (biologice, chimice, toxice) din laborator care ar putea pune în pericol sănătatea personalului trebuie să fie înregistrate în lista de inventariere, cu informaţii relevante despre fiecare agent în parte şi pericolul pe care îl poate produce. ● în laborator trebuie să existe scrise şi cunoscute de tot personalul procedura şi conduita în caz de accident, indiferent de natura lui. Sunt interzise: ● purtarea îmbrăcăminţii protectoare de laborator în afara laboratorului (în cantine, camera pentru personal, saloane cu bolnavi, biblioteci, toalete etc.) - pentru a evita eventuale contaminări ale spatiilor respective. ● încălţămintea decupată în partea din faţă (sandale) sau cu talpă rigidă şi alunecoasă - pentru protejarea degetelor în caz de accident, respectiv pentru prevenirea alunecării. ● pipetarea cu gura - pentru evitarea contaminării pe cale digestivă. ● consumul de alimente, băuturi, machiajul şi mânuirea lentilelor de contact în zonele de lucru ale laboratorului - pentru a nu se produce contaminare pe cale digestivă sau cutanată. ● depozitarea de alimente sau băuturi oriunde în zona de lucru a laboratorului - pentru evitarea contaminării acestora ● mestecatul gumei, sugerea bomboanelor, a capetelor creioanelor în laborator, umezirea degetelor pe limbă - pentru evitarea contaminării digestive. ● ghivece cu flori în laborator - pentru a nu constitui surse de micobacterii non-tuberculoase sau alţi microbi/mucegaiuri. ● folosirea cutiilor din carton ca suport de transport pentru recipientele cu material infecţios, în locul celor din material plastic deoarece acestea nu pot fi dezinfectate, iar în cazul prelingerii materialului infecţios se poate contamina transportatorul sau/şi mediul ambiant. ● folosirea stativelor din lemn sau carton pentru incubarea culturilor deoarece acestea nu pot fi dezinfectate. ● depozitarea îmbrăcăminţii şi încălţămintei care a fost utilizată în laborator în aceleaşi dulapuri cu îmbrăcămintea şi încălţămintea de stradă. Cabinetele de protecţie microbiologica (CPM) şi modul de folosire a lor sunt descrise în "Standarde pentru laboratoarele de tuberculoză - condiţii minime pentru asigurarea siguranţei şi eficienţei activităţilor din laborator". Accidente posibile în laborator şi conduita Indiferent de natura accidentului, nu trebuie să se producă panică. Se opreşte imediat lucrul, se anunţă şeful de laborator şi se aplică măsurile de mai jos, în funcţie de cantitatea estimată de aerosoli generaţi. Accidentele se notează în caietul special pentru acest tip de eveniment. Indiferent de natura lor (chimice, infecţioase), toate accidentele se consemnează în documente destinate acestei categorii de evenimente, cu consecinţele şi măsurile care au fost luate, numele persoanelor expuse. Se interzice accesul în zonă până la finalizarea neutralizării infecţiozităţii. Accidentele se pot produce în spaţiul laboratorului sau în incinta CPM^13. În laborator (în afara CPM) Accident cu producere de aerosoli în cantitate mică: spargerea unui tub cu cultură în mediul solid, vărsarea unui produs patologic. ● acoperă imediat cu prosop, şervete din hârtie sau halat pentru a limita aerosolizarea. ● umezeşte cu dezinfectantul aflat la îndemână (soluţie hipoclorit de sodiu 3-5%, soluţie de fenol 5% în apă). ● lasă să acţioneze cel puţin 2 ore, completând cu dezinfectant. ● strânge materialul - folosind echipament de protecţie (halat, mănuşi, mască HEPA, botoşei) şi pune-l în sac autoclavabil. ● şterge cu dezinfectant mesele şi duşumeaua. Accident cu producere de aerosoli în cantitate mare: spargerea unuia sau mai multor tuburi care conţin bacili în suspensie în mediul lichid în cantitate mare, spargerea unui tub în centrifugă. ● părăseşte încăperea, ● nu deschide centrifuga mai repede de 30 de minute, ● opreşte exhaustarea (dacă există), ● nebulizează dezinfectant - lasă să acţioneze cel puţin 2 ore, ● intră în încăpere cu echipament de protecţie (halat, mănuşi, mască HEPA, botoşei), ● acoperă cu prosop de hârtie, apoi îmbibă spărturile cu dezinfectant şi lasă 30 min, ● strânge resturile şi pune-le în sac autoclavabil, ● şterge cu dezinfectant mesele şi duşumeaua. În cabinetul de protecţie microbiologică Accident cu producere de aerosoli în cantitate mică: spargerea unui tub cu cultură în mediul solid, vărsarea unui produs patologic. ● NU opri funcţionarea cabinetului, ● acoperă imediat cu prosop, cârpă, şervete din hârtie, ● îmbibă cu dezinfectant, ● lasă să acţioneze cel puţin 30 de minute, ● strânge resturile, cu atenţie la cioburi şi pune-le în sac autoclavabil, ● şterge interiorul cabinetului cu dezinfectant, dar şi mesele şi duşumeaua. Accident cu producere de aerosoli în cantitate mare (vărsare suspensie bacteriană, cultură în mediul lichid) ● NU opri funcţionarea cabinetului, ● părăseşte încăperea imediat şi nu reveni mai repede de 4 ore, ● nebulizează dezinfectant: hipoclorit de sodiu 3-5%, lasă să acţioneze cel puţin 2 ore, ● intră în încăpere cu echipament de protecţie (mască HEPA, halat, mănuşi, botoşei), ● strânge resturile şi pune-le în sac autoclavabil, ● şterge cu dezinfectant mesele şi duşumeaua, ● formolizează cabinetul. Toate intervenţiile necesare pentru anularea efectelor unui accident cu potenţial infecţios în laborator se fac de către personal instruit, echipat special pentru a-i fi asigurată protecţia personală. Toate materialele folosite la neutralizarea focarului, deşeurile, echipamentul de protecţie folosit se autoclavează sau se dezinfectează la sfârşitul operaţiunii. Departamentul de epidemiologie al spitalului trebuie să fie informat despre producerea accidentului şi să supravegheze împreună cu medicul de medicina muncii starea de sănătate a personalului expus, timp de 12 luni. Instruirea referitoare la aspectele legate de biosiguranţa şi biosecuritatea în laboratorul de TB trebuie să se adreseze întregului personal din laborator şi să fie organizată anual. 3. Recepţionarea şi înregistrarea probelor în laborator În laborator trebuie să fie amenajat un spaţiu special pentru recepţia probelor^15 Persoana cu calificarea şi instruirea corespunzătoare, desemnată pentru recepţia probelor trebuie să: ● verifice buletinul de solicitare dacă este corect întocmit şi cuprinde toate datele de identificare ale pacientului, probelor, solicitantului şi ale locului prelevării; ● înregistreze proba în Registrul de recepţie a probelor; ● verifice dacă proba este corespunzătoare cantitativ şi calitativ pentru analizele care se solicită; ● verifice dacă proba este ambalată corespunzător şi nu prezintă semne de depreciere datorate ambalării şi transportului necorespunzător. ● noteze ora primirii probei. Dacă proba nu corespunde calitativ (ex. semne vizibile de contaminare bacteriană sau fungică, recipient fisurat, spart, produs intens hematic etc.) sau cantitate insuficientă pentru prelucrarea prin metodele solicitate, ea se respinge de la prelucrare şi se menţionează în registrul de recepţie ca probă neconformă, cu menţionarea neconformităţilor constatate la recepţie, se informează clientul, solicitându-se, dacă este posibil, repetarea prelevării altei probe. Nu se returnează curierului, ci se consideră deşeu infecţios şi va fi gestionată ca atare de către laborator. Se acceptă spre prelucrare sputa cu striuri rare de sânge, dar nu cea intens hematică (a se vedea mai sus, pag. 17-18). Când există îndoieli referitoare la adecvarea unei probe sau atunci când aceasta nu este conformă cu descrierea furnizată pe buletinul de solicitare, ori analiza solicitată nu este descrisă cu detalii suficiente, laboratorul se consultă cu clientul pentru informaţii adiţionale, înainte de a respinge proba. Rezultatul discuţiei se va înregistra în documentele laboratorului^4,15. Laboratorul trebuie să aibă un sistem pentru identificarea unică a probelor. Probele se codifică prin alocarea cronologică a numărului de ordine a comenzii din Registrul de laborator de Tuberculoză, care începe cu numărul 1 în fiecare an^5, sau se recurge la sistemul local de identificare unică a probelor. Se acordă un indice (A;B) fiecărui eşantion provenit de la un bolnav, care este înregistrat la un anumit număr. Numărul şi indicele este scris şi pe ambalajul probei prin inscripţionare cu marker care nu se poate şterge în timpul mânuirii şi transportului. Identificarea alocată iniţial este păstrată pe toată durata existenţei probei în laborator, inclusiv a culturilor pozitive rezultate şi antibiogramelor efectuate. Sistemul trebuie proiectat şi aplicat astfel încât să asigure că probele nu pot fi confundate fizic sau atunci când se face referire la acestea în înregistrări sau documente. Păstrarea probelor şi contraprobelor Din momentul recepţiei până la repartizarea pentru analiză, probele se păstrează pentru maxim 1 oră în condiţii care să nu afecteze rezultatele obţinute (frigider, masă), să nu se deterioreze probele, sau să nu se piardă. Dacă probele ajung târziu în laborator şi nu mai pot fi prelucrate în aceeaşi zi, ele trebuie să fie depozitate în frigiderul destinat păstrării lor, la temperatură cuprinsă între +4°C şi + 8°C, iar condiţiile de păstrare trebuie menţinute, monitorizate şi înregistrate. La mânuirea probelor trebuie avut în vedere că ambalajul şi etichetele ar putea fi contaminate şi se va evita orice diseminare în laborator a contaminării microbiene prin folosirea de suporturi/tăvi care pot fi dezinfectate, atât pentru depozitarea în frigider cât şi pe masa de lucru. Este recomandabil să fie păstrate contraprobe (produsul rămas în recipientul original după preluarea porţiunii de prelucrat) pentru cel puţin pentru 24 de ore, în frigider, separat de probele neprelucrate încă. Fiecare contraprobă este identificată cu numărul din registrul de laborator de TB. Aceasta poate fi folosită pentru repetarea aceleiaşi analize, în cadrul C1C, sau pentru efectuarea de teste adiţionale. 4. Prelucrarea probelor pentru microscopie şi cultură Examenul microscopic Examinarea microscopică are avantajul că este simplă, rapidă, economică şi contribuie la identificarea surselor de infecţie^6. Chiar dacă specificitatea este înaltă, sensibilitatea metodei este limitată, rezultatul pozitiv fiind obţinut doar atunci când produsul examinat conţine mai mult de 5000 bacili/ml de produs patologic. Între limite trebuie amintit faptul că identifică bacilii acido-alcoolor rezistenţi dar nu identifică specia de micobacterii, nu face distincţie între bacilii viabili şi cei neviabili, nici între cei sensibili şi cei cu rezistenţă^16. În anul 1938 Hagemann creşte sensibilitatea examinării microscopice cu 10% prin colorarea fluorescentă cu auramină (şi examinare la microscopul cu lumină ultravioletă-UV), cu păstrarea aceleiaşi specificităţi cu coloraţia ZN. Devine astfel posibilă citirea unui număr mai mare de frotiuri (peste 35/zi). Microscopia fluorescentă tradiţională (examinarea în lumină ultravioletă emisă de lămpi cu mercur) este scumpă, dar folosind microscoape cu LED-UV (light-emitting diodes) devine mai ieftină şi este la fel de sensibilă^17. Principiul metodei: Conţinutul bogat în acizi micolici din structura peretelui micobacterian face ca aceste bacterii să fixeze la cald compuşii de anilină (fuchsina), sau substanţe fluorescente - fără încălzire (auramina, auramina-rhodamina) colorantul rezistând la decolorarea cu alcool acidulat, de aici şi denumirea de bacili acido-alcoolo-rezistenţi (BAAR)^18. Pentru uşurarea examinării este necesară colorarea fondului preparatului (albastru de metilen în cazul coloraţiei ZN). În cazul coloraţiei fluorescente este necesară cuparea fluorescenţei preparatului (cu albastru de metilen sau permanganat de potasiu). După recepţie, probele recoltate de la pacienţi sunt înregistrate şi identificate prin numerotare unică şi predate executanţilor de analiză. Indiferent dacă laboratorul foloseşte metoda directă sau metoda cu centrifugare/concentrare, la pregătirea spaţiului de lucru se parcurg aceiaşi paşi: 1. executantul trebuie să poarte echipamentul de protecţie individuală (halat cu mâneci lungi, închis la spate, mănuşi, mască FFP2 cu supapă, capelină), 2. pregăteşte suprafaţa de lucru din CPM prin ştergere cu alcool 70% şi aşteaptă cel puţin 3 minute, după care poate şterge cu un şervet de hârtie, 3. aşează în toată aria de lucru din interiorul CPM hârtie îmbibată cu dezinfectant tuberculicid (fără acoperirea orificiilor pentru recircularea aerului), 4. pune în interiorul CPM strict materialele necesare, fără aglomerare inutilă, 5. marchează lamele cu numărul complet din registru şi aşează-le în ordine în interiorul CPM, 6. porneşte funcţionarea CPM şi aşteaptă stabilizarea fluxului de aer 3-5 min, 7. nu ţine mai multe tuburi deschise la un moment dat - pentru a evita contaminarea încrucişată între probe 8. ţine înclinate tuburile deschise, la cel puţin 15 cm de fanta frontală. 9. aşază la îndemână recipientul pentru colectarea deşeurilor infecţioase. Prepararea frotiurilor pentru examinarea directă^1 1. aşează în ordinea numerelor flacoanele cu produsele de prelucrat, 2. aşează în ordine lamele numerotate, 3. ia cu ansa bacteriologică de unică folosinţă sau cu pipeta de unică folosinţă porţiuni purulente din produs (spută), cca 100 μl şi etalează cât mai uniform pe centrul lamei pe o arie de 1 x 2 cm, maxim 1 x 2,5 cm. Întinde produsul uniform pe lamă, în strat subţire astfel încât atunci când este uscat să permită să se vadă prin el literele unui text, 4. pentru uscare şi fixare aşează lamele cu frotiuri pe plita cu termostatare (65-75°C) şi aşteaptă cel puţin 2 ore înainte de etapa următoare. Prepararea frotiurilor pentru examinarea după concentrare/centrifugare: Petroff [NaOH/HCl sau KH(2)PO(4)]^1,2,16 1. aşează în ordinea numerelor flacoanele cu produsele de prelucrat în interiorul CPM, 2. aşează în interiorul CPM stativul cu tuburi de centrifugă (tip Falcon, de 50 ml) marcate cu numerele care corespund probelor de prelucrat, 3. transferă cu pipetă Pasteur sterilă, de unică folosinţă, cu pară integrată o cantitate cât mai mare din produsul de prelucrat (ideal 10 ml, minim 2 ml) în tubul de centrifugă. Pentru fiecare probă foloseşte câte o pipetă. Este de dorit să nu fie atinsă cu pipeta gura tubului pentru centrifugă, 4. repartizează în fiecare tub o cantitate egală cu cea a produsului, din soluţia de NaOH 4% (ţinută cel puţin 30 minute la temperatura camerei înainte de folosire) fără să atingi cu dispenserul gura sau peretele interior al tubului. Concentraţia finală a NaOH este de 2% în această etapă, 5. închide bine tuburile şi agită manual energic sau cu vortex la 2500 rpm. 15-30 secunde, pentru lichefiere. Inversează de câteva ori tubul astfel încât soluţia să vină în contact şi cu produsul de pe pereţii tubului. Reaşează tuburile în stativ, 6. fixează ceasul să sune la 15 minute de la adăugarea soluţiei decontaminante la prima probă, 7. verifică după 10 minute dacă proba este complet lichefiată. Dacă este necesar, mai agită manual sau la vortex timp de 15-30 secunde. Trebuie ca timpul total de contact produs/decontaminant să nu depăşească 20 minute, 8. la expirarea timpului de decontaminare/lichefiere se neutralizează conţinutul tuburilor cu soluţie HCl 8% sau soluţie de Na(2)KP0(4), în prezenţa unui indicator de pH (albastru de bromtimol), 9. completează cu tampon fosfat sau apă distilată până la 50 ml (capacitatea tubului) aşează tuburile în centrifuga cu răcire setată la temperatura cuprinsă între 4-12° C, la FRC 3000xg şi durata de 20 minute, 10. la terminarea centrifugării scoate tuburile din centrifugă, decantează atent şi complet supernatantul (în recipient cu pâlnie, care conţine substanţă tuberculicidă) apoi adaugă 2,5 ml apă distilată sau tampon fosfat (pH 6,8) în care resuspenzi sedimentul prin agitare uşoară şi prin pipetare fără barbotare. Lucrează steril, cu pipetă nouă pentru fiecare probă. Foloseşte o parte din sediment pentru prepararea frotiului, iar restul pentru cultură, 11. însămânţează mai întâi 2 tuburi cu mediul LJ şi un tub cu mediul lichid, apoi, cu aceeaşi pipetă, efectuează frotiul, 12. ia cu pipeta una-două picături (cca 100 μl) şi dispersează lichidul pe partea centrală a lamei marcate cu numărul corespunzător al probei, pe o arie de 1x2 cm, maxim 1x2,5 cm. Suprafaţa pe care se usucă lamele trebuie să fie orizontală pentru a nu se prelinge lichidul, 13. pentru uscare completă şi fixare aşează lamele cu frotiuri pe plita cu termostatare (65-75°C) şi aşteaptă cel puţin 2 ore înainte de etapa următoare. Dacă laboratorul nu este dotat cu centrifugă conformă, se sare de la punctul 8 la 12. Prepararea frotiurilor pentru examinarea după concentrare/centrifugare: NALC-NaOH^1,16,19,20,22 1. aşează în ordinea numerelor flacoanele cu produsele de prelucrat în interiorul CPM, 2. aşează în interiorul CPM stativul cu tuburi de centrifugă marcate cu numerele care corespund probelor de prelucrat, 3. transferă cu pipetă Pasteur sterilă, de unică folosinţă, cu pară integrată o cantitate cât mai mare din produsul de prelucrat (ideal 10 ml, minim 2 ml) în tubul de centrifugă. Pentru fiecare probă foloseşte câte o pipetă. Este de dorit să nu fie atinsă cu pipeta gura tubului pentru centrifugă, 4. repartizează în fiecare tub o cantitate egală cu cea a produsului, din soluţia de NALC-NaOH proaspăt preparată, fără să atingi gura tubului sau peretele interior al lui. Concentraţia finală a NaOH este de 1% în această etapă. Închide bine tuburile şi agită manual, blând, prin inversarea tubului de 3-4 ori sau cu vortex la 60-maxim 80 rpm (deoarece aerarea puternică determină oxidarea şi pierderea calităţii lichefiante a NALC), timp de 15-30 secunde pentru lichefiere. Inversează de câteva ori tubul astfel încât soluţia să vină în contact şi cu produsul de pe pereţii tubului sau de pe capac. Reaşează tuburile în stativ, 5. fixează ceasul să sune la 15 minute de la adăugarea soluţiei decontaminante la prima probă, 6. verifică după 10 minute dacă proba este complet lichefiată. Dacă este necesar, mai adaugă 50 mg pudră NALC şi agită la vortex 15-30 secunde. Trebuie ca timpul total de contact produs/decontaminant să nu depăşească 20 minute, 7. la expirarea timpului de decontaminare/lichefiere, la conţinutul tuburilor se adaugă tampon fosfat steril (pH 6,8) până la marca de 50 ml (capacitatea tuburilor), 8. aşează tuburile în centrifuga cu răcire setată la temperatura cuprinsă între 4-12° C, la FRC 3000xg şi durata de 20 minute, 9. la terminarea centrifugării, scoate tuburile din centrifugă, decantează atent şi complet supernatantul (în recipient cu pâlnie, care conţine substanţă tuberculicidă) apoi adaugă 2,5 ml tampon fosfat (pH 6,8) în care resuspenzi sedimentul prin agitare uşoară şi prin pipetare fără barbotare. Lucrează steril, cu pipetă nouă pentru fiecare probă. O parte se foloseşte pentru prepararea frotiului, iar restul pentru cultură, însămânţează mai întâi 2 tuburi cu mediul LJ şi un tub cu mediul lichid (sau 3 tuburi LJ), apoi, cu aceeaşi pipetă efectuează frotiul, 10. ia cu pipeta una-două picături (cca 100 microlitri) şi dispersează lichidul pe partea centrală a lamei marcate cu numărul corespunzător al probei, pe o arie de 1x2 cm, maxim 1x2,5 cm. Suprafaţa pe care se usucă lamele trebuie să fie orizontală pentru a nu se prelinge lichidul, iar grosimea frotiului rezultat să fie uniformă, 11. pentru uscare completă şi fixare aşează lamele cu frotiuri pe plita cu termostatare (65-75°C) şi aşteaptă cel puţin 2 ore înainte de etapa următoare. ● Etapa de centrifugare este obligatorie dacă se foloseşte această metodă de decontaminare. ● Metoda este rezervată laboratoarelor care au în dotare centrifugă conformă. ● Este recomandată pentru folosire în cazul cultivării pe mediul lichid Middlebrook 7H9. ● Este necesară validarea metodei în laborator înainte de folosirea de rutină. Colorarea frotiurilor Coloraţia Ziehl Neelsen^18,19 1. pune lamele cu frotiurile fixate pe suportul de colorare fără să se atingă între ele. 2. acoperă complet frotiurile cu soluţie 0.3% de fuchsină fenicată proaspăt filtrată. 3. treci pe sub frotiuri flacăra unui bec de gaz până la emiterea de vapori, fără să fiarbă colorantul. Repetă acţiunea de 3-4 ori în primele 3 minute. Completează cu fuchsină dacă aceasta s-a uscat sau s-a scurs de pe lamă. Lasă până la 10 minute. 4. spală cu jet slab de apă de robinet şi scurge apa. 5. acoperă frotiul cu alcool-acidulat 3% şi lasă-l pentru decolorare maxim 3 min. Repetă decolorarea dacă frotiul rămâne roşu. 6. spală din nou cu jet slab de apă de robinet şi scurge apa. 7. acoperă frotiul cu albastru de metilen 0,3% timp de 30 sec., maximum 1 minut. 8. spală blând sub jet de apă de robinet şi scurge apa. 9. şterge colorantul de pe dosul lamei cu şervet îmbibat în alcool medicinal. 10. usucă frotiurile în poziţie înclinată în suport de lame la temperatura camerei. Nu încălzi lamele pentru grăbirea uscării. Examinează la microscop optic: ocular 10x, obiectiv cu imersie 100x (mărire 1000x). Coloraţia fluorescentă (Auramină O. sau Auramină-Rhodamină)^2,16 1. acoperă frotiul fixat cu soluţie 0,1% auramină O (sau Auramină-Rhodamină) 2. lasă 15 minute la temperatura camerei, fără încălzire 3. spală blând cu apă distilată, apoi scurge apa de pe lamă, 4. acoperă frotiul cu acid - alcool 3% şi lasă pentru decolorare 2 minute, 5. spală blând cu apă distilată, apoi scurge excesul de apă, 6. acoperă frotiul cu permanganat de potasiu 0,5% sau albastru de metilen 0,3% timp de 2 minute (pentru eliminarea fluorescenţei nespecifice a fondului). Prelungirea contactului cu permanganatul de potasiu peste 4 minute determină scăderea fluorescenţei BAAR! 7. spală cu apă distilată apoi scurge excesul de apă, 8. lasă la uscat în poziţie înclinată în suportul de lame, la aer. Nu forţa uscarea. Examinează la microscopul cu fluorescenţă (UV) imediat după uscare folosind oculare de 10x şi obiective de 20-25x şi 40-45x. Note: ● În toate etapele de spălare pentru coloraţia cu fluorocromi se foloseşte numai apa distilată. Nu se foloseşte apa de la robinet deoarece clorul conţinut de aceasta poate interfera cu fluorescenţă. ● Indiferent de metoda de preparare a frotiurilor, ele trebuie lăsate să se usuce la aer, ferite de raze UV, pe plita cu termostatare din interiorul CPM, de unde sunt scoase pentru colorare. ● Toate materialele folosite (pipete, anse, tuburi) se colectează în recipiente pentru materiale infecţioase şi se autoclavează înainte de îndepărtarea din laborator. ● Frotiurile pozitive BAAR în fluorescenţă se pot recolora ZN, pentru confirmarea rezultatelor. Nu este necesară decolorare prealabilă. ● Dacă nu pot fi examinate imediat, frotiurile colorate cu fluorocromi se pot păstra la întuneric, la 4-8° C pentru 24 ore. Fluorescenţa scade după 24 de ore. ● Odată colorate prin metoda ZN, frotiurile nu mai pot fi recolorate fluorescent. ● Se colorează zilnic frotiu de control pozitiv BAAR, iar la schimbarea lotului de colorant se colorează şi frotiuri de control negativ BAAR. Examinarea frotiurilor La microscopul optic ● numără BAAR (care apar ca bastonaşe roşii pe fondul albastru al preparatului), din 100 câmpuri microscopice examinate (2 cm lungime). ● grupurile compacte de mai mulţi bacili se numără ca UFC şi se consemnează ca atare în caietul de lucru. ● examinează obligatoriu cu ocular 10x şi obiectiv 100x, folosind ulei pentru imersie. ● dacă nu vizualizezi nici un BAAR la 100 câmpuri examinate, consideră rezultat negativ BAAR doar după ce ai examinat 300 câmpuri microscopice. ● rezultatele se exprimă semicantitativ. (tabelul III) La microscopul cu fluorescenţă (UV) ● numără BAAR (care apar ca bastonaşe galben fluorescent pe fondul întunecat al preparatului). ● numără grupurile compacte de mai mulţi bacili ca UFC. ● examinează cu ocular de 10x şi obiectiv de 20 - 25x pentru orientare şi cu obiectiv 40-45x pentru detalii. ● dacă nu vizualizezi nici un BAAR la 1000 câmpuri examinate (obiectiv 20-25x şi o lungime de 2 cm frotiu), consideră rezultat negativ BAAR. Rezultatele se exprimă semicantitativ. (tabelul III) Interpretarea şi raportarea rezultatelor Rezultatele se exprimă semicantitativ, conform tabelului III, iar raportarea se face pe buletinele de solicitare tip PNPSCT, conform recomandărilor. Se marchează obligatoriu metoda folosită.^2,4 Tabel III. Exprimarea semicantitativă a rezultatelor examenului microscopic şi raportarea rezultatelor
┌────────┬──────────────┬───────────────────┐
│ │ │Mărirea în │
│ │ │examinarea │
│ │ │fluorescentă │
│Scala │ ├─────────┬─────────┤
│IUATLD/ │Ziehl-Neelsen,│Mărire │Mărire │
│WHO │mărire 1000x: │200-250x:│400-x: 1 │
│ │1 lungime = 2 │1 lungime│lungime =│
│ │cm =100 CME^a │= 2 cm = │2 cm = │
│ │ │corespund│corespund│
│ │ │la 1000 │la 400 │
│ │ │CME^a │CME^a │
│ │ │din │din │
│ │ │mărirea │mărirea │
│ │ │de 1000 x│de 1000 x│
│ │ │ │ │
├────────┼──────────────┼─────────┼─────────┤
│Rezultat│ │ │ │
├────────┼──────────────┼─────────┼─────────┤
│NEGATIV │0 BAAR/1 │0 BAAR/1 │0 BAAR/1 │
│BAAR │lungime │lungime │lungime │
├────────┼──────────────┼─────────┼─────────┤
│Numărul │ │ │ │
│exact de│1-9 BAAR/1 │ │ │
│BAAR / │lungime │Împarte │Împarte │
│1 │ │numărul │numărul │
│lungime │ │BAAR │BAAR │
├────────┼──────────────┤observaţi│observaţi│
│POZITIV │10-99 BAAR/ 1 │la 10 │la 4 │
│BAAR 1+ │lungime │ │ │
├────────┼──────────────┤ │ │
│POZITIV │1-10 BAAR / │ │ │
│BAAR 2+ │câmp, în medie│ │ │
├────────┼──────────────┤ │ │
│POZITIV │> 10 BAAR / │ │ │
│BAAR 3+ │câmp, în medie│ │ │
└────────┴──────────────┴─────────┴─────────┘
a. CME: câmpuri microscopice examinate Rezultatul cu 1-3 BAAR se va interpreta cu prudenţă, fiind necesară repetarea examinării dintr-un alt eşantion de spută. La examinarea cu microscopul UV, la mărire de 200-250x, lungimea de 2 cm este acoperită de 30 câmpuri microscopice, care corespund la 1000 câmpuri examinate în microscopie optică; la mărire de 400x, lungimea de 2 cm este acoperită de 40 câmpuri microscopice, care corespund la 400 câmpuri examinate în microscopic optică.^2,16 Pentru a nu se crea confuzii la raportarea rezultatelor, în cazul folosirii coloraţiei fluorescente trebuie aplicat un factor de corecţie, astfel: se împarte numărul BAAR citiţi la 10 dacă citirea s-a făcut la mărirea 200-250x, sau se împarte la 4, dacă citirea s-a făcut la mărire de 400-450x.^16 Pentru frotiurile intens pozitive se citesc cel puţin 25 câmpuri microscopice înainte de formularea rezultatului (la mărire de 1000x). Toate rezultatele eliberate trebuie să aibă calitatea asigurată, dar uneori este posibil să se producă erori, începând de la momentul recoltării produselor de la bolnavi, până la eliberarea rezultatelor. Erorile posibile constituie elemente de risc pentru calitate şi trebuie cunoscute de către personalul de laborator pentru a le putea preveni^2,4,16,20 (tabelul IV). Tabel IV. Evaluarea riscului examenului microscopic pentru evidenţierea BAAR
┌────────────┬──────────────────┬──────────────┐
│Etapa │Sursa erorii │Prevenirea │
│ │ │erorii │
├────────────┼──────────────────┼──────────────┤
│ │ │Instruirea │
│ │ │personalului │
│ │ │care │
│ │ │recoltează sau│
│ │ │supraveghează │
│ │Produs patologic │recoltarea. │
│ │necorespunzător │Instruirea │
│Recoltarea │calitativ şi/sau │pacienţilor. │
│produsului │cantitativ. │NU eticheta │
│patologic, │Neglijenţă │capacul. │
│transportul │în etichetarea │Lipeşte │
│ │recipientului cu │eticheta cu │
│ │produsul │date │
│ │patologic. │de │
│ │Recipient │identificare │
│ │inadecvat. │pe corpul │
│ │ │flaconului │
│ │ │înainte │
│ │ │de recoltare. │
│ │ │Completează │
│ │ │toate │
│ │ │rubricile din │
│ │ │biletul de │
│ │ │solicitare │
│ │ │tip. │
├────────────┼──────────────────┼──────────────┤
│ │ │Eticheta cu │
│ │ │datele de │
│ │ │identificare │
│ │ │să fie │
│ │ │lipită pe │
│ │Etichetă lipită pe│corpul │
│ │capac. Date │flaconului. │
│Recepţie │incomplete în │Înregistrează │
│Înregistrare│biletul de │datele în │
│ │solicitare. │registrul │
│ │ │laboratorului,│
│ │ │şi alocă │
│ │ │fiecărui │
│ │ │prelevat un │
│ │ │număr unic, │
│ │ │scris │
│ │ │obligatoriu pe│
│ │ │corpul │
│ │ │flaconului. │
├────────────┼──────────────────┼──────────────┤
│ │Lamă refolosită, │Foloseşte lame│
│ │zgâriată, │noi, cu │
│Lama │nedegresată │calitate │
│ │sau cu │verificată. │
│ │fluorescenţă │Degresează │
│ │proprie. │lamele înainte│
│ │ │de folosire. │
├────────────┼──────────────────┼──────────────┤
│ │ │Marcare cu │
│ │Cu tuş solubil în │creion de │
│ │alcool - tip │grafit, pe │
│ │marker │faţa lamei, în│
│ │permanent, cu │porţiunea │
│Marcarea │ştergerea în │matisată de la│
│lamei │timpul │capătul ei. │
│ │colorării. Cu │Numărul │
│ │creion de ceară, │complet din │
│ │pe dosul │registru, cu │
│ │lamei, cu număr │indicele │
│ │incomplet sau │prelevatului │
│ │numărul │(A,B) │
│ │zilei. │Prin zgârierea│
│ │ │cu diamant a │
│ │ │numărului. │
├────────────┼──────────────────┼──────────────┤
│ │ │Selectează │
│ │ │fragmente │
│ │ │purulente din │
│ │Frotiu prea │spută. │
│Efectuarea │subţire, prea │Etalează pe o │
│frotiului │gros. │arie de 1x2 │
│ │Frotiu prea mic, │cm, maxim │
│ │prea mare. │1x3cm, în │
│ │Grosime neuniformă│porţiunea │
│ │ │centrală a │
│ │ │lamei. │
│ │ │Lucrează cu │
│ │ │calm şi │
│ │ │atenţie. │
├────────────┼──────────────────┼──────────────┤
│ │ │Aşteaptă │
│ │ │uscarea │
│ │ │completă a │
│ │Fixarea la flacără│frotiurilor │
│Fixarea │înainte ca frotiul│înainte │
│ │să fie complet │fixarea la │
│ │uscat. │flacără. │
│ │ │Uscarea şi │
│ │ │fixarea │
│ │ │folosind plită│
│ │ │termostatată, │
│ │ │la 65-75°C, │
│ │ │timp de 2 ore.│
├────────────┼──────────────────┼──────────────┤
│ │ │Aşează │
│ │ │distanţat │
│ │ │lamele pe │
│ │ │suportul de │
│ │ │colorare, │
│ │ │soluţia de │
│ │ │colorant să nu│
│ │ │se │
│ │ │prelingă de pe│
│ │Lame puse lipite │o lamă pe cele│
│ │unele de altele pe│învecinate. │
│ │suportul de │Filtrează │
│ │colorare. │soluţia de │
│ │Colorant │lucru înainte │
│Colorarea │nefiltrat. │de │
│ │Soluţie de lucru │folosire. │
│ │cu concentraţie │Schimbă zilnic│
│ │greşită. │hârtia │
│ │Capacitate │folosită la │
│ │colorantă slabă. │filtrare. │
│ │Soluţia de fucsină│Balanţă │
│ │fierbe sau se │etalonată, │
│ │usucă │verificată │
│ │pe lamă (ZN). │metrologic, │
│ │Încălzire │sticlărie │
│ │insuficientă a │etalonată. │
│ │soluţiei de │Respectă │
│ │fucsină (ZN). │reţetele de │
│ │Încălzirea │preparare a │
│ │soluţiei │soluţiilor. │
│ │fluorescente. │Foloseşte │
│ │ │soluţiile în │
│ │ │termenul de │
│ │ │valabilitate. │
│ │ │Foloseşte │
│ │ │reactivi cu │
│ │ │certificat de │
│ │ │calitate, │
│ │ │cu puritate │
│ │ │cunoscută. │
│ │ │Colorează cu │
│ │ │auramină fără │
│ │ │încălzire. │
├────────────┼──────────────────┼──────────────┤
│ │ │Scurge complet│
│ │ │apa rămasă pe │
│ │ │lamă după │
│ │ │fiecare │
│ │Decolorant în │spălare. │
│ │concentraţie │Verifică │
│Decolorare │necorespunzătoare.│calitatea │
│ │Decolorare │reactivilor │
│ │neuniformă sau │folosiţi. │
│ │insuficientă. │Respectă │
│ │ │reţeta de │
│ │ │preparare a │
│ │ │soluţiilor. │
│ │ │Acoperă │
│ │ │complet lama │
│ │ │cu soluţia de │
│ │ │decolorare. │
├────────────┼──────────────────┼──────────────┤
│ │ │Scurge complet│
│ │ │apa rămasă pe │
│ │ │lamă după │
│ │ │spălare. │
│ │ │Verifică │
│ │ │calitatea │
│ │ │reactivilor │
│ │ │folosiţi. │
│ │ │Respectă │
│ │ │reţeta de │
│ │ │preparare şi │
│ │ │timpii de │
│ │Concentraţie │colorare. │
│ │necorespunzătoare │Respectă │
│ │a │instrucţiunile│
│Recolorare/ │soluţiei. │de colorare │
│colorarea │Colorare prea │furnizate │
│fondului │intensă. │de producător │
│ │Colorare │împreună cu │
│ │insuficientă. │chitul de │
│ │Lame cu │colorare. │
│ │fluorescenţă │Verifică data │
│ │proprie. │preparării │
│ │ │soluţiei şi │
│ │ │foloseşte │
│ │ │în termenul de│
│ │ │valabilitate. │
│ │ │Foloseşte │
│ │ │reactivi cu │
│ │ │certificat de │
│ │ │calitate, │
│ │ │cu puritate │
│ │ │cunoscută. │
│ │ │Acoperă │
│ │ │complet lama │
│ │ │se cu soluţia │
│ │ │de │
│ │ │albastru de │
│ │ │metilen (sau │
│ │ │permanganat). │
│ │ │Verifică │
│ │ │fluorescenţa │
│ │ │lamelor │
│ │ │înainte de │
│ │ │folosirea unui│
│ │ │lot nou. │
├────────────┼──────────────────┼──────────────┤
│ │ │Spală cu jet │
│ │Spălare energică, │slab de apă, │
│Spălarea │cu jet de apă pe │lăsat să se │
│între │mijlocul lamei, cu│prelingă │
│etapele │dezlipirea de │de la un capăt│
│de colorare │fragmente de │spre celălalt │
│şi la │frotiu. │al lamei. │
│final │Folosirea apei de │Foloseşte apă │
│ │robinet în cazul │distilată │
│ │coloraţiei │pentru │
│ │fluorescente. │coloraţia │
│ │ │fluorescentă. │
│ │ │ │
├────────────┼──────────────────┼──────────────┤
│ │ │În suport │
│Uscarea │ │pentru lame, │
│finală │La termostat │în poziţie │
│ │ │înclinată, │
│ │ │la temperatura│
│ │ │camerei. │
├────────────┼──────────────────┼──────────────┤
│ │ │Curăţarea │
│ │ │obiectivului │
│ │ │după fiecare │
│ │ │examinare. │
│ │ │La aplicarea │
│ │ │picăturii de │
│ │ │ulei de │
│ │BAAR rămaşi pe │imersie nu │
│ │obiectiv de la o │se atinge │
│ │examinare │frotiul cu │
│Examinarea │anterioară. │aplicatorul │
│la │Uleiul de imersie │(ZN). │
│microscop │conţine BAAR (ZN).│Marcarea │
│ │Numărul de │corectă a │
│ │identificare şters│lamei. │
│ │în timpul │Pentru │
│ │colorării. │rezultat │
│ │Citirea unui număr│negativ se │
│ │mic de câmpuri │citesc cel │
│ │microscopice. │puţin │
│ │ │300 câmpuri │
│ │ │microscopice. │
│ │ │Personal │
│ │ │instruit şi │
│ │ │verificat │
│ │ │periodic. │
│ │ │Sistem pentru │
│ │ │CIC-M │
│ │ │implementat. │
├────────────┼──────────────────┼──────────────┤
│ │Transcrierea │Lucrează cu │
│ │greşită a │calm şi │
│Raportarea │rezultatului în │atenţie. │
│rezultatului│registru, în │Instruirea │
│ │buletinul de │personalului │
│ │analiză, în │referitoare la│
│ │baza de date. │consecinţele │
│ │ │erorilor. │
└────────────┴──────────────────┴──────────────┘
Cultivarea micobacteriilor Cultura are sensibilitate mai mare decât microscopia (10-100 bacili/ml produs patologic)^24, distinge bacilii viabili şi este necesară pentru monitorizarea tratamentului tuturor pacienţilor, dar în mod particular al celor cu multirezistenţă (TB-MDR), oferă diagnosticul definitiv de TB, creşte numărul cazurilor diagnosticate cu 30-50% (mediul LJ), permite detectarea cazurilor înainte ca ele să devină infecţioase, oferă izolate pentru ABG^2,25. Cultivarea micobacteriilor necesită condiţii de biosiguranţă de nivel 2^14,21. Pentru cultivare sunt folosite medii solide, pe bază de ou sau pe bază de agar, dar şi medii lichide, care pot aduce un plus de pozitivitate de până la 10% faţă de mediul solid. Dintre mediile solide pe bază de ou amintim mediul LJ, folosit în ţara noastră, iar dintre cele lichide, mediul Middlebrook 7H9, folosit în sisteme automate de cultivare Bactec MGIT 960, BacT/ALERT(MB/BacT) şi mai recent la noi, VersaTREK. Cultura în mediul lichid este complexă, costisitoare, necesită personal instruit, nu oferă informaţii asupra numărului de colonii precum mediul LJ, fiind calitativă, are o rată mai mare de contaminare decât cultura în mediul solid şi este mai scumpă decât aceasta.^25,26 Metode de decontaminare Sputa, produsul de elecţie pentru diagnosticul TB pulmonare, dar şi alte produse recoltate sunt contaminate cu microbi din microbiocenoza traseului de eliminare. Prezenţa acestora afectează calitatea mediilor folosite pentru cultură şi este necesară eliminarea lor înainte de însămânţare, prin prelucrare corespunzătoare. Când cultivăm micobacteriile trebuie să avem în vedere trei aspecte importante^25: ● Eliberarea bacililor din mucusul şi detritusurile celulare care îi înconjoară, ● Viabilitatea bacteriilor nu trebuie să fie afectată mai mult decât este necesar nici prin omogenizare, nici prin decontaminare sau centrifugare, ● La omogenizare şi decontaminare trebuie să avem în vedere: rezistenţa MT la soluţii de baze şi acizi; durata expunerii la aceste substanţe; temperatura din timpul centrifugării; eficienţa centrifugii pentru sedimentarea bacililor. Nici una dintre metodele de decontaminare folosite nu reuşeşte să conserve micobacteriile în totalitate, chiar în condiţiile unei tehnici de lucru impecabile, de aceea trebuie să stabilim un echilibru între pierderea unei părţi a bacililor şi rata acceptabilă de contaminare a culturilor. Alegerea tehnicii pentru decontaminare trebuie să ţină seama de dotarea tehnică a laboratorului şi de calificarea personalului. Vor fi folosite doar metode verificate şi validate. Metoda de decontaminare cu NaOH (Petroff)^3,4,20,22,25 Principiu NaOH în soluţie 4% (concentraţie finală 2%) are atât efect mucolitic cât şi bactericid asupra majorităţii microbilor. Înainte de însămânţare este necesară neutralizarea NaOH cu soluţie de HCl 8% sau fosfat monopotasic 15% în prezenţa unui indicator de pH. Avantaj: Metoda este accesibilă din punct de vedere tehnic, reactivii sunt ieftini şi stabili câteva luni. Dezavantaje: timpul de contact cu hidroxidul trebuie să fie strict respectat; este destul de agresivă, distrugând până la 60% din bacilii tuberculozei, la care se adaugă bacilii omorâţi în timpul centrifugării (efectul încălzirii şi eficienţa centrifugii). Timpul necesar prelucrării unei probe este de aproximativ 60 minute, iar prelucrarea a 20 de probe durează aproximativ 120 minute, capacitatea centrifugii fiind elementul limitativ.^25 Pregătirea spaţiului de lucru este aceeaşi indiferent de metoda folosită: 1. executantul trebuie să poarte echipamentul de protecţie individuală (halat cu mâneci lungi, închis la spate, mănuşi, mască FFP2 cu supapă, capelină), 2. pregăteşte suprafaţa de lucru din CPM prin ştergere cu alcool 70%, şi aşteaptă cel puţin 3 minute, după care se şterge cu un şervet de hârtie, 3. aşează pe toată aria de lucru din interiorul CPM hârtie îmbibată cu dezinfectant tuberculicid (fără acoperirea orificiilor pentru recircularea aerului), 4. pune în interiorul CPM strict materialele necesare, fără aglomerare inutilă, 5. porneşte funcţionarea CPM şi aşteaptă 3 - 5 min stabilizarea fluxului de aer, 6. nu ţine mai multe tuburi deschise la un moment dat pentru a evita contaminarea încrucişată între probe, 7. ţine înclinate tuburile deschise, la cel puţin 15 cm de fanta frontală. Prelucrarea probelor biologice pentru cultivarea după concentrare/centrifugare: metoda Petroff [NaOH/HCl sau KH(2)PO(4)]^1,2,20,25 este descrisă în capitolul "Examinarea microscopică" Metoda de decontaminare/omogenizare cu NALC-NaOH^2,20,22,25 Principiu N-acetil-L-cisteina (NALC) este un agent mucolitic utilizat pentru digestia rapidă, care permite ca agentul decontaminant, NaOH, să aibă o concentraţie finală de 1%. Tamponul fosfat neutralizează NaOH şi diluează omogenatul pentru a reduce vâscozitatea anterior centrifugării. Avantaj: sunt omorâte doar circa 30% din micobacteriile din proba clinică. Dezavantaje: NALC îşi pierde activitatea destul de repede, de aceea soluţia de lucru trebuie preparată zilnic. Ionii metalelor grele prezenţi în spută afectează efectul mucolitic al NALC şi pentru legarea lor este necesar adaosul de soluţie de citrat de sodiu. Agitarea prea energică, cu aerarea soluţiei NALC îi scade activitatea mucolitică. Pentru centrifugarea probei se foloseşte o FRC de 3000xg, timp de 20 minute pentru sedimentarea micobacteriilor, în centrifugă cu răcire, la 4-12°C. Timpul necesar procesării unei probe este de aproximativ 40 minute, iar procesarea a 20 de probe durează aproximativ 60 minute, elementul limitativ fiind capacitatea centrifugii. Metoda NALC-NaOH poate fi folosită doar dacă laboratorul este dotat cu centrifugă conformă, personalul a fost instruit, iar metoda a fost verificată şi validată în laborator, acest lucru trebuind să fie documentat. Etapa de centrifugare este obligatorie dacă se foloseşte această metodă de decontaminare. Este recomandată pentru folosire în cazul cultivării pe mediul Middlebrook 7H9. Prelucrarea probelor biologice după concentrare/centrifugare: metoda NALC-NaOH^1,2,20,25 este scrisă în capitolul "Examinarea microscopică". Însămânţarea Probe prelucrate/decontaminate cu NaOH 4% ● Însămânţează câte 4 picături (0,2 ml) în câte 2 tuburi cu mediul LJ şi 0,5 ml într-un tub cu mediul lichid, (sau 3 tuburi cu mediul LJ) apoi, cu aceeaşi pipetă efectuează frotiul, în cazul metodei cu centrifugare. ● Dacă nu s-a folosit centrifugarea, ci metoda "cu picătura", însămânţează din omogenatul rezultat câte 4 picături (0,2 ml) în câte 2 tuburi cu mediul LJ şi 0,5 ml într-un tub cu mediul lichid (sau 3 tuburi cu mediul LJ). Probe prelucrate/decontaminate cu NaOH/NALC ● Însămânţează 2 tuburi cu mediul LJ cu câte 4 picături (0,2 ml) şi 0,5 ml sau până la maxim 1 ml, într-un tub cu mediul lichid, în funcţie de recomandarea producătorului pentru fiecare tip de echipamentul folosit, (sau 3 tuburi cu mediu LJ). Incubarea Mediul LJ ● Inundă suprafaţa mediului cu lichidul însămânţat şi aşează tuburile înclinat, cu suprafaţa mediului în sus, într-un suport special pentru incubare în primele 48-72 ore, cu capacul parţial deşurubat (o spiră). ● După 48-72 ore examinează tuburile, elimină-le pe cele cu contaminare (scriind în caietul de lucru) şi incubează celelalte tuburi în poziţie verticală până la pozitivare sau până la maxim 60 de zile de la însămânţare. Se închid complet capacele. Mediul lichid Middlebrook 7H9 ● Incubarea se face în sistem automat şi se respectă instrucţiunile producătorului, prezentate în continuare. Citirea Mediul LJ ● manual, la 21, 30, 45, 60 zile. Dacă volumul de lucru permite, se poate face şi citire săptămânală. Mediul lichid ● automat, indiferent de sistemul de cultivare, cu raport pozitiv (la 1-42 zile) sau negativ (la 42 zile). Interpretarea rezultatelor ● Apreciază morfologia macroscopică a coloniilor (descrie în caietul de lucru pentru citirea culturilor), ● Prepară frotiu colorat ZN pentru a evidenţia prezenţa BAAR, ● Efectuează obligatoriu test imunocromatografic rapid AgMPT64 pentru confirmarea apartenenţei la complexul M. tuberculosis^2,26. Raportarea rezultatelor ● Rezultatele culturilor pe mediul LJ se exprimă semicantitativ (tabel V) iar cele ale culturilor în mediul lichid, calitativ: pozitiv/negativ. ● Raportarea se face pe buletinele de solicitare tip PNPSCT, conform recomandărilor. Trebuie menţionată/marcată metoda folosită. Tabel V. Exprimarea semicantitativă a rezultatelor culturii pe mediul solid tip Lowenstein Jensen
┌──────────────────┬───────────────────┐
│CREŞTEREA │NOTAREA │
│MICOBACTERIILOR^a │REZULTATULUI │
├──────────────────┼───────────────────┤
│Creştere │ │
│bacteriană absentă│NEGATIV │
│^b │ │
├──────────────────┼───────────────────┤
│Sub 30 colonii │POZITIV- număr │
│ │exact de colonii │
├──────────────────┼───────────────────┤
│30-100 colonii │POZITIV 1 + │
├──────────────────┼───────────────────┤
│Peste 100 colonii │POZITIV 2 + │
│izolate │ │
├──────────────────┼───────────────────┤
│Colonii confluente│POZITIV 3 + │
│nenumărabile │ │
├──────────────────┼───────────────────┤
│Creşterea altor │ │
│microbi decât │Cultură contaminată│
│micobacterii │ │
└──────────────────┴───────────────────┘
Legenda: a - Complexul M. tuberculosis identificat sau NTM (cu precizarea speciei după identificare); b - Mediul să nu fie deshidratat în exces, iar aspectul său să nu fie modificat. Pe buletin se scrie doar dacă cultura pozitivă aparţine complexului M. tuberculosis sau este NTM, fără a specifica testele folosite pentru identificare, care rămân doar în documentele laboratorului. Persoana care validează rezultatul şi semnează buletinul este răspunzătoare pentru corectitudinea rezultatului. Asemeni examenului microscopic, prin cultură trebuie să oferim rezultate cu calitate asigurată. În toate etapele de lucru sunt posibile erori care pot afecta calitatea rezultatelor finale, de aceea personalul trebuie să fie instruit, să cunoască greşelile posibile şi modalităţile de evitare a lor. (Tabelul VI) Tabel VI. Riscuri de eroare la cultivarea în mediul solid Lowenstein Jensen
┌─────────────┬──────────────────┬─────────────────┐
│Etapa │Greşeli posibile │Prevenirea │
│ │ │greşelii │
├─────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │Instruirea │
│ │Produs patologic │personalului care│
│ │necorespunzător │recoltează sau │
│ │calitativ şi/sau │supraveghează │
│Recoltarea │cantitativ │recoltarea. │
│produsului │Neglijenţă în │Instruirea │
│patologic, │etichetarea │pacienţilor. │
│transportul │recipientului │Nu eticheta │
│ │în care s-a │capacul, ci │
│ │recoltat produsul │corpul flaconului│
│ │patologic. │cu │
│ │Recipient │produs. │
│ │inadecvat │Completează toate│
│ │prelevatului. │rubricile din │
│ │ │biletul de │
│ │ │solicitare tip. │
├─────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │Eticheta cu │
│ │ │datele de │
│ │ │identificare să │
│ │ │fie │
│ │Etichetă lipită pe│lipită pe corpul │
│Recepţia │capac. │flaconului. │
│Înregistrarea│Date incomplete în│După scrierea │
│ │biletul de │datelor în │
│ │solicitare │registrul │
│ │ │laboratorului, │
│ │ │fiecărui prelevat│
│ │ │i se alocă un │
│ │ │număr, care va fi│
│ │ │scris pe corpul │
│ │ │flaconului │
│ │ │şi nu pe capac. │
├─────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │Foloseşte medii │
│ │ │verificate, cu │
│Mediul │Mediu neverificat │certificat de │
│Lowenstein │calitativ. │calitate şi │
│Jensen │Neefectuarea │conformitate. │
│ │CIC-C. │Efectuează CIC │
│ │ │pentru mediul de │
│ │ │cultură. │
│ │ │Participă la │
│ │ │programe de CEC. │
├─────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │Scrie cu tuş │
│ │Număr incomplet, │solubil în alcool│
│ │fără precizarea │- tip marker │
│Marcarea │indicelui │permanent numărul│
│tuburilor cu │produsului, │complet din │
│mediul de │ştergerea lui de │registru, cu │
│cultură │pe tub în timpul │indicele │
│ │mânuirii. │prelevatului │
│ │Scrisul maschează │(A,B). │
│ │zona de creştere a│Scrie numărul pe │
│ │coloniilor. │spatele tubului │
│ │ │sau în partea │
│ │ │de sus a lui. │
├─────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │Selectează │
│ │ │fragmentele │
│Transferul │Cantitate │purulente din │
│sputei/ │insuficientă │spută, │
│produsului în│ │cu evitarea │
│tubul pt │ │părţii salivare. │
│decontaminare│ │Prelucrează minim│
│ │ │2 ml de spută. │
│ │ │Lucrează cu calm │
│ │ │şi atenţie. │
├─────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │Respectă reţeta │
│ │ │de preparare şi │
│ │ │condiţiile de │
│ │ │lucru. │
│ │ │Verifică data │
│ │ │preparării │
│ │ │soluţiilor şi │
│ │Proporţie │foloseşte-le în │
│ │neadecvată între │termenul de │
│ │produs şi │valabilitate. │
│ │substanţa folosită│Foloseşte │
│Decontaminare│pt. decontaminare.│reactivi cu │
│ │Concentraţie │calitate şi │
│ │greşită a │puritate │
│ │decontaminantului.│verificate. │
│ │Decontaminant │Instruirea şi │
│ │nesteril. │supravegherea │
│ │Agitare │personalului. │
│ │insuficientă, sau │Etalonare │
│ │prea │echipamente. │
│ │energică. │Foloseşte │
│ │Folosirea de │materiale de │
│ │soluţii reci │unică folosinţă │
│ │(neechilibrate │sterile. │
│ │termic înainte de │Dacă se doreşte o│
│ │folosire) │decontaminare mai│
│ │ │agresivă │
│ │ │poţi creşte │
│ │ │cantitatea de │
│ │ │decontaminant de │
│ │ │până la de 2 ori │
│ │ │mai mult decât │
│ │ │sputa, dar nu │
│ │ │prelungi timpul │
│ │ │de contact peste │
│ │ │20 de │
│ │ │minute. │
│ │ │Lucrează cu calm │
│ │ │şi atenţie. │
├─────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │Instruirea şi │
│ │ │supravegherea │
│ │ │personalului. │
│ │ │Etalonare │
│ │ │balanţă, │
│ │ │greutăţi, │
│ │ │cilindri, pipete.│
│ │ │Foloseşte │
│ │ │materiale │
│ │ │consumabile │
│ │Concentraţie sau │sterile, de │
│ │cantitate │unică folosinţă. │
│Neutralizare │neadecvată a │Respectă reţetele│
│ │substanţei │de preparare. │
│ │neutralizante │Verifică data │
│ │ │preparării │
│ │ │soluţiilor şi │
│ │ │foloseşte-le în │
│ │ │termenul de │
│ │ │valabilitate. │
│ │ │Foloseşte │
│ │ │reactivi cu │
│ │ │certificat de │
│ │ │calitate, │
│ │ │cu puritate │
│ │ │cunoscută. Nu │
│ │ │amâna │
│ │ │neutralizarea │
│ │ │mai mult de 20 de│
│ │ │minute de la │
│ │ │contactul │
│ │ │decontaminantului│
│ │ │cu produsele de │
│ │ │prelucrat. │
│ │ │Lucrează cu calm │
│ │ │şi atenţie. │
├─────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │Foloseşte │
│ │Forţa relativă de │centrifugă cu │
│Centrifugare │centrifugare │răcire, cu forţa │
│ │neadecvată. │relativă de │
│ │Nerespectarea │centrifugare │
│ │timpului de │verificată │
│ │centrifugare. │(3000xg), │
│ │ │20 minute. │
├─────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │Însămânţează cu │
│ │Cantitate prea │pipete gradate. │
│Însămânţare │mică sau prea mare│Lucrează calm, cu│
│ │a │atenţie. │
│ │inoculului. │Foloseşte pipete │
│ │Contaminare. │sterile, medii │
│ │ │verificate. │
├─────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │Respectă │
│ │Închiderea │recomandările │
│ │necorespunzătoare │referitoare la │
│Incubare │a │gradul │
│ │flacoanelor. │de strângere a │
│ │Temperatură │dopurilor pentru │
│ │neadecvată, cu │fiecare │
│ │fluctuaţii. │metodă. │
│ │ │Etalonează │
│ │ │termometrele şi │
│ │ │monitorizează │
│ │ │temperaturile. │
├─────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │Necunoaşterea │Instruirea şi │
│Examinarea │morfologiei │reinstruirea │
│culturilor │micobacteriilor. │personalului. │
│ │Nerespectarea │ │
│ │planificării │ │
│ │examinării/ │ │
│ │citirii culturilor│ │
├─────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │Transcrierea │Concentrarea │
│ │greşită a │atenţiei │
│Raportarea │rezultatului în │executantului. │
│rezultatului │registru, în │Instruirea şi │
│ │buletinul de │reinstruirea │
│ │analiză, în │personalului. │
│ │baza de date. │Lucrează cu calm │
│ │ │şi atenţie. │
└─────────────┴──────────────────┴─────────────────┘
Sisteme automate de cultivare în mediul lichid Principiu: micobacteriile consumă în timpul creşterii oxigenul dizolvat în mediul de cultură. Sistemul MGIT 960 foloseşte tuburi cu mediu de cultură care au la bază un buton de silicon care conţine substanţă fluorescentă, mascată de oxigenul dizolvat în mediu. Pe măsura consumării oxigenului în timpul creşterii bacteriene, fluorescenţa poate fi măsurată, iar sistemul declanşează semnalul pozitiv. Sistemul VersaTREK monitorizează modificarea presiunii parţiale a gazelor din tubul de creştere [oxigen, azot, CO(2)]; consumul de oxigen determină scăderea presiunii din flacon. Figura 1 prezentă algoritmul de cultivare în mediul lichid^27. Avantaj: scurtarea timpului de obţinere a rezultatului pozitiv. Dezavantaj: rată de contaminare mai mare decât pentru cultivarea în mediul solid. Necesită personal bine instruit şi antrenat. Precauţii generale la folosirea sistemelor automate de cultivare ● Pentru sistemele automate de cultivare se va folosi exclusiv aplicaţia furnizată de producătorul echipamentului, ● Nu se fac modificări în aplicaţie fără acordul producătorului, ● Orice disfuncţionalitate se comunică reprezentantului naţional al producătorului, ● Se vor respecta întocmai instrucţiunile de lucru şi de întreţinere furnizate de producător, ● Este obligatorie respectarea precauţiilor universale referitoare la mânuirea probelor biologice, corespunzător clasei de risc 3, ● Nu se folosesc materiale consumabile sau reactivi cu termenul de expirare depăşit. Toate tuburile (culturile) semnalate pozitive se verifică microscopic după colorarea ZN a preparatului pentru vizualizarea BAAR, iar dacă sunt prezenţi BAAR se efectuează obligatoriu testul imunocromatografic pentru identificarea micobacteriilor din complexul M. tuberculosis. (a se vedea imaginea asociată) Figura 1. Algoritmul de lucru pentru cultivarea în mediul lichid "Rezervat" semnifică faptul că flaconul poate fi reintrodus în echipament, în poziţia iniţială. Instrucţiune de lucru pentru folosirea sistemului automat MGIT 960^1 Produsele biologice din care pot fi cultivate micobacteriile în sistemul BACTEC MGIT 960: probe respiratorii (spută, aspirat bronşic, lavaj bronşic), aspirat gastric, şi alte fluide ale corpului. Nu se însămânţează în MGIT 960: sputa hemoptoică, sânge, măduvă osoasă, urină, fecale, ţesut de biopsie. Prelucrarea probelor biologice se face ca şi pentru cultivarea în mediul solid, folosind metoda de decontaminare cu NaOH-NALC (sau Petroff, cu centrifugare). Pregătirea şi însămânţarea culturii 1. Reconstituie MGIT PANTA cu 15 ml supliment MGIT (aseptic). Amestecă până se dizolvă complet. Scrie data reconstituirii pe flacon. Este valabil 5 zile la 2-8°C. 2. Pune câte 0,8 ml din acest mediu de îmbogăţire în fiecare tub MGIT numerotat/etichetat cu cod de bare specific probei pentru cultură, înaintea inoculării probei. 3. Adaugă 0,5 ml din proba prelucrată (decontaminată). 4. Strânge capacul cât mai bine şi inversează-l de câteva ori pentru a omogeniza conţinutul, fără să facă spumă. 5. Decontaminează tuburile pe exterior cu alcool. Introducerea tuburilor în aparatul MGIT: 1. Deschide sertarul dorit (a se vedea imaginea asociată) 2. Apasă "tub entry" (tub cu săgeata spre tub) 3. Scanează codul de bare al tubului, apoi codul de bare al pacientului (a se vedea imaginea asociată) (semnal sonor la scanare) 4. Introdu tubul acolo unde indică led-ul verde. 5. Repetă punctele de mai sus pentru fiecare tub care trebuie introdus (a se vedea imaginea asociată) 6. Închide sertarul şi apasă "exit" (simbol uşă), când ai terminat. Culturile vor rămâne în echipament până când vor fi semnalate ca pozitive sau până la finalul protocolului pentru culturile negative (42 zile). Vezi algoritmul din Fig 1. Dacă un tub va fi semnalat ca pozitiv dar frotiul colorat ZN este negativ pentru BAAR sau contaminanţi, acesta se poate reintroduce în aparatul MGIT cu condiţia să nu fi trecut mai mult de 5 ore de la scoaterea acestuia din aparat (se scanează tubul atunci când e scos şi din nou când e reintrodus iar echipamentul va recunoaşte codul de bare şi va continua citirea de unde a rămas anterior scoaterii din aparat, cu condiţia să deschizi acelaşi sertar din care a fost scos). Dacă trec cele 5 ore se va reintroduce în aparat, dar echipamentul îl va înregistra ca probă nouă. Se poate incuba în continuare şi în incubatorul obişnuit pentru culturi, la 37° C, încă 24 ore, după care se repetă verificarea macroscopică şi microscopică. Scoaterea tuburilor negative (mai multe odată fără să se scaneze tub cu tub): 1. Deschide sertarul care are aprind ledul verde 2. Apasă "remove negative tubes" (a se vedea imaginea asociată) 3. Apasă "remove negative batch". Se dezactivează scanerul de cod de bare şi tuburile nu mai pot fi scanate individual. 4. Celulele cu tuburi negative au led verde corespondent. Scoate toate tuburile negative înainte de a închide sertarul. Dacă rămân tuburile în continuare în sertar, aparatul le va percepe ca nou introduse. 5. Când au fost scoase toate tuburile negative se aude "beep" de 3 ori, dispar led-urile verzi, scanner-ul se opreşte şi apare pictograma "ok". Apasă "ok" (a se vedea imaginea asociată) 6. Închide sertarul şi apasă "exit" Recomandată inspecţia vizuală a tuturor tuburilor negative scoase iar dacă se constată turbiditate sau prezenţa de grunji ori flacoane se prepară un frotiu colorat ZN. Scoaterea tuburilor negative (pe rând): 1. Deschide sertarul unde este aprins ledul verde. (a se vedea imaginea asociată) 2. Apasă "remove negative tubes" 3. Celulele cu tuburi negative au led verde şi se activează scanerul de cod de bare. 4. Imediat ce se scoate un tub, se scanează înainte de scoaterea următorului şi se stinge automat led-ul corespunzător. Scoaterea probele pozitive: 1. Apasă "silence" pentru a dezactiva alarma 2. Deschide sertarul cu ledul roşu (+) aprins 3. Apasă "remove positive tubes" (a se vedea imaginea asociată) 4. Toate tuburile pozitive vor fi indicate cu led verde (verde în dreptul celulei şi roşu pe uşă!) 5. Scoate tub cu tub şi scanează-l pe fiecare. 6. Se vor dezactiva automat led-urile verzi din sertare şi cel roşu de pe mânerul uşii. 7. Când au fost scoase toate probele pozitive, aparatul va emite un semnal sonor de 3 ori. Managementul probelor pozitive: 1. Inspectează vizual tuburile: ca orientare, cele cu creştere micobacteriană vor avea granule/grunji, iar cele cu contaminanţi vor fi tulburi lăptoase. 2. Agită tubul MGIT şi extrage 200 μl (cca 4 picături), 2 picături pentru însămânţare pe mediul de cultură şi 1-2 picături pentru frotiu. 3. Prepară câte un frotiu pentru fiecare cultură, astfel: pregăteşte o lamă pentru o cultură cu câte două spoturi şi pune albumina adezivă în strat subţire, apoi, peste ea, câte o picătură din cultură, lasă la uscat pe uscătorul de lame, la 65-75° C cel puţin două ore, apoi colorează ZN şi examinează microscopic pentru prezenţa BAAR. 4. Însămânţează câte un tub cu mediul LJ pentru fiecare cultură pozitivă. Opţional, inoculează o placă cu mediu cu sânge (Agar Columbia cu sânge) pentru confirmarea prezenţei contaminanţilor. 5. Reintrodu tubul MGIT în aparat în maxim 5 ore, dacă nu vizualizezi microbi în frotiu. 6. Incubează la 36,5 - 37°C tubul cu mediul LJ şi placa cu mediu geloză sânge şi urmăreşte creşterea bacteriană, în funcţie de caz (până la creştere, dar maxim 42 zile în cazurile BAAR pozitiv, sau 72 ore în cazul prezenţei altor microbi în frotiu). Citirea probelor MGIT Un tub pozitiv este semnalat automat prin algoritmi interni când UC (unităţile de creştere) au trecut de valoarea de 75. Această valoare este identificată ca probă pozitivă şi este confirmată prin teste suplimentare precum coloraţie ZN, identificare imunocromatografică şi verificări de contaminare. Dacă tubul este semnalat pozitiv în primele 2 zile de incubare înseamnă creştere foarte rapidă şi se suspectează o contaminare. Se poate produce semnal pozitiv precoce şi când pH-ul inoculului nu este cel corect. Un tub pozitiv pe MGIT conţine în mod obişnuit o biomasă de cca 10^5 până la 10^6 UFC/ml. Totuşi, un tub poate fi semnalat pozitiv pe MGIT şi atunci când numărul UFC este prea mic pentru a se putea obţine frotiu pozitiv BAAR în coloraţia ZN. Interpretarea rezultatelor pe MGIT: 1.
┌────────┬───────────────┬─────────────┐
│Rezultat│Rezultat mediul│TDD (timp de │
│ZN │de cultură │detecţie) │
│ │Agar sânge │MGIT │
├────────┼───────────────┼─────────────┤
│Negativ │Creştere │Mai mult de 7│
│BAAR │bacteriană │zile │
└────────┴───────────────┴─────────────┘
Interpretare: Tubul este contaminat. Cultura MGIT contaminată. Se comunică clinicianului cultura contaminată. 2.
┌────────┬───────────────┬─────────────┐
│Rezultat│Rezultat mediul│TDD (timp de │
│ZN │de cultură │detecţie) │
│ │Agar sânge │MGIT │
├────────┼───────────────┼─────────────┤
│Negativ │Creştere │Mai puţin de │
│BAAR │bacteriană │7 zile │
└────────┴───────────────┴─────────────┘
Interpretare/conduită: Reincubează tubul pentru încă 14 zile şi repetă coloraţia ZN şi însămânţarea pe agar sânge. Dacă ZN este pozitiv BAAR, urmează pct. 3, dacă ZN este negativ, este confirmată cultura contaminată. 3.
┌────────┬───────────────┬─────────────┐
│Rezultat│Rezultat mediul│TDD (timp de │
│ZN │de cultură │detecţie) │
│ │Agar sânge │ │
├────────┼───────────────┼─────────────┤
│Pozitiv │Creştere │Oricare │
│BAAR │bacteriană │ │
└────────┴───────────────┴─────────────┘
Interpretare/conduită: Prepară un frotiu colorat ZN şi însămânţează pe mediul LJ pentru a verifica dacă nu este o micobacterie cu creştere rapidă ca sursă de contaminare. Se face un test rapid de identificare Ag MPT64 din tubul MGIT pentru a confirma dacă aparţine complexului M. tuberculosis. ● Dacă ZN din mediul de cultură este pozitiv BAAR: a. iar testul imunocromatografic este negativ, reincubează tubul MGIT pentru încă 48 ore şi retestează pentru Ag MPT64. b. iar testul imunocromatografic este pozitiv, se raportează proba pozitivă pentru complexul M. tuberculosis şi contaminare. c. iar Ag MPT64 este negativ se identifică genetic specia de micobacterie (MTBC, CM). ● Dacă ZN din mediul de cultură lichid este negativ BAAR se ia în considerare rezultatul testului Ag MPT64: a. Dacă testul rapid este pozitiv, cultura este pozitivă pentru M tuberculosis şi contaminare. Interpretare cu extremă prudenţă!. Preferabilă aşteptarea creşterii subculturii pe LJ, cu repetarea identificării. b. Dacă testul rapid este negativ, se reincubează şi se retestează ca mai sus (a). 4.
┌────────┬───────────────┬─────────────┐
│Rezultat│Rezultat mediul│TDD (timp de │
│ZN │de cultură │detecţie) │
│ │Agar sânge │ │
├────────┼───────────────┼─────────────┤
│Pozitiv │Fără creştere │Oricare │
│BAAR │ │ │
└────────┴───────────────┴─────────────┘
Interpretare/conduită: Testează pentru Ag MPT64 pentru confirmarea MT. a. Dacă este confirmat complex M. tuberculosis, raportează rezultatul ca atare. b. Dacă testul este negativ sau invalid, reincubează proba pentru încă 48 ore şi retestează pentru Ag MPT64. ● Dacă acum testul rapid este pozitiv se raportează complex M. tuberculosis Dacă este în continuare negativ, se continuă pentru identificare genetică a speciei. 5.
┌────────┬───────────────┬─────────────┐
│Rezultat│Rezultat mediul│TDD (timp de │
│ZN │de cultură │detecţie) │
│ │Agar sânge │ │
├────────┼───────────────┼─────────────┤
│Negativ │Fără creştere │Oricare │
│BAAR │ │ │
└────────┴───────────────┴─────────────┘
Interpretare/conduită: Deşi rară, această situaţie poate să apară şi necesită investigaţii suplimentare. Reincubează tubul pentru încă minim 3 zile sau până când este semnalat din nou pozitiv. Repetă ZN şi cultura pe mediul agar sânge. a. Dacă ZN este pozitiv şi cultura pe mediul agar sânge negativ, procedează ca la pct. 4. b. Dacă ZN este pozitiv şi cultura pe mediul agar sânge denotă contaminare, procedează ca la pct.3. c. Dacă ZN este negativ şi cultura pe mediul agar sânge denotă contaminare, procedează ca la pct.2. d. Dacă ZN este negativ şi cultura pe mediul agar sânge este fără creştere, reincubează tubul MGIT până la finalul protocolului de 42 zile. Dacă este semnalat din nou pozitiv, repetă ZN şi cultura pe mediul agar sânge. Decontaminarea tuburilor MGIT contaminate: Se aplică în următoarele situaţii ● Probă pozitivă pentru complex M.tuberculosis şi contaminare. ● Probă unică care nu se poate repeta (aspirat bronşic, gastric, LCR etc.) a. Vortexează tubul MGIT contaminat b. Transferă aseptic întregul volum de mediu într-un tub de centrifugă de 50 ml c. Adaugă o cantitate egală de MycoPrep sau NAOH 4% (vezi decontaminarea). d. Amestecă bine şi lasă în repaus 15-20 min (periodic se inversează tubul) e. Adaugă tampon fosfat pH 6.8 până la marcajul de 50 ml şi omogenizează bine; sau neutralizează cu HCl 8%, apoi adaugă SFS până la 50 ml. f. Centrifughează (centrifuga cu răcire) la 3000xg pentru 20 minute g. Îndepărtează supernatantul. h. Resuspendă sedimentul în 0.5 ml tampon fosfat sau SFS şi agită bine. i. Inoculează 0.5 ml într-un tub nou MGIT care deja conţine suplimentul nutritiv şi PANTA. Instrucţiune de lucru pentru folosirea sistemului VersaTREK Produsele biologice din care pot fi cultivate micobacteriile în sistemul VersaTREK: probe respiratorii (spută, aspirat bronşic, lavaj bronşic), aspirat gastric, sânge, măduvă osoasă şi alte fluide ale corpului, urină, fecale, ţesut de biopsie. Prelucrarea probelor biologice, altele decât sângele sau măduva osoasă, se face ca şi pentru cultivarea în mediul solid, folosind metoda de decontaminare cu NaOH-NALC sau Petroff. Probele de sânge şi măduvă osoasă trebuie să fie prelucrate prin una din următoarele metode înainte de inocularea flacoanelor VersaTREK Myco (VTM): a. Tuburi izolatoare: Urmează instrucţiunile producătorului tuburilor izolatoare pentru liză şi concentrare. Inoculează 1 ml de sediment în flaconul (VTM). b. Liza celulelor sanguine integrale cu ADS: ● Recoltează 5-10 ml de sânge integral într-o eprubetă Vacutainer care conţine polianetol-sulfonat de sodiu (SPS) sau heparină (eşantion minim de cel puţin 5 ml). ● Răstoarnă tubul de mai multe ori, fără agitare. ● Transferă steril tot conţinutul într-o eprubetă conică de 50 ml (tub Falcon) pentru centrifugă. ● Adaugă ADS până la marcajul de 40 ml de pe eprubetă. Se vor liza celulele. ● Centrifughează la 3000 x g timp de 20 de minute, temperatură 4-12 °C. ● Decantează supranatantul. ● Adăugă 1-2 ml de tampon fosfat la sediment şi resuspendă-l. ● Însămânţează 1 ml din proba rezultată în flaconului VTM pregătit. Însămânţarea flacoanelor de cultură VersaTREK Myco^27 1. Dezinfectează dopul flaconului VTM AS (sau îndepărtează-l cu atenţie). 2. Reconstituie aseptic VTM AS injectând 25 ml de ADS prin septul dezinfectat folosind ac şi seringă (sau pipetează aseptic ADS). Va fi suficient reactiv pentru 50 de flacoane. 3. Scrie data reconstituirii pe flacon. Poate fi folosit 5 zile cu păstrare la frigider, sau 3 luni prin congelare la -20° C (scrie data reconstituirii şi a expirării, pentru că termenul de păstrare trebuie să se încadreze în termenul de valabilitate menţionat pe flaconul original). Dacă nu foloseşti în 5 zile, repartizează pentru 5-10 culturi în tuburi pentru că odată decongelat nu se recongelează. 4. Etichetează flaconul de cultură VTM cu informaţiile pacientului. 5. Dezinfectează dopul flaconului VTM cu alcool. Aşteaptă să se evapore. 6. Adăugă aseptic 1 ml de VTM GS (supliment de creştere) injectând prin dop cu o seringă cu ac, sau deşurubează dopul şi pipetează aseptic, apoi strânge dopul. 7. Adăugă aseptic 0.5 ml de soluţie VTM AS (supliment antibiotic) prin injectare prin membrana cauciucată cu o seringă cu ac, sau deşurubează dopul şi pipetează aseptic, apoi strânge dopul. 8. Însămânţează cel mult 1 ml de probă clinică decontaminată, concentrată, cu o seringă cu ac, sau cu pipetă. Strânge bine dopul şi amestecă prin inversarea flaconului de 5-6 ori, fără agitare. Însămânţează suplimentar 0.1 ml de probă pe o placă de agar - sânge pentru aprecierea decontaminării în cadrul CIC, pentru probe selectate randomizat. ● Supraumplerea semnificativă a flaconului poate cauza rezultate fals pozitive, iar în cazul probelor de sânge prelucrate cu tuburi izolatoare este posibilă inhibarea creşterii micobacteriilor. ● Alternativ etapele 2 şi 6-8 pentru pot fi efectuate prin deschiderea flacoanelor şi adăugarea de reactivi şi probe cu ajutorul pipetelor sterile. Trebuie avut grijă să se menţină tehnologia aseptică. Membrana cauciucată şi capacul trebuie să fie înşurubate bine pentru a garanta închiderea etanşă. Dacă membrana cauciucată şi capacul nu sunt aşezate corespunzător, se va produce eroare de scurgere a flaconului. 9. Dezinfectează flaconul de cultură şi gâtul lui cu dezinfectant micobactericid (alcool). 10. Îndepărtează sigiliul din partea de jos a unui conector VT. Aşează capătul conectorului cu ac pe gâtul flaconului de cultură şi apasă-l în jos pe verticală pentru a puncţiona membrana cauciucată a flaconului de cultură. Nu mai este permisă răsturnarea flaconului de cultură după montarea conectorului VT pe el. Lichidul din ac poate interfera cu citirile de presiune pentru flacon. 11. Înregistrează informaţiile despre pacient în calculatorul VersaTREK/ESP Culture System II. 12. Scanează codul de bare al flaconului şi aşează-l cu conectorul VT într-o poziţie liberă din instrument, pentru incubare, prin apăsare. Roteşte conectorul după poziţionare corectă. 13. Când instrumentul indică cu led roşu constant că o anumită locaţie de flacon conţine cultură pozitivă, îndepărtează flaconul şi urmează algoritmul de identificare (fig 1). 14. Lucrează în CPM. Scoate conectorul VT din flacon şi îndepărtaţi-l în recipientul pentru deşeuri infecţioase tăietoare-înţepătoare. Dezinfectează dopul de cauciuc cu alcool. 15. Agită flaconul temeinic cu vortexul sau manual pentru a disloca organismele din materia spongioasă conţinută în flacon. 16. Urmează algoritmul de identificare: frotiu ZN, test imunocromatografic, subcultură LJ: ● Dacă sunt prezenţi BAAR pe frotiu, continuă identificarea cu testul imunocromatografic AgMPT64. ● Pe frotiu nu se vizualizează microbi, ataşează un nou conector VT, reintrodu flaconul în instrument, în aceeaşi poziţie şi continuă incubarea. ● Pe frotiu sunt organisme non-acido-rezistente, conţinutul flaconului poate fi decontaminat (vezi la MGIT) şi inoculat într-un nou flacon VTM, sau poate fi considerat deşeu infecţios şi se prelucrează un alt produs. Rezultatul va fi cultură contaminată. 17. La finalul perioadei de incubare (42 de zile), un flacon care nu a prezentat răspuns pozitiv de creştere bacteriană trebuie să fie inspectat vizual pentru a vedea dacă este tulbure sau are grunji. Dacă lichidul este tulbure sau cu grunji ori flocoane prepară un frotiu şi colorează ZN, însămânţează pe agar-sânge şi LJ. Dacă mediul este limpede, flaconul poate fi debarasat/ autoclavat. Rezultat: cultură negativă. REZULTATE Semnal pozitiv: ● Cu identificare de microbi din complexul M. tuberculosis: Există aproximativ 10^6 unităţi formatoare de colonii (UFC)/ml de micobacterii la momentul de detecţie. ● BAAR prezenţi, dar nu este identificat complexul M. tuberculosis. Subcultură şi identificare genetică a NTM în LNR. Rezultat: M. spp. cultură în curs de identificare la LNR. ● Cultură contaminată: sunt prezenţi microbi de contaminare. Semnal negativ: la sfârşitul perioadei de incubare. Adăugarea informaţiilor pacientului DUPĂ scanarea flaconului (a se vedea imaginea asociată) 1. La computer, selectează pictograma de căutare (lupa) 2. FILTER (Filtrare) 3. PENDING (Aşteaptă) 4. ALL IN THE INSTRUMENT (Introdu toate flacoanele în instrument) 5. SPLIT (Împărţire ecran - se poate să fie deja împărţit) 6. Fă click pe bara colorată albastru din partea de sus a ecranului, de căutare, pentru a deschide un tabel, dacă acesta nu este deja deschis. 7. Introdu codul de acces în câmpul Accession Ici din tabel (numărul din registru). 8. Fă click pe primul raport din partea stângă a ecranului. 9. Introdu numele şi CNP pacient, împreună cu alte detalii. Pentru înregistrări multiple: dă click pe următorul (next), jos, în partea stângă a ecranului, pentru a salva informaţiile înregistrate anterior. Pentru o singură înregistrare: selectează şi dă click pe butonul REFRESH (reîncărcare pagină). Introducerea informaţiilor pacientului ÎNAINTE de scanarea unui flacon (a se vedea imaginea asociată) 1. La computer, selectează pictograma pentru introducere probă 2. NEW (Nou) 3. Introdu codul ID de acces (numărul din registru) 4. Selectează tipul testului (Myco) 5. Mergi la câmpul ID pacient 6. Scrie CNP-ul pacientului 7. Scrie numele pacientului 8. Scrie alte detalii necesare (produs, cine solicită, unitate sanitară) 9. Selectează NEW (Nou) din nou, pentru adăugarea datelor pentru următorul pacient şi repetă paşii de mai sus. SAU Dacă ai terminat de introdus informaţiile, închide fereastra pentru a salva modificările făcute. ERORI POSIBILE ŞI SOLUŢII PENTRU CORECTARE Ca pentru orice metodă folosită, în timpul funcţionării echipamentului VersaTREK pot să apară probleme care ar putea conduce la rezultate cu calitate slabă. Verifică şi remediază problemele imediat ce survin. Sursele problemelor pot fi asociate cu componente hardware, temperatură, sertare sau flacoane. Semnalele de atenţionare pot fi acustice sau vizuale. Erorile constituie surse de risc pentru calitate şi trebuie să fie cunoscute de personalul care lucrează cu echipamentul VersaTREK pentru a le preveni, sau dacă ele au apărut, pentru a le recunoaşte şi corecta imediat. Sunt prezentate în continuare succint, problemele care pot să apară, cauzele şi modul de rezolvare a lor. a. Probleme întâlnite la flacoanele VersaTREK
┌───────────┬─────────────┬──────────────┐
│Problemă │Cauză │Soluţie │
│ │posibilă │ │
├───────────┼─────────────┼──────────────┤
│ │ │Rezultatul │
│ │ │poate fi │
│ │ │fals-pozitiv. │
│ │ │Confirmă │
│În flacon │Flaconul nu a│rezultatul │
│este prea │fost umplut │pozitiv prin │
│mult │corespunzător│examinarea │
│sânge (sau │de către │frotiului ZN │
│fluid │utilizator │şi a │
│corporal) │ │subculturii. │
│ │ │Respectă │
│ │ │protocolul de │
│ │ │lucru şi │
│ │ │introdu în │
│ │ │flacon │
│ │ │cantităţile │
│ │ │corecte pentru│
│ │ │fiecare │
│ │ │componentă │
│ │ │necesară. │
├───────────┼─────────────┼──────────────┤
│ │ │Apasă butonul │
│Flaconul │ │întrerupător; │
│figurează │Defecţiuni de│urmăreşte pe │
│activ │ordin │ecran dacă │
│în sistem, │hardware sau │flaconul │
│după │la │dispare. Dacă │
│înlăturarea│întrerupător │nu obţii nici │
│lui din │ │un │
│echipament │ │rezultat, │
│ │ │contactează │
│ │ │reprezentantul│
│ │ │tehnic. │
├───────────┼─────────────┼──────────────┤
│ │ │Printează │
│Apar erori │Conectare │graficul │
│repetate │incorectă la │pentru locaşul│
│pentru │senzor, de la│respectiv; │
│acelaşi │întrerupător │anunţă │
│locaş │sau conexiune│reprezentantul│
│ │internă. │tehnic. │
│ │ │Dezactivează │
│ │ │locaşul. │
├───────────┼─────────────┼──────────────┤
│ │Flaconul VTM │Pune garnitura│
│ │nu are │de etanşare în│
│ │garnitură de │locaşul │
│ │etanşare. │respectiv. │
│Locaţia ├─────────────┼──────────────┤
│flacoanelor│Arcul este │Apasă │
│nu │blocat sau nu│adaptorul şi │
│coincide cu│se află la │arcul pentru a│
│locaţia │nivelul │le aduce la │
│testului. │adaptorului. │acelaşi nivel.│
│ ├─────────────┼──────────────┤
│ │ │Foloseşti │
│ │ │flacoane VT. │
│ │Este utilizat│Anunţă │
│ │alt tip de │medicul; │
│ │flacon decât │însămânţează │
│ │cel │altă probă în │
│ │autorizat. │flacon nou VTM│
│ │ │şi incubează │
│ │ │separat │
│ │ │flaconul │
│ │ │neacceptat sau│
│ │ │incompatibil │
└───────────┴─────────────┴──────────────┘
b. Probleme la citirea codurilor de bare
┌─────────────────┬────────────────────┐
│Factori ce pot │Soluţii │
│afecta scanarea │ │
├─────────────────┼────────────────────┤
│ │Dacă găseşti un │
│ │flacon al cărui cod │
│ │de bare a │
│Etichetă aplicată│fost acoperit sau │
│peste codul de │distrus, foloseşte │
│bare │un alt │
│al flaconului. │flacon de acelaşi │
│ │tip, din acelaşi │
│ │lot, pentru │
│ │scanare. Foloseşte │
│ │eticheta unică a │
│ │flaconului │
│ │original pentru │
│ │codul de acces. │
├─────────────────┼────────────────────┤
│ │Ţine flacoanele cu │
│ │etichete mici │
│ │aproape de │
│Flaconul poate fi│lentila de citire, │
│prea aproape sau │iar cele cu etichete│
│prea │mai mari │
│departe de │la 1-2 cm de │
│lentila de │lentilă. │
│citire. │ │
│ │Verifică dungile │
│ │negre care formează │
│Calitatea codului│codul de │
│de bare de pe │bare să nu aibă │
│etichetă poate fi│întreruperi sau │
│slabă. │imperfecţiuni. │
│ │Verifică imprimanta │
│ │pentru coduri de │
│ │bare dacă │
│ │printează │
│ │corespunzător. │
├─────────────────┼────────────────────┤
│Eticheta cu codul│Laserul de citire │
│de bare trece │funcţionează cel mai│
│prea │bine dacă │
│rapid prin faţa │eticheta este ţinută│
│lentilei laser. │staţionar în faţa │
│ │acestuia. │
├─────────────────┼────────────────────┤
│ │Praful şi murdăria │
│ │de pe mănuşile din │
│ │latex pot │
│ │obtura parţial │
│ │lentila de citire. │
│Lentila de citire│Curăţată │
│poate fi murdară.│lentila folosind │
│ │numai produse de │
│ │curăţare │
│ │corespunzătoare │
│ │(lavetă din │
│ │silicon). Nu se │
│ │folosesc şervetele │
│ │de hârtie sau │
│ │şerveţele umede │
│ │pentru curăţarea │
│ │lentilei. │
├─────────────────┼────────────────────┤
│ │Laserul citeşte pe │
│ │linie verticală, de │
│Laserul nu poate │sus în │
│citi codul de │jos. Ţine flaconul │
│bare │în aşa fel încât │
│întreg. │eticheta să │
│ │poată fi încadrată │
│ │pe toată suprafaţa │
│ │ei de raza │
│ │laserului. │
└─────────────────┴────────────────────┘
c. Probleme de alimentare cu energie.
┌────────────────┬─────────────────────┐
│Cauze posibile │Acţiuni corective │
├────────────────┼─────────────────────┤
│Cablul de │Conectează la o priză│
│alimentare nu │cu împământare. │
│este conectat. │ │
├────────────────┼─────────────────────┤
│ │Îndepărtează panoul │
│ │de protecţie; │
│Siguranţa │resetează │
│circuitului │siguranţa. Clapeta │
│principal este │siguranţei are │
│ridicată │inscripţia │
│(deconectată). │On/Off pe partea │
│ │dreaptă. Dacă │
│ │siguranţa sare din │
│ │nou, apelează la │
│ │reprezentantul tehnic│
│ │TREK. │
├────────────────┼─────────────────────┤
│Siguranţa │ │
│circuitului de │Contactează │
│alimentare │personalul de la │
│electrică a │serviciul tehnic al │
│clădirii este │spitalului. │
│ridicată. │ │
└────────────────┴─────────────────────┘
d. Probleme la tastatură (tastatura nu funcţionează).
┌────────────────┬─────────────────────┐
│Cauze posibile │Acţiuni corective │
├────────────────┼─────────────────────┤
│Cablul de reţea │Opreşte alimentarea, │
│nu este conectat│reconectează cablul, │
│la │reia │
│computer. │alimentarea. │
├────────────────┼─────────────────────┤
│Computerul este │Apelează la │
│defect. │reprezentantul tehnic│
├────────────────┤TREK. │
│Tastatura este │ │
│defectă. │ │
├────────────────┼─────────────────────┤
│În tastatură │Întoarce tastatura şi│
│sunt blocate │bate uşor pe spatele │
│obiecte │acesteia sau aspiră │
│străine (agrafe │uşor pentru a │
│de hârtie, etc.)│înlătura │
│ │obiectele străine. │
└────────────────┴─────────────────────┘
e. Monitorul/ecranul tactil nu funcţionează
┌─────────────────┬────────────────────┐
│Cauze posibile │Acţiuni corective │
├─────────────────┼────────────────────┤
│Pană de curent │Apasă întrerupătorul│
│electric. │pe poziţia ON. │
├─────────────────┼────────────────────┤
│Cablul nu este │ │
│conectat la sursa│ │
│de │Reconectează cablul.│
│alimentare. │ │
├─────────────────┼────────────────────┤
│Contrastul/ │ │
│luminozitatea au │Ajustează opţiunile │
│un nivel │de contrast/ │
│scăzut. │strălucire. │
├─────────────────┼────────────────────┤
│Cablul nu este │Reconectează cablul.│
│conectat la PC │ │
├─────────────────┼────────────────────┤
│Imaginea nu este │Calibrează imaginea.│
│calibrată. │ │
├─────────────────┼────────────────────┤
│Monitorul este │Apelează la │
│defect. │reprezentantul │
│ │tehnic TREK │
└─────────────────┴────────────────────┘
f. Mouse-ul nu funcţionează.
┌────────────────┬─────────────────────┐
│Cauze posibile │Acţiuni corective │
├────────────────┼─────────────────────┤
│Cursorul se află│Mişcă mouse-ul pentru│
│în afara │a readuce cursorul în│
│imaginii. │câmpul vizual. │
│ │ │
├────────────────┼─────────────────────┤
│Cablul │Opreşte PC-ul, │
│mouse-ului nu │reconectează cablul, │
│este conectat la│reporneşte │
│computer. │computerul. │
├────────────────┼─────────────────────┤
│Mouse-ul nu este│Utilizează │
│compatibil cu PC│dispozitivul │
│ │recomandat de TREK. │
├────────────────┼─────────────────────┤
│Mouse-ul este │Apelează la │
│defect. │reprezentantul tehnic│
│ │TREK. │
└────────────────┴─────────────────────┘
g. Imprimanta nu funcţionează
┌──────────────────┬───────────────────┐
│Cauze posibile │Acţiuni corective │
├──────────────────┼───────────────────┤
│Imprimanta nu este│Porneşte │
│pornită. │imprimanta. │
├──────────────────┼───────────────────┤
│Cablul nu este │Reconectează │
│conectat la │cablul. │
│imprimantă. │ │
├──────────────────┼───────────────────┤
│Cablul nu este │Reconectează cablul│
│conectat la PC │la PC. │
├──────────────────┼───────────────────┤
│Imprimanta nu are │Realimentează cu │
│hârtie. │hârtie. │
├──────────────────┼───────────────────┤
│Imprimanta este │Apelează la │
│defectă. │reprezentantul │
├──────────────────┤tehnic TREK │
│Imprimanta nu este│ │
│configurată ca │ │
│imprimantă │ │
│principală. │ │
└──────────────────┴───────────────────┘
h. Probleme legate de temperatura VersaTREK
┌───────────────┬──────────────┬──────────────┐
│Problemă │Cauză posibilă│Soluţie │
├───────────────┼──────────────┼──────────────┤
│ │ │Verifică │
│ │Temperatura în│termostatul │
│ │laborator este│încăperii. │
│ │prea mare │Resetează-l │
│ │ │dacă trebuie. │
│ ├──────────────┼──────────────┤
│Este declanşată│Punctul de │ │
│alarma │încălzire este│ │
│pentru │ales greşit │Apelează la │
│temperatură │sau calibrarea│reprezentantul│
│ │este │tehnic │
│ │incorectă. │TREK │
│ ├──────────────┤ │
│ │Temperatura │ │
│ │sistemului │ │
│ │este prea │ │
│ │mare. │ │
│ ├──────────────┼──────────────┤
│ │ │Apasă butonul │
│ │Defecţiuni ale│reset al │
│ │sistemului de │alarmei. │
│ │alarmă. │Dacă sună iar,│
│ │ │apelează la │
│ │ │reprezentantul│
│ │ │tehnic TREK │
│ ├──────────────┼──────────────┤
│ │Ventilatoarele│Apelează la │
│ │nu │reprezentantul│
│ │funcţionează │tehnic │
│ │ │TREK │
├───────────────┼──────────────┼──────────────┤
│ │Temperatura în│Verifică │
│ │laborator este│termostatul. │
│ │prea │Resetaţi-l │
│ │mare. │dacă este │
│ │ │necesar. │
│ ├──────────────┼──────────────┤
│ │Punctul de │ │
│Semnalul │încălzire ales│ │
│luminos pentru │este greşit │Apelează │
│temperatură are│sau calibrarea│departamentul │
│culoarea │este │tehnic TREK. │
│chihlimbarului │incorectă. │ │
│ ├──────────────┤ │
│ │Temperatura │ │
│ │sistemului │ │
│ │este prea │ │
│ │înaltă. │ │
│ ├──────────────┼──────────────┤
│ │ │Apasă butonul │
│ │ │reset al │
│ │Sistem de │alarmei. │
│ │alarmă defect.│Dacă alarma │
│ │ │sună din nou, │
│ │ │apelează │
│ │ │departamentul │
│ │ │de suport │
│ │ │tehnic │
│ │ │TREK. │
│ ├──────────────┼──────────────┤
│ │Ventilatoarele│Apelează │
│ │nu │departamentul │
│ │funcţionează. │tehnic TREK. │
├───────────────┼──────────────┼──────────────┤
│ │Sertar(e) │Închide sertar│
│ │deschise. │(e). │
│Ecranul de ├──────────────┼──────────────┤
│control │Punctul de │ │
│pentru │încălzire este│ │
│temperatură │prea mic. │Apelează │
│afişează ├──────────────┤departamentul │
│valoare scăzută│Garnitura de │tehnic TREK. │
│în interiorul │izolare este │ │
│echipamentului.│crăpată/nu │ │
│ │izolează │ │
│ │ermetic. │ │
│ ├──────────────┤ │
│ │Defect placă │ │
│ │AT. │ │
├───────────────┼──────────────┼──────────────┤
│Alarma pentru │Temperatura │Nici o │
│temperatură nu │este adecvată.│acţiune. │
│se aude │ │ │
│când ├──────────────┼──────────────┤
│comutatorul │Defecţiune │Apelează │
│audio │alarmă │departamentul │
│este pe poziţie│acustică. │tehnic TREK. │
│deschis. │ │ │
│ │ │ │
└───────────────┴──────────────┴──────────────┘
i. Erori de sistem VersaTREK
┌─────────────┬──────────────┬─────────────┐
│Problemă │Cauze posibile│Acţiuni │
│ │ │corective │
├─────────────┼──────────────┼─────────────┤
│ │LED ars. │ │
│ ├──────────────┤ │
│Sertar │Defecţiuni ale│ │
│deschis, │circuitului │Apelează │
│lumină │electric. │departamentul│
│LED ├──────────────┤tehnic TREK. │
│nefuncţională│Întrerupătorul│ │
│ │magnetic este │ │
│ │îndoit │ │
│ │sau rupt. │ │
│ ├──────────────┤ │
│ │Senzorul de │ │
│ │activare │ │
│ │pentru sertar │ │
│ │nu │ │
│ │este aliniat │ │
│ │corespunzător.│ │
├─────────────┼──────────────┼─────────────┤
│ │ │Inspectaţi │
│ │Obiect care │uşa şi │
│ │împiedică │garnitura │
│ │închiderea │pentru │
│Lumină LED │sertarului. │a îndepărta │
│activată când│ │orice fel de │
│sertarul pare│ │obiect │
│să fie │ │străin. │
│închis ├──────────────┼─────────────┤
│ │LED-ul │ │
│ │indicator nu │ │
│ │funcţionează. │Apelează │
│ ├──────────────┤departamentul│
│ │Senzorul de │tehnic TREK. │
│ │activare │ │
│ │pentru sertar │ │
│ │nu este │ │
│ │aliniat │ │
│ │corespunzător.│ │
└─────────────┴──────────────┴─────────────┘
j. Erori la sertare
┌──────────────┬──────────────┬──────────────┐
│Problema │Cauze posibile│Acţiuni │
│ │ │corectoare │
├──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│ │Şinele │ │
│ │sertarului │ │
│ │sunt îndoite. │ │
│ ├──────────────┤ │
│ │În spatele │ │
│Sertarele nu │sertarului se │Apelează │
│pot fi │află obiecte │departamentul │
│închise │străine. │tehnic TREK. │
│ ├──────────────┤ │
│ │Sertarul nu a │ │
│ │fost │ │
│ │reintrodus │ │
│ │adecvat, după │ │
│ │înlăturarea │ │
│ │lui din │ │
│ │echipament. │ │
│ ├──────────────┤ │
│ │Mecanismul de │ │
│ │blocare a fost│ │
│ │repoziţionat │ │
│ │greşit, după │ │
│ │înlăturarea │ │
│ │sertarului din│ │
│ │echipament. │ │
├──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│ │Şinele │ │
│ │sertarului │Apelează │
│Sertarele nu │sunt îndoite. │departamentul │
│pot fi ├──────────────┤tehnic TREK. │
│deschise │Şinele nu sunt│ │
│ │aliniate. │ │
│ ├──────────────┤ │
│ │În spatele │ │
│ │sertarului se │ │
│ │află obiecte │ │
│ │străine │ │
├──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│ │În spatele │ │
│ │sertarului se │ │
│ │află obiecte │Apelează │
│Sertarele nu │străine. │departamentul │
│rămân ├──────────────┤tehnic TREK. │
│deschise │Garnitura de │ │
│ │etanşare │ │
│ │lipseşte sau │ │
│ │este │ │
│ │deteriorată. │ │
│ ├──────────────┤ │
│ │Sertarul nu │ │
│ │este aliniat │ │
│ │la unitate. │ │
├──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│ │ │Atenţie! │
│ │ │Aplică măsuri │
│ │ │de protecţie │
│ │ │adecvate: │
│ │ │mănuşi, mască │
│ │Flacoane │FFP2, │
│ │sparte sau │ochelari de │
│ │crăpate. │protecţie. │
│ │ │Adună │
│ │ │cioburile, │
│Curge lichid │ │curăţă şi │
│în sertare │ │dezinfectează │
│ │ │suprafeţele │
│ │ │afectate. │
│ │ │Apelează │
│ │ │departamentul │
│ │ │tehnic TREK │
│ │ │pentru │
│ │ │scurgeri │
│ │ │semnificative.│
│ ├──────────────┼──────────────┤
│ │ │Foloseşte │
│ │ │măsuri de │
│ │ │protecţie │
│ │Aerosoli │adecvate │
│ │produşi de │(halat, mască,│
│ │flacoane. │mănuşi)! │
│ │ │Curăţă şi │
│ │ │dezinfectează │
│ │ │suprafeţele │
│ │ │afectate. │
│ │ │Schimbă │
│ │ │tamponul de │
│ │ │absorbţie. │
├──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│ │Senzorul sau │Dezactivează │
│Senzorul sau │întrerupătorul│locaşul şi │
│întrerupătorul│sunt │apelează │
│sunt │defecte. │departamentul │
│defecte │ │tehnic TREK.. │
│ │ │ │
└──────────────┴──────────────┴──────────────┘
k. Semnale luminoase
┌────────────┬─────────────┬──────────────┐
│Problemă │Cauze │Acţiuni │
│ │posibile │corective │
├────────────┼─────────────┼──────────────┤
│ │ │Înlătură │
│ │ │flaconul; │
│ │ │ataşează │
│ │Flacoanele nu│conectorul │
│Luminile LED│au fost │VersaTREK. │
│pentru │introduse │Repetă │
│locaşuri │corespunzător│procesul de │
│continuă să │în locaşuri. │încărcare │
│clipească şi│ │pentru │
│după ce │ │flacoane. │
│flacoanele │ │Aliniază │
│au fost │ │conectorul │
│introduse │ │VersaTREK la │
│ │ │senzor. │
│ ├─────────────┼──────────────┤
│ │LED-urile nu │Apelează │
│ │funcţionează.│departamentul │
│ ├─────────────┤tehnic TREK. │
│ │Senzorul │ │
│ │pentru │ │
│ │flacoane nu │ │
│ │funcţionează.│ │
├────────────┼─────────────┼──────────────┤
│ │Flacon │Procesează │
│ │pozitiv. │flaconul │
│ │ │pozitiv. │
│ ├─────────────┼──────────────┤
│ │ │Apasă │
│Unul sau mai│ │întrerupătorul│
│multe │ │pentru ca │
│LED-uri sunt│Senzor flacon│lumina să │
│aprinse în │blocat. │dispară. Dacă │
│mod │ │semnalul │
│constant: │ │luminos │
│lumină │ │persistă, │
│continuă sau│ │apelează │
│intermitentă│ │departamentul │
│ │ │tehnic TREK. │
│ ├─────────────┼──────────────┤
│ │ │Verifică │
│ │Eroare de │detaliile │
│ │motor, │locaşului şi │
│ │convertor sau│tipul de │
│ │EEPROM. │avarie. │
│ │ │Dezactivează │
│ │ │locaşul. │
│ ├─────────────┼──────────────┤
│ │ │Apelează │
│ │LED defect. │departamentul │
│ │ │tehnic TREK. │
├────────────┼─────────────┼──────────────┤
│LED-urile nu│ │ │
│emit │LED-uri │ │
│semnale │defecte. │Apelează │
│luminoase │ │departamentul │
│pentru ├─────────────┤tehnic TREK. │
│introducere/│ │ │
│înlăturare │Eroare de │ │
│flacon după │conexiune. │ │
│câteva │ │ │
│încercări │ │ │
│repetate. │ │ │
├────────────┼─────────────┼──────────────┤
│ │În sistem nu │Verifică │
│Luminile │se află nici │inventarul │
│pentru │un flacon │flacoanelor │
│status │pozitiv. │din │
│unitate nu │ │sistem. │
│funcţionează├─────────────┼──────────────┤
│atunci când │Conexiunea/ │ │
│LED-ul roşu │comunicarea │ │
│pentru │dintre sertar│ │
│sertar este │şi placa │Apelează │
│activ. │centrală este│departamentul │
│ │defectuoasă. │tehnic TREK. │
├────────────┼─────────────┤ │
│Pictograma │Cititorul │ │
│pentru │pentru coduri│ │
│Introducere │de bare nu │ │
│flacon nu │funcţionează.│ │
│activează │ │ │
│cititorul ├─────────────┤ │
│pentru │Ecranul LCD │ │
│coduri de │este defect. │ │
│bare. │ │ │
└────────────┴─────────────┴──────────────┘
Identificarea culturilor Fie că sunt culturi pe mediul LJ, pentru care citirea se face manual, fie că sunt culturi în mediul lichid obţinute prin cultivare în sisteme cu semnalare automată a pozitivării, finalizarea rezultatului este posibilă doar după parcurgerea etapelor de identificare a microbilor crescuţi^26: ● Examinare macroscopică (aspectul coloniilor, culoarea/aspectul mediului) ● Examinarea microscopică în coloraţia ZN. ● Test imunocromatografic rapid Ag MPT64, dacă pe frotiul colorat ZN sunt prezenţi BAAR. Morfologia macroscopică a coloniilor În funcţie de compoziţia mediului de cultură, morfologia macroscopică a coloniilor de micobacterii din complexul M. tuberculosis poate varia, de aceea vom descrie mai jos aspectul orientativ pe care îl putem vedea cel mai des pe mediile folosite în ţara noastră, la examinarea cu ochiul liber sau/şi cu lupa: Morfologia macroscopică a coloniilor pe mediul LJ care conţine glicerol^4,18,22 ● colonii rugoase (R), de 1-4 mm diametru, crem-gălbui conopidiforme, uscate, cu margini bine definite, crenelate, uşor bombate sau uneori plate (M. tuberculosis). Coloniile tinere, pe mediu bine hidratat pot fi netede, bombate. ● colonii netede (S), de 1-2 mm diametru, alb-gălbui (M bovis) ● culoarea mediului nu este modificată sau cel mult pare discret decolorat. ● dacă mediul este intens decolorat sau verde-albăstrui se va suspecta contaminare cu alţi microbi; se face totuşi frotiu pentru verificare. Nu se face frotiu dacă mediul este lichefiat. Morfologia macroscopică a coloniilor crescute în mediul lichid Middlebrook 7H9. ● mediul rămâne limpede şi are un depozit fin la fundul tubului; după agitarea tubului lichidul are suspensii granulare de dimensiuni diferite. ● mediul este tulbure uniform sau se tulbură după agitare. Morfologia microscopică a coloniilor^3,4: ● La prepararea frotiurilor se apreciază modul de emulsionare; grunjoasă-poate sugera MT; uniformă-poate sugera NTM sau alţi microbi. ● colorează ZN şi examinează la microscopul optic ● descrie în caietul de lucru: - aşezarea în frotiu: corzi-serpentine, cu număr mic de BAAR izolaţi (PC = pozitiv corzi); grămezi de bacili, respectiv bacili aglomeraţi în mai multe zone, fără să se poată vedea continuitatea corzilor, cu puţini BAAR izolaţi (PG = pozitiv grămezi); BAAR distribuiţi nesistematizat, uniform (PN = BAAR pozitiv, nesistematizaţi); prezenţa de corzi laxe. – lungimea bacililor: bacili mai lungi de 7 fim. Verifică dacă sunt şi bacili ramificaţi; bacili cu lungimea între 3-6 fim; bacili de 2 jim sau forme cocoide. – tinctorialitatea bacililor: BAAR coloraţi uniform; BAAR coloraţi granular; BAAR incomplet coloraţi, albaştri, cianofili. – Prezenţa altor microbi, singuri sau în asociere cu BAAR. Înregistrarea/Raportarea rezultatelor Rezultatul examinării microscopice efectuate pentru verificarea/identificarea culturii rămâne înregistrat doar în documentele laboratorului. În registrul laboratorului şi în buletinul eliberat către clinician va figura doar diagnosticul final, după caz: complex M tuberculosis, sau NTM (micobacterii netuberculoase), cultură contaminată. În cazul culturilor din mediul lichid, pentru creşterea aderenţei microbilor la lamă se foloseşte albumină adezivă^1, care ajută la fixarea preparatelor lichidiene cu celularitate săracă, pe lamă. Aplică pe lamă o peliculă foarte fină din unul din preparatele de mai jos. Pelicula groasă împiedică uscarea şi favorizează desprinderea preparatului de pe lamă. a. Albumina glicerinată Mayer^28 ● 50 ml albuş de ou (de la 2 ouă) ● 50 ml glicerină anhidră ● 1 g salicilat de sodiu umectat cu ADS Amestecă prin mişcări circulare, aseptic, într-un balon steril cu perle de sticlă. Filtrează prin hârtie de filtru sterilă. Rezultă un lichid translucid, slab gălbui, limpede. Verifică sterilitatea. Păstrează la temperatura camerei 2-6 luni. Lucrează steril, cu pipetă sau tampon. b. Albuş de ou acetic ● 1 albuş de ou agitat puternic câteva minute, prin mişcări circulare cu ● 150 ml ADS ● adaugă apoi 3 ml acid acetic. ● filtrează prin hârtie de filtru sterilă. Verifică pentru sterilitate. Conservare indefinită, la temperatura camerei. Lucrează steril, cu pipetă sau tampon. Etapele examenului microscopic pentru examinarea culturilor pozitive sunt descrise mai sus la "Examenul microscopic", coloraţia ZN. Prepararea frotiurilor. a. Cultura pe mediul LJ 1. marchează lama cu numărul culturii 2. pune o picătură de apă distilată sau albumină adezivă pe lamă folosind pipetă 3. ia cu ansa bacteriologică din 2-3 colonii şi amestecă blând în lichidul de pe lamă, fără să stropeşti 4. usucă la aer, pe plita cu termostatare (65-70°C) şi aşteaptă cel puţin 2 ore înainte de etapa următoare b. Cultura din mediul lichid Middlebrook 7H9 1. marchează lama cu numărul culturii 2. agită tubul cu cultură manual sau prin vortexare. Aşteaptă 5 minute să sedimenteze aerosolii infecţioşi. 3. pune o picătură de albumină adezivă pe lama folosind pipetă 4. ia cu pipeta cca 100 μl din cultură şi amestecă blând în lichidul de pe lamă, fără barbotare. 5. usucă la aer, pe plita cu termostatare (65-75°C) şi aşteaptă cel puţin 2 ore înainte de etapa următoare. Colorarea frotiurilor. Coloraţia Ziehl Neelsen^16 1. pune lamele cu frotiurile fixate pe suportul de colorare fără să se atingă între ele. 2. acoperă complet frotiurile cu soluţie 0.3% de fuchsină fenicată proaspăt filtrată. 3. treci pe sub frotiuri flacăra unui bec de gaz până la emiterea de vapori, fără să fiarbă. Repetă acţiunea de 3-4 ori în primele 3 minute. Completează cu fuchsină dacă aceasta s-a uscat sau s-a scurs de pe lamă. Lasă până la 10 minute. 4. spală cu jet slab de apă de robinet şi scurge apa. 5. acoperă frotiul cu alcool-acidulat 3% şi lasă-l pentru decolorare maxim 3 min. Nu insista cu decolorarea dacă preparatul este efectuat din cultură (în peste 90 % din aceste preparate sunt prezenţi BAAR, care nu se vor decolora) 6. spală din nou cu jet slab de apă de robinet şi scurge apa. 7. acoperă frotiul cu albastru de metilen 0,3% timp de 30 sec., maximum 1 minut. 8. spală blând sub jet de apă de robinet. 9. Usucă la aer, fără să forţezi uscarea. Frotiurile din culturi se colorează exclusiv ZN. Culturile pentru care frotiul indică prezenţa BAAR se testează obligatoriu pentru confirmarea apartenenţei la complexul M. tuberculosis, folosind test rapid imunocromatografic Ag MPT64. Culturile cu rezultat negativ Ag MPT64 se trimit imediat la LNR pentru identificare de specie. ● Indiferent de metoda de preparare a frotiurilor, ele trebuie lăsate să se usuce la aer, ferite de raze UV, pe plita cu termostatare din interiorul CPM, de unde sunt scoase pentru colorare. ● Toate materialele folosite (pipete, anse, tuburi) se colectează în recipiente pentru materiale infecţioase şi se autoclavează. ● După colorare usucă frotiurile în poziţie înclinată pe suport de lame la temperatura camerei. ● Nu încălzi lamele pentru grăbirea uscării pentru că frotiul se poate crăpa şi se dezlipeşte de pe lamă. ● La prepararea frotiurilor din culturi se pot genera o cantitate mare de aerosoli infecţioşi. ● Se respectă obligatoriu precauţiile de prevenire a generării şi răspândirii aerosolilor infecţioşi. ● Chiar dacă se prepară mai multe spoturi pe aceeaşi lamă, acestea trebuie să fie din aceeaşi cultură, nu din culturi diferite, pentru a nu se contamina încrucişat în etapele de colorare, prin prelingere de pe un spot pe altul, cu rezultat fals pozitiv. Testul imunocromatografic pentru identificarea complexului M.tuberculosis în cultură Principiul testului Caracterizarea biochimică, imunologică şi moleculară a MTB a dus la evidenţierea mai multor antigene utile în identificarea bacteriilor aparţinând complexului M. tuberculosis^1,29,3 Testul de identificare a Ag MPT64, pus în evidenţă în lichidul culturilor bacteriene de MTB, foloseşte anticorpi monoclonali anti-MPT64 proveniţi de la şoareci, în test de tip sandwich. Descrierea testului ● Testul conţine un godeu pentru probă şi o porţiune absorbantă cu liniile T = test şi C = control ● Linia control se foloseşte pentru validarea reacţiei, fiind colorată în roşu doar dacă tehnica a fost corect aplicată şi reactanţii sunt funcţionali ● Linia test se colorează în roşu în cazul prezenţei de Ag MPT64 în suspensia bacteriană Păstrare ● La temperatura camerei, între 1-30°C (nu se congelează) ● Nu se ţine la lumină directă, este sensibil la căldură şi umiditate ● Testul se va folosi imediat după scoaterea din pachet ● Nu se va utiliza după expirarea valabilităţii Prepararea suspensiei bacteriene ● Culturile în mediu lichid pot fi folosite ca atare, depunând 100 μl în godeul pentru probă ● Culturile în mediu solid se prepară astfel: se suspendă 3-4 colonii în 200 μl soluţie de extracţie; dacă există lichid de condens la baza pantei mediului solid, se folosesc 100 microlitri din acesta. Procedura de lucru ● Se scoate caseta din pachet şi se aşează pe o suprafaţă netedă, uscată ● Se marchează cu numărul culturii de cercetat ● Se depun 100 μl (mediu lichid sau suspensie bacteriană în soluţia de extracţie) în godeul pentru probă ● Se urmăreşte colorarea în roşu-violet a benzilor test şi control pe măsura absorbţiei probei ● Interpretarea rezultatului are loc la 15 minute de la depunerea probei Rezultat negativ: se colorează doar linia control C. Pot fi NTM (dacă frotiul colorat ZN arată prezenţa de BAAR) sau microbi de contaminare (coloraţi albastru). Rezultat pozitiv: complexul M. tuberculosis, se colorează ambele linii, test T şi control C. Test invalid, neinterpretabil: nu se colorează linia C. Necesită repetare pe o altă casetă. Înregistrări Rezultatele testului se înregistrează în caietul de lucru pentru identificare. În registrul laboratorului şi în buletinul de rezultate se scrie doar rezultatul final, concluzia: MTB sau NTM, sau/şi cultură în curs de identificare, dacă cultura a fost trimisă la LNR pentru identificare de specie în cazul rezultatului negativ la cultura cu frotiu BAAR pozitiv la verificarea microscopică, ori cultură contaminată. TEHNICA EFECTUĂRII ANTIBIOGRAMEI MICOBACTERIILOR Principiu: Se compară creşterea MTB însămânţat în mediul care conţine substanţe anti-TB (tuburi test) cu creşterea pe tuburile de control (martor), care nu conţin aceste substanţe şi se apreciază creşterea, respectiv lipsa creşterii pe tuburile test^2,4. Testarea se face pentru concentraţii diferite de substanţe anti-TB, denumite concentraţii critice care, cel puţin teoretic, corespund concentraţiilor realizate de substanţa respectivă în sângele pacienţi lor^32. Pentru ca o cultură să fie considerată cu rezistenţă la o substanţă anti-TB, trebuie să fie depăşită proporţia critică de creştere, care este stabilită pentru majoritatea substanţelor testate, la 1% din populaţia totală testată. Rezultatele ABG au valoare orientativă şi exprimă comportamentul in vitro al micobacteriilor, cu puţine dovezi referitoare la relevanţa clinică a rezultatelor^32. Dintre tehnicile standardizate recomandate de OMS^26, prezentăm mai jos metoda concentraţiilor absolute, metoda proporţiilor în mediul LJ şi metoda proporţiilor în mediul lichid Middlebook 7H9. Concentraţiile critice faţă de care se face testarea sunt revizuite, aprobate şi comunicate de către OMS periodic şi trebuie adoptate de către laboratoarele care fac ABG^32. Metoda concentraţiei absolute^3,4 1. Numerotarea tuburilor martor şi test cu numărul din registru al tulpinii de testat. Odată cu numerotarea se verifică şi aspectul macroscopic al mediului, lotul şi data expirării. Tuburile se scot din frigider cu cel puţin 30 minute înainte de însămânţare, pentru echilibrare termică. 2. Prepararea inoculului bacterian Foloseşte cultura de 21-30 zile de la data însămânţării: ● cultura primară cu creştere de 2+ sau 3+, ● subcultură în cazul culturii primare îmbătrânite sau sărace, dar nu mai puţin de 10 colonii pe cultura iniţială. Pentru subcultură, indiferent de motiv, se prelevează din cât mai multe colonii pentru o cât mai bună reprezentare a populaţiei bacteriene. 3. Prepararea suspensiei bacteriene ● Încarcă o ansă bacteriologică cu bacterii prelevate din cât mai multe colonii (cca 5 mg) ● Emulsionează în 2 ml ADS ● Aşteaptă 30 minute să sedimenteze ● Trece supernatantul în alt tub, cu pipetă sterilă ● Ajustează turbiditatea prin adăugare de ADS în timp ce compari cu etalon de turbiditate McFarland nr. 1 (corespunde la 1 mg/ml masă micobacteriană, aproximativ 1 x 10^8 UFC/ml)^32a. Foloseşte pentru prepararea suspensiei bacteriene acelaşi tip de tub cu tubul etalon. Păstrează etalonul la întuneric şi agită-l înainte de folosire. Înlocuieşte-l dacă apar grunji. 4. Diluarea suspensiei bacteriene ● Ia din suspensia bacteriană de 1 mg/ml (punct 3) o picătură (0.05ml) şi diluează în 10 ml ADS (rezultă o diluţie de 1/200 ). ● Schimbă pipeta la fiecare nouă diluţie. Pipetează numai cu para. 5. Însămânţează câte 0.2 ml (4 picături) în fiecare tub martor şi în fiecare tub test. 6. Inundă suprafaţa mediului şi incubează la 36,5-37°C , timp de 48-72 ore înclinat, astfel încât suprafaţa pantei să fie orizontală, cu lichidul pe ea, cu capacul semi-înfiletat. 7. Ridică tuburile în poziţie verticală şi incubează în continuare până la 21 zile, când vei face citirea/interpretarea rezultatelor. Dacă creşterea pe tuburile martor este slabă, cu colonii punctiforme, rare, prelungeşte incubarea până la 28 zile, când faci citirea finală. 8. Citirea şi interpretarea rezultatelor ABG micobacteriilor. ● verifică seria de tuburi corespunzătoare tulpinii de control M. tuberculosis ATCC. Pe tuburile martor creşterea trebuie să fie cu colonii numeroase, dar numărabile. Pc tuburile test să nu crească colonii. ● examinează tuburile martor ale tulpinilor de testat şi notează creşterea bacteriană: - 50-100 colonii = 1+, – 100-200 colonii = 2+, – creştere > 200 colonii până la colonii confluente = 3+. Dacă sunt sub 50 colonii pe tubul martor sau nu s-au dezvoltat germeni (NSDG), ABG este neinterpretabilă. Interpretează cu prudenţă rezultatele în cazul creşterii a >20 colonii pe tuburile test şi creştere de 3+ (confluent) pe tuburile martor. Contaminarea cu microbi cu creştere rapidă se consemnează ca atare (denotă deficienţe de tehnică). ● Examinează creşterea de pe tuburile test şi se compară cu cea de pe tuburile martor. ● Rezultate: ● SENSIBIL = absenţa creşterii bacteriene sau < 20 colonii pe tubul test. ● REZISTENT = mai mult de 20 colonii pc tubul test, la o anumită concentraţie de substanţă antituberculoasă, creşterea fiind egală, comparabilă cu cea de pe tubul martor. ● NEINTERPRETABIL = creştere pe tubul martor a mai puţin de 50 colonii. ● CONTAMINAT = cresc microbi de contaminare. Metoda proporţiilor, mediul LJ, tehnica indirectă^2,3,4 1. Numerotează tuburile martor şi test cu numărul din registru al tulpinii de testat. Odată cu numerotarea verifică şi aspectul macroscopic al mediului, lotul şi data expirării. Scoate din frigider tuburile cu cel puţin 30 minute înainte de însămânţare, pentru echilibrare termică. 2. Prepararea inocului bacterian. Foloseşte cultura de 21-30 zile de la data însămânţării: ● cultura primară cu creştere de 2+ - 3+, ● sau subcultura în cazul culturii primare îmbătrânite sau sărace dar nu mai puţin de 10 colonii. Pentru subcultură, indiferent de motiv, se prelevează din cât mai multe colonii. 3. Pregătirea materialelor ● scoate din frigider mediile corespunzătoare numărului de tulpini care urmează să fie testate ● numerotează cu marker permanent câte o serie de tuburi pentru fiecare tulpină, cu numărul din registru al culturii şi cu diluţia inoculului, astfel: câte două tuburi martor pentru fiecare diluţie a inoculului şi câte un tub cu fiecare substanţă antituberculoasă pentru fiecare diluţie a inoculului. ● numerotează tuburile pentru prepararea suspensiei bacteriene, tuburile pentru prepararea inoculului standardizat şi tuburile pentru prepararea diluţiei de însămânţat (câte 5 tuburi pentru diluţii). ● repartizează câte 1 ml ADS în tuburile pentru prepararea suspensiei bacteriene şi câte 9 ml în tuburile pentru prepararea diluţiilor. Pregăteşte şi 2-3 tuburi ca rezervă. ● numerotează câte o lamă de microscop pentru fiecare cultură ● aşează la îndemână: - Flacon cu ADS – Pipete sterile de 1 ml sau 2 ml cu pară – Substanţe dezinfectate - alcool medicinal 4. Prepararea şi etalonarea suspensiei bacteriene Deoarece toate manoperele sunt generatoare de aerosoli infecţioşi, se va lucra în CPM, cu echipament pentru protecţie personală. Pipetează numai cu pară. Schimbă pipeta la fiecare nouă diluţie. ● încarcă o ansă bacteriologică cu bacterii prelevate din cât mai multe colonii (cca 5 mg) de pe mediul LJ, fără să fie antrenat şi mediul. ● emulsionează în 1 ml ADS. La sfârşit etalează un spot pe lama cu numărul corespunzător al culturii. După uscare, fixează şi colorează ZN frotiul ● completează cu ADS până la cca 3 ml. Omogenizează fără a barbota. ● aşteaptă 30 minute să sedimenteze flocoanele mari. ● ia cu o pipetă sterilă supernatantul şi trece-l într-un tub care are dimensiunile etalonului de turbiditate. ● ajustează turbiditatea prin comparare cu etalonul standard nr. 1 McFarland. Suspensia micobacteriană astfel etalonată corespunde la aproximativ 1x10^8UFC/ml.^32a ● păstrează etalonul în condiţiile specificate de producător. Este îndepărtat în momentul în care apar grunji de aglutinare. Înainte de utilizare etalonul este omogenizat prin agitare. ● Etalonarea suspensiei bacteriene: - suspensia bacteriană din cele 2 eprubete (etalon şi test) se compară ţinându-le în faţa unei hârtii albe cu linii negre de 2-3 mm, paralele şi orizontale. Liniile trebuie să se vadă cu aceeaşi claritate prin cele 2 eprubete. – dacă suspensia bacteriană are turbiditatea diferită de a etalonului, se adaugă masă bacteriană sau ADS, după caz. – se poate folosi aparat (densimat) pentru aprecierea turbidităţii date de bacterii Citirea frotiurilor colorate ZN pentru confirmarea purităţii culturilor se face imediat după efectuare şi nu se vor însămânţa suspensiile bacteriene care conţin microbi de contaminare. 5. Diluarea suspensiei bacteriene ● ia 1 ml din suspensia bacteriană de 1 mg/ml cu o pipetă sterilă şi diluează în 9 ml ADS (diluţie 10^-1). ● omogenizează cu altă pipetă, fără barbotare şi ia 1 ml din diluţia 10^-1, transvazează în 9 ml ADS (diluţie 10^-2). ● continuă în acelaşi fel până la realizarea diluţiei de 10^-5 Schimbă pipeta după fiecare diluţie. 6. Însămânţează din diluţia 10^-3 câte 0.2 ml în fiecare din cele două tuburi martor şi în fiecare tub test marcat pentru această diluţie. Însămânţează din diluţia 10^-5 câte 0.2 ml în fiecare din cele două tuburi martor şi în fiecare tub test marcat pentru această diluţie. ● inundă toată suprafaţa mediului cu atenţie, astfel încât inoculul să nu ajungă la dop, ● incubează la 36,5 - 37°C, timp de 48-72 ore înclinat astfel încât suprafaţa pantei să fie orizontală, orientată în sus, cu capacul semi-înfiletat. ● după evaporarea lichidului, ridică tuburile în poziţie verticală, închide-le complet şi incubează în continuare până la 28 zile, când se face prima citire/interpretare a rezultatelor. 7. Citirea şi interpretarea rezultatelor ABG prin metoda proporţiilor, pe mediu LJ Citire la 28 şi la 42 de zile (dacă este necesar). Citirea antibiogramei. Prima citire se face după 28 de zile de la însămânţare. Se începe cu citirea rezultatelor pentru tulpina M. tuberculosis ATCC 25177, H37 Ra pusă în lucru pentru fiecare lot nou de mediu. În interpretarea rezultatelor tuturor ABG care folosesc acelaşi lot se va face referire la această citire. ● numără coloniile crescute pe tuburile de control corespunzătoare diluţiilor 10^-3 şi 10^-5 notând media numărului de colonii. ● numără coloniile crescute pe tuburile test corespunzătoare diluţiilor 10^-3 şi 10^-5. ● scrie numărul exact de colonii în registru şi calculează proporţia dintre numărul coloniilor crescute pe tuburile test şi pe tuburile de control cu aceleaşi diluţii. Scrie proporţia calculată. În cadrul aceleiaşi diluţii: nr. colonii de pe tubul test x 100/ media numărului de colonii de pe tuburile martor. Citire la 28 zile: ● Dacă pe tuburile test la nici una din diluţiile bacteriene nu este creştere bacteriană, se consideră tulpina SENSIBILĂ şi se poate elibera rezultatul. Se notează S. ● Dacă creşterea pe tuburile test este mai mare decât 1% din media numărului coloniilor de pe tuburile martor se consideră că tulpina este REZISTENTĂ la acea substanţă antituberculoasă. Se notează R. Citire la 42 zile: ● Dacă pe tuburile test creşterea este mai mică decât 1% din media numărului coloniilor de pe tuburile martor se vor reincuba tuburile corespunzătoare tulpinii respective până la 42 de zile, când se face citirea finală şi interpretarea rezultatelor ca la 28 de zile. Metoda proporţiilor modificată, în sistem MGIT 960, tehnica indirectă Testarea se poate face din cultura obţinută în mediul lichid sau pe mediul solid LJ. Etapele de lucru sunt identice de la momentul însămânţării inoculului, însă acesta se prepară diferit, în funcţie de mediul de creştere a culturii primare, fiind necesară parcurgerea etapelor prezentate în diagramele de mai jos (Tabel VII - X). Testarea folosind MGIT 960 se poate face pentru RMP, INH, SM, EMB, PZM, Ofl, CAP, MOX, K. Testarea substanţelor anti-TB de linia a 2-a se face doar în LNR. Tabel VII. Diagrama de lucru pentru testarea substanţelor anti-tuberculoase de linia întâi în sistem MGIT, din cultura pozitivă în mediul solid
┌─────────────┬────────────────────────┐
│Etape │MGIT SIRE - din cultura │
│ │pe mediul solid │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │1. Adaugă câte 4 ml ADS │
│ │la fiecare flacon cu │
│ │substanţă anti-TB. (40 │
│ │ABG) │
│ │2. Împarte câte 1 ml în │
│ │criotuburi sterile (pt │
│Reconstituire│10 ABG). Scrie data │
│SIRE │reconstituirii şi data │
│ │expirării. Se pot │
│ │distribui cantităţi │
│ │diferite, în │
│ │funcţie de volumul de │
│ │lucru. │
│ │3. Congelare la - 20° C │
│ │maxim 6 luni. │
│ │4. Decongelează pentru │
│ │folosire şi ce rămâne se│
│ │aruncă. │
│ │Nu se recongelează! │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │1. Numerotează câte 5 │
│ │tuburi MGIT pentru │
│ │fiecare cultură şi │
│ │scrie: │
│ │CC, S, I, R, E. │
│ │2. Plasează tuburile în │
│Pregătire │această ordine în │
│ │suportul de incubare. │
│ │3. Adaugă aseptic câte │
│ │0,8 ml supliment de │
│ │creştere pentru SIRE │
│ │(acelaşi │
│ │lot cu kitul anti-TB), │
│ │la fiecare tub. │
│ │4. Pipetează aseptic │
│ │câte 100 μl din │
│ │soluţiile stoc de SIRE │
│ │în tuburile │
│ │corespunzătoare. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │1. Pune 4 ml mediu │
│ │Middlebrook 7H9 în 1 tub│
│ │steril cu dop, care │
│ │conţine │
│ │8-10 perle de sticlă │
│ │(2-3 mm). │
│ │2. Prelevează cu ansa │
│ │din cât mai multe │
│ │colonii tinere (nu mai │
│ │veche de │
│ │14-21 zile), evitând │
│ │antrenarea mediului şi │
│ │descarcă în mediu. │
│ │3. Agită 2-3 minute │
│ │pentru ruperea corzilor.│
│Preparare │Suspensia să fie cu │
│inocul │turbiditate mai mare de │
│ │1 McFarland. │
│ │4. Lasă să sedimenteze │
│ │20 minute. │
│ │5. Transferă │
│ │supernatantul în alt tub│
│ │steril cu dop şi lasă │
│ │alte 15 minute │
│ │să sedimenteze. │
│ │6. Transferă │
│ │supernatantul (să nu mai│
│ │aibă grunji sau corzi) │
│ │în al treilea │
│ │tub steril cu dop. │
│ │Suspensia să fie mai │
│ │intensă decât 0,5 │
│ │McFarland. │
│ │7. Ajustează cu SFS la │
│ │0,5 McFarland prin │
│ │comparare vizuală, dar │
│ │nu mai │
│ │puţin de 0,5 McFarland. │
│ │8. Diluează 1 ml din │
│ │suspensia etalonată cu 4│
│ │ml SFS, şi rezultă │
│ │DILUŢIE │
│ │1:5 din suspensia 0,5 │
│ │McFarland, care │
│ │reprezintă INOCULUL │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │● Pipetează aseptic 0,1 │
│ │ml din suspensia │
│ │bacteriană INOCUL în 10 │
│Prepara │ml SFS şi │
│Control │rezultă suspensia pentru│
│creştere CC │control: 1:100. │
│ │Omogenizează atent. │
│ │● Însămânţează 0,5 ml │
│ │din diluţia 1:100 în CC.│
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Însămânţează în fiecare │
│ │tub cu substanţe anti-TB│
│Inocul tuburi│câte 0,5 ml (500 μl) din│
│SIRE │suspensia bacteriană │
│ │preparată: INOCUL= │
│ │DILUŢIE 1:5 din │
│ │suspensia 0,5 │
│ │McFarland. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Tulpina M. tuberculosis │
│CIC │ATCC 25177. Preparată │
│ │identic cu tulpinile │
│ │test. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Însămânţează 0,1 ml din │
│ │suspensia bacteriană în │
│ │placă cu agar sânge, │
│ │pune │
│ │în pungă de plastic şi │
│ │incubează la 35-37° C, │
│Control │timp de 48 ore. │
│puritate │Verifică placa cu agar │
│cultură │sânge după 48 ore de │
│ │incubare. Absenţa │
│ │contaminării │
│ │-corect, se lasă ABG în │
│ │continuare la incubat în│
│ │MGIT. │
│ │Dacă este contaminare, │
│ │se scoate ABG din │
│ │incubator şi se repetă │
│ │din │
│ │cultură pură. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │În suport cu 5 poziţii, │
│Incubare │cu controlul în partea │
│ │stângă. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│Citire │Automată │
├─────────────┼────────────────────────┤
│Interpretare │Automată │
└─────────────┴────────────────────────┘
Lucrează respectând precauţiile pentru protecţia personală şi a mediului (CPM, mască FFP2, mănuşi, ochelari). Foloseşte pipete calibrate. Tabel VIII. Diagrama de lucru pentru testarea substanţelor anti-tuberculoase de linia întâi în sistem MGIT, din cultura pozitivă în sistem MGIT
┌─────────────┬────────────────────────┐
│ │MGIT SIRE - din cultura │
│Etape │Pozitivă în sistem MGIT │
│ │960 │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │1. Adaugă câte 4 ml ADS │
│ │la fiecare flacon cu │
│ │substanţă anti-TB. (40 │
│ │ABG) │
│ │2. Împarte câte 1 ml în │
│ │criotuburi sterile (pt │
│Reconstituire│10 ABG). Scrie data │
│SIRE │reconstituirii şi │
│ │expirării. Se pot │
│ │distribui cantităţi │
│ │diferite, în │
│ │funcţie de volumul de │
│ │luciu. │
│ │3. Congelare la - 20° C,│
│ │maxim 6 luni. │
│ │4. Decongelează pentru │
│ │folosire şi ce rămâne se│
│ │aruncă. │
│ │Nu se recongelează! │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Numerotează câte 5 │
│ │tuburi MGIT pentru │
│ │fiecare cultură şi │
│ │scrie: │
│ │CC, S, I, R, E. │
│Pregătire │Plasează tuburile în │
│ │această ordine în │
│ │suportul de incubare. │
│ │Adaugă aseptic câte 0,8 │
│ │ml supliment de creştere│
│ │pt SIRE (acelaşi lot cu │
│ │kitul anti-TB), la │
│ │fiecare tub. │
│ │Pipetează aseptic câte │
│ │100 μl din soluţiile │
│ │stoc de SIRE în tuburile│
│ │corespunzătoare. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │1. Prima zi de │
│ │pozitivare se consideră │
│ │ziua 0. Nu se face ABG │
│ │în ziua 0! │
│ │2. Se face ABG doar în │
│ │zilele 1-5 după │
│ │pozitivare. Cultura mai │
│Prepararea │veche de 5 │
│inoculului │zile se subcultivă în │
│ │alt tub. │
│ ├────────────────────────┤
│ │Ziua de Conduita │
│ │pozitivare │
│ ├────────────────────────┤
│ │0 Nu se face ABG │
│ ├────────────────────────┤
│ │1 şi 2 Se foloseşte │
│ │cultura ca atare, după │
│ │agitare = INOCUL │
│ ├────────────────────────┤
│ │3, 4, 5 După agitare se │
│ │diluează 1:5 │
│ │(1 ml cultură la 4 ml │
│ │SFS) = INOCUL │
│ ├────────────────────────┤
│ │6 sau mai Nu se face │
│ │ABG. Necesită subcultură│
│ │în tub nou pentru │
│ │mult cultură, pornind de│
│ │la cultura primară. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │● Pipetează aseptic 0,1 │
│ │ml din suspensia │
│ │bacteriană INOCUL în 10 │
│Prepară CC │ml SFS şi │
│ │rezultă suspensia pentru│
│ │control: 1:100. │
│ │Omogenizează atent. │
│ │● Însămânţează 0,5 ml │
│ │din diluţia 1:100 în CC.│
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Însămânţează în fiecare │
│Inocul tub │tub cu substanţe antiTB │
│SIRE │câte 0,5 ml (500 μl) din│
│ │suspensia bacteriană │
│ │preparată = INOCUL │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Tulpina M tuberculosis │
│CIC │ATCC 25177. Preparată │
│ │identic cu tulpinile │
│ │test │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Însămânţează 0,1 ml din │
│ │suspensia bacteriană în │
│ │placa cu agar sânge, │
│ │pune │
│ │în pungă de plastic şi │
│ │incubează la 35-37° C, │
│Control │timp de 48 ore. │
│puritate │Verifică placa cu agar │
│cultură │sânge după 48 ore de │
│ │incubare. Absenţa │
│ │contaminării │
│ │-corect, se lasă ABG în │
│ │continuare la incubat în│
│ │MGIT. │
│ │Dacă este contaminare, │
│ │se scoate ABG din │
│ │incubator şi se repetă │
│ │din │
│ │cultură pură. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │În suport cu 5 poziţii, │
│ │cu controlul în partea │
│Incubare │stângă. La introducerea │
│ │în │
│ │incubator se verifică │
│ │ordinea tuburilor pe │
│ │monitor. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│Citire │Automată │
├─────────────┼────────────────────────┤
│Interpretare │Automată │
└─────────────┴────────────────────────┘
Tabel IX. Diagrama de lucru pentru testarea pirazinamidei în sistem MGIT
┌─────────────┬────────────────────────┐
│Etape │MGIT PZM - din cultura │
│ │Pozitivă MGIT │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Adaugă 2,5 ml ADS la │
│ │flaconul cu PZM. (25 │
│ │ABG) │
│ │Împarte câte 0,5 ml în │
│Reconstituire│criotuburi sterile (pt 5│
│SIRE │ABG). Scrie data │
│ │reconstituirii şi data │
│ │expirării. │
│ │Congelare la - 20° C │
│ │maxim 6 luni. │
│ │Decongelează pentru │
│ │folosire şi ce rămâne se│
│ │aruncă! Nu se │
│ │recongelează. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Numerotează câte 2 │
│ │tuburi MGIT PZM pentru │
│ │fiecare cultură şi │
│ │scrie: CC, Z. │
│ │Plasează tuburile în │
│ │această ordine în │
│Pregătire │suportul de incubare cu │
│ │2 poziţii. │
│ │Adaugă aseptic câte 0,8 │
│ │ml supliment de creştere│
│ │pentru PZM (acelaşi lot │
│ │cu kitul PZM), la │
│ │fiecare tub. │
│ │Pipetează aseptic 100 μl│
│ │din soluţia │
│ │reconstituită de PZM în │
│ │tubul │
│ │corespunzător. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │1. Prima zi de │
│ │pozitivare se consideră │
│ │ziua 0. Nu se face ABG │
│ │în ziua 0. │
│ │2. Se face ABG doar în │
│ │zilele 1-5 după │
│ │pozitivare. Cultura mai │
│ │veche de │
│ │5 zile se subcultivă în │
│Prepararea │alt tub. │
│inoculului ├──────────┬─────────────┤
│ │Ziua de │Conduita │
│ │pozitivare│ │
│ ├──────────┼─────────────┤
│ │0 │Nu se face │
│ │ │ABG │
│ ├──────────┼─────────────┤
│ │ │Se foloseşte │
│ │ │cultura ca │
│ │1 şi 2 │atare, după │
│ │ │agitare. │
│ │ │Se foloseşte │
│ │ │ca inocul. │
│ ├──────────┼─────────────┤
│ │ │După agitare │
│ │ │se diluează │
│ │3,4,5 │1:5 (1 ml │
│ │ │cultură la │
│ │ │4 ml SFS). │
│ │ │Se foloseşte │
│ │ │ca inocul. │
│ ├──────────┼─────────────┤
│ │ │Nu se face │
│ │6 sau mai │ABG. Necesită│
│ │mult │subcultură în│
│ │ │tub nou. │
├─────────────┼──────────┴─────────────┤
│ │● Pipetează aseptic 0,5 │
│ │ml din suspensia │
│ │bacteriană INOCUL în 4,5│
│Prepară CC │ml SFS │
│ │şi rezultă suspensia │
│ │pentru control: diluţie │
│ │1:10. Omogenizează │
│ │atent. │
│ │● Însămânţează 0,5 ml │
│ │din diluţia 1:10 în CC. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Însămânţează în tubul cu│
│ │PZM 0,5 ml (500 │
│Inocul tubul │microlitri) din │
│PZM │suspensia │
│ │bacteriană preparată = │
│ │INOCUL │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Tulpina Mtuberculosis │
│CIC │ATCC 25177. Preparată │
│ │identic cu tulpinile │
│ │test. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Însămânţează 0,1 ml din │
│ │suspensia bacteriană în │
│ │placa cu geloză sânge, │
│ │pune în punga de plastic│
│ │şi incubează la 35-37° │
│Control │C, timp de 48 ore. │
│puritate │Verifică placa cu geloză│
│cultură │sânge după 48 ore de │
│ │incubare. Absenţa │
│ │contaminării-corect, se │
│ │lasă ABG în continuare │
│ │la incubat în MGIT. │
│ │Dacă este contaminare, │
│ │se scoate ABG din │
│ │incubator şi se repetă │
│ │din │
│ │cultură pură. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │În suport cu 2 poziţii, │
│Incubare │controlul în partea │
│ │stângă. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│Citire │Automată │
│Interpretare │Automată │
└─────────────┴────────────────────────┘
Tabel VII. Diluarea culturii pozitive pe MGIT între zilele 3-5 după pozitivare
┌───────────┬──────────────┬───────────┐
│Cultura │Diluarea │ │
│MGIT 3-5 │culturii │Însămânţare│
│zile │ │ │
├───────────┼──────────────┼───────────┤
│Diluţie 1:5│4 ml SFS + 1 │SIRE P test│
│ │ml cultură │ │
├───────────┼──────────────┼───────────┤
│Diluţie │4,5 ml SFS │0,5 ml CC- │
│1:10 │+0,5 ml Dil │PZM │
│ │1:5 │ │
├───────────┼──────────────┼───────────┤
│Diluţie │10 ml SFS + │0,5 ml CC- │
│1:100 │0,1 ml Dil 1:5│SIRE │
└───────────┴──────────────┴───────────┘
Antibiograma în sistem VersaTREK Kit-ul VersaTREK Myco este destinat testării sensibilităţii calitative in vitro a culturilor de M. tuberculosis la Rifampicină, Etambutol şi Izoniazidă, cu ajutorul instrumentului VersaTREK.^27 Se pot testa culturi obţinute pe mediul LJ sau culturi crescute în mediul lichid Middlebrook 7H9. Pentru ABG în sistemul VT se utilizează simultan un mediu de cultură lichid (VersaTREK Myco Broth), un factor de creştere (VersaTREK Myco GS), concentraţii precise de antibiotice anti-TB şi un sistem de detecţie care permite incubarea automatizată şi monitorizarea continuă a tuburilor inoculate, cu citire a consumului de oxigen la fiecare 24 de minute. La finalul perioadei de incubare specifice, stabilită pentru fiecare probă testată, în funcţie de timpul de pozitivare al flaconului martor (fără antibiotic), proba este evaluată manual ca fiind sensibilă sau rezistentă la substanţa anti-TB. Fiecărui flacon i se ataşează un conector VersaTREK, realizându-se astfel un sistem închis de monitorizare a flaconului cu instrumentul. O membrană hidrofobă din conectorul VersaTREK previne aerosolizarea. Informaţiile clinice sunt introduse în calculator, iar flacoanele sunt aşezate în instrument pentru incubare la temperatura de 35° C, în condiţii staţionare. În tabelele XI- XV sunt detaliate instrucţiunile de lucru pentru antibiograma în sistem VersaTREK. Tabel XI. Diagrama de lucru pentru testarea substanţelor anti-tuberculoase de linia întâi în sistem VersaTREK, din cultura pozitivă pe mediul solid
┌─────────────┬────────────────────────┐
│Etape │VersaTREK RIE - din │
│ │cultura pe mediul solid │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Adaugă câte 25 ml ADS la│
│ │fiecare flacon cu │
│ │substanţă antiTB (40 │
│ │ABG) │
│ │ │
│ │Păstrează maxim 4 │
│ │săptămâni la 2-8° C, sau│
│ │împarte câte 5,5 ml în │
│Reconstituire│tuburi │
│IRE │sterile (pt 10 ABG). │
│ │Scrie data │
│ │reconstituirii şi data │
│ │expirării. Se pot │
│ │distribui cantităţi │
│ │diferite, în funcţie de │
│ │volumul de lucru estimat│
│ │ │
│ │Congelare la - 20° C şi │
│ │foloseşte în maxim 3 │
│ │luni. Decongelează │
│ │pentru │
│ │folosire şi aruncă ce │
│ │rămâne. Nu se │
│ │recongelează! │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Numerotează câte 4 │
│ │tuburi VTM pentru │
│ │fiecare cultură, şi │
│ │scrie: │
│ │CC, R, I, E. │
│ │ │
│Pregătire │Plasează tuburile în │
│ │această ordine în │
│ │suport. │
│ │ │
│ │Adaugă aseptic câte 1 ml│
│ │supliment de creştere │
│ │(Myco GS) pentru RIE │
│ │(acelaşi lot cu kitul │
│ │anti-TB), la fiecare │
│ │tub, inclusiv CC. │
│ │ │
│ │Pipetează aseptic câte │
│ │0,5 ml din soluţiile │
│ │stoc de RIE în tuburile │
│ │test │
│ │şi 0,5 ml ADS în tubul │
│ │CC (controlul creşterii)│
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Pune 4 ml ADS în 1 tub │
│ │steril cu dop, care │
│ │conţine 8-10 perle de │
│ │sticlă │
│ │(2-3 mm). │
│ │Prelevează cu ansa din │
│ │cât mai multe colonii │
│ │tinere (nu mai veche de │
│ │14-21 zile), cultură │
│ │pură, evitând antrenarea│
│ │mediului şi descarcă în │
│ │ADS. │
│Prepararea │Agită 2-3 minute pentru │
│inoculului │ruperea corzilor. │
│bacterian │Suspensia să fie cu │
│ │turbiditate │
│ │mai mare de 1 McFarland.│
│ │Lasă să sedimenteze 20 │
│ │minute. │
│ │Transferă supernatantul │
│ │în alt tub steril cu dop│
│ │şi lasă alte 15 │
│ │minute să sedimenteze. │
│ │Transferă supernatantul │
│ │(să nu mai aibă corzi!) │
│ │în al treilea tub │
│ │steril cu dop. Suspensia│
│ │să fie mai intensă decât│
│ │1 McFarland. │
│ │Ajustează cu ADS la 1 │
│ │McFarland prin comparare│
│ │vizuală, dar nu mai │
│ │puţin de 1 McFarland 1 │
│ │(aproximativ 3x10^7 UFC/│
│ │ml), │
│ │Diluează 1:10 din │
│ │suspensia etalonată: 9 │
│ │ml ADS+ 1 ml suspensie │
│ │etalonată) = INOCULUL. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │● Însămânţează 0,5 ml │
│Inoculare │din diluţia 1:10 în │
│Control │tubul marcat CC. │
│creştere │ │
│ │ │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Însămânţează în fiecare │
│ │tub cu substanţe anti-TB│
│ │câte 0,5 ml (500 │
│Inoculare │microlitri) din │
│tuburi RIE │suspensia bacteriană │
│ │preparată: INOCUL = │
│ │DILUŢIE 1:10 din │
│ │suspensia 1 McFarland. │
│ │Amestecare prin │
│ │inversarea tubului de │
│ │3-5 ori. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Tulpina M tuberculosis │
│CIC │ATCC 25177. Preparată │
│ │identic cu tulpinile │
│ │test. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Însămânţează 0,1 ml din │
│ │suspensia bacteriană în │
│ │placă cu geloză sânge, │
│ │pune în pungă de plastic│
│ │şi incubează la 35-37° │
│Control │C, timp de 48 ore. │
│puritate │Verifică placa cu geloză│
│cultură │sânge după 48 ore de │
│ │incubare. Absenţa │
│ │contaminării-corect, se │
│ │lasă ABG în continuare │
│ │la incubat în VT. │
│ │Dacă este contaminare, │
│ │se scoate ABG din │
│ │incubator şi se repetă │
│ │din │
│ │cultură pură. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │În sertarele sistemului,│
│ │după montarea │
│Incubare │conectorului la fiecare │
│ │flacon. │
│ │Tuburile nu se mai │
│ │inversează după montarea│
│ │conectorului! │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Automată, la fiecare 24 │
│ │minute. CC trebuie să │
│ │fie pozitiv între > 3 │
│ │zile, │
│ │dar < de 10 zile, cu │
│Citire │semnal pozitiv acustic │
│ │şi luminos. │
│ │După pozitivarea CC │
│ │testul mai durează 3 │
│ │zile - cu urmărire de │
│ │către │
│ │executant (vezi detalii │
│ │mai jos, la rezultate). │
│ │Consemnare în caietul de│
│ │lucru. │
├─────────────┼────────────────────────┤
│ │Rezistent: creştere pe │
│ │tub test în interval de │
│Interpretare │3 zile după CC, │
│ │Sensibil: fără creştere │
│ │pe tub test în interval │
│ │de 3 zile după CC. │
│ │Creşterea după 3 zile nu│
│ │indică rezistenţă. │
└─────────────┴────────────────────────┘
Dacă se doreşte efectuarea ABG în sistem VT din cultură din mediul solid sau din mediul lichid, pentru obţinerea culturii de testat se procedează astfel: ● Pune 4 ml ADS în 1 tub steril cu dop, care conţine 8-10 perle de sticlă (2-3 mm). ● Prelevează cu ansa din cât mai multe colonii, cultură pură, evitând antrenarea mediului şi descarcă în ADS. ● Agită 2-3 minute pentru ruperea corzilor. Suspensia să fie cu turbiditate mai mare de 1 McFarland: sau agită tubul cu cultura în VTM pe care doreşti să o testezi. ● Lasă să sedimenteze 20 minute. ● Transferă supernatantul în alt tub steril cu dop. ● Ajustează cu ADS la 1 McFarland prin comparare vizuală. ● Pipetează 0,5 ml suspensie în flacon VTM marcat şi 1 ml supliment GS. ● Montează conectorul şi incubează în sistem până la pozitivare. ● Efectuează ABG în interval de maxim 72 de ore de la pozitivare. ● Agită flaconul 1-2 minute, transferă 1 ml din cultură în tub care conţine 9 ml ADS: diluţie 1:10 = INOCUL. ● Pipetează 0,5 ml din inocul la tuburile pregătite ca mai sus (CC, RIE) Pentru măsurarea tuturor cantităţilor se folosesc pipete calibrate. Se lucrează în condiţii de asigurare a protecţiei personalului şi mediului (CPM, mască, halat de protecţie, mănuşi). Dizolvarea substanţelor antiTB şi concentraţiile rezultate este prezentată în tabelul XI. Tabel VIIIII. Dizolvarea substanţelor antiTB şi concentraţiile rezultate
┌──────────┬───────────┬────────────┬─────────┬──────┐
│Conc. │ │ │ │Număr │
│finală a │ │ │Cantitate│teste/│
│substanţei│ADS pentru │Concentraţie│introdusă│flacon│
│în │dizolvare/ │după │în │(x2= │
│flaconul │rehidratare│rehidratare │flacon │nr │
│VTM │ │ │VTM │teste/│
│ │ │ │ │chit) │
├──────────┼───────────┼────────────┼─────────┼──────┤
│RMP 1 μg/ │ │30 μg/ml │ │50 │
│ml │25 ml │ │0,5 ml │ │
├──────────┤ ├────────────┤ ├──────┤
│INH 0,4 μg│ │12 μg/ml │ │40 │
│/ml │ │ │ │ │
├──────────┼───────────┼────────────┼─────────┼──────┤
│EMB 8 μg/ │ │240 μg/ml │ │30 │
│ml │ │ │ │ │
└──────────┴───────────┴────────────┴─────────┴──────┘
Notă: INH este substanţa cu rol limitativ. Chiar dacă mai sunt disponibile celelalte substanţe dizolvate din acelaşi lot, ele se vor debarasa. Nu se amestecă substanţe din loturi diferite. Tabel IXII. Adăugarea reactivilor şi a substanţelor de inoculare la flacoanele de testare
┌───────────┬───────┬─────────┬────────┐
│VTM │Volum │Volum de │Diluţie │
│etichetat, │de GS │substanţă│1:10 │
│numerotat │de │antiTB │din │
│ │pipetat│de │cultură,│
│ │ │pipetat │INOCUL │
├───────────┼───────┼─────────┼────────┤
│1 μg/ml │1 ml │0,5 ml │0,5 ml │
│Rifampicină│ │RMP │ │
├───────────┼───────┼─────────┼────────┤
│0,4 μg/ml │1 ml │0,5 ml │0,5 ml │
│Izoniazidă │ │INH │ │
├───────────┼───────┼─────────┼────────┤
│5 μg/ml │1 ml │0,5 ml │0,5 ml │
│Etambutol │ │EMB │ │
├───────────┼───────┼─────────┼────────┤
│Control │1 ml │0,5 ml │0,5 ml │
│creştere │ │ADS │ │
└───────────┴───────┴─────────┴────────┘
Introducerea flacoanelor în sistem: ● Scrie pe fiecare flacon numărul de identificare şi substanţa anti-TB. ● Formatul pentru numărul de acces este "Acces" XY, unde "Acces" va fi echivalent cu numărul de accesări pentru o cultură; X este codul substanţei (R, I, E), iar Y este concentraţia sa. Exemplu:
┌─────────────────┬────────────────────┐
│ │Număr de acces = │
│Control creştere │1234 CC │
│Rifampicină 1,0 │Număr de acces = │
│μg/ml │1234 R1 │
│Izoniazidă 0,4 μg│Număr de acces = │
│/ml │1234 IO.4 │
│Etambutol 8 μg/ml│Număr de acces = │
│ │1234 E8 │
└─────────────────┴────────────────────┘
● Plasează pe rând flacoanele de cultură cu conectorul VersaTREK în instrument. ● Creşterea va fi semnalată de instrument. Momentul acesteia poate fi aflat prin urmărirea graficului cu rezultatul testării. Rezultate ● Testul trebuie finalizat în maxim 13 zile, în funcţie de flaconul de control. ● După ce CC se pozitivează, urmăreşte pe graficul de la flacoanele test corespunzătoare tulpinii, timpul scurs până la pozitivarea lor. Scrie şi în caietul de lucru. ● După trei zile suplimentare de incubaţie, rotunjit la cel mai apropiat număr întreg, ulterior pozitivării CC, caută şi înregistrează rezultatele celorlalte flacoane corespunzătoare culturii. Sensibil: cultura pură într-un flacon care conţine substanţă anti-TB, fără semnal pozitiv în intervalul de 3 zile după pozitivarea CC este considerată sensibilă la concentraţia de substanţă testată. Rezistent: cultura pură într-un flacon care conţine substanţă anti-TB, este considerată rezistentă la acea concentraţie de substanţă testată atunci când timpul până la semnal pozitiv este egal, sau în intervalul de trei zile (rotunjit până la cel mai apropiat număr întreg) de timpul până la pozitivare al CC. În Tabelul XIII este prezentat un exemplu de evaluare şi interpretare a rezultatelor ABG TREK, cu identificarea erorilor posibile şi acţiunilor corective. Flacoanele care au generat semnale pozitive trebuie confirmate cu frotiu ZN. Dacă se identifică organisme non-BAAR, se va efectua o subcultură pe o placă cu mediul geloză sânge, care se va incuba pentru cel puţin 18 ore într-un incubator obişnuit la temperatura de 35-37°C, pentru a verifica puritatea izolatului. Tabel X. Observaţii asupra testării şi evaluarea testării
┌──────────┬───────────┬─────────────┬────────────┐
│Flacon │Rezultat │Cauze │Acţiune │
│test │obţinut │posibile │ │
├──────────┼───────────┼─────────────┼────────────┤
│ │ │Contaminare │ │
│ │< 3 zile de│sau inocul │REPETĂ │
│Control CC│la │prea │TESTUL │
│ │însămânţare│bogat; │din cultură │
│ │ │verifică │pură │
│ │ │puritatea │ │
│ │ │plăcilor şi │ │
│ │ │graficele de │ │
│ │ │creştere │ │
├──────────┼───────────┼─────────────┼────────────┤
│ │> 10 zile │Organism │REPETĂ │
│Control CC│de la │neviabil; │TESTUL, │
│ │însămânţare│inocul │cu atenţie │
│ │ │prea slab │la │
│ │ │ │realizarea │
│ │ │ │inocului │
├──────────┼───────────┼─────────────┼────────────┤
│ │Creştere │ │ │
│ │detectată │ │TEST VALID- │
│Control CC│în interval│ │verifică │
│ │între 3 şi │ │flacoanele │
│ │10 zile │ │test │
│ │după │ │ │
│ │inoculare │ │ │
├──────────┼───────────┼─────────────┼────────────┤
│ │Nu s-a │ │ │
│ │observat │ │ │
│ │nici un │ │ │
│ │contaminant│ │ │
│ │pe placa cu│ │Test valid │
│ │geloză │Cultura nu a │ │
│Verificare│sânge în │fost pură │ │
│puritate │intervalul │ │ │
│ │de 18 ore │ │ │
│ │Frotiu ZN: │ │ │
│ │doar BAAR │ │REPETAŢI │
│ │Nu s-a │ │TESTUL │
│ │observat │Este prezentă│pentru │
│ │nici o │mai mult de o│a verifica │
│ │variaţie │specie de │rezultatele;│
│ │colonială │Mycobacterium│anunţaţi │
│ │pe LJ │ │medicul că │
│ │ │ │rezultatul │
│ │Variaţie a │ │nu se poate │
│ │morfologiei│ │finaliza. │
│ │coloniilor │ │ │
│ │pe LJ │ │ │
│ │ │ │ │
│ │ │ │ │
└──────────┴───────────┴─────────────┴────────────┘
Întotdeauna revedeţi graficul corespunzător fiecărei culturi pure înainte de a raporta un rezultat. Citiţi Manualul de Operare VersaTREK pentru detalii legate de analiza graficelor. Verificaţi rezultatele subculturilor pe mediu LJ pentru a confirma prezenţa unei singure specii de Mycobacterium. Se testează exclusiv complexul M. tuberculosis. Tabel XI. Exemplu de rezultate pentru orientarea interpretării rezultatelor ABG VersaTREK
┌────────────┬────────┬────────────────────────────────┐
│ │Control │Substanţa antiTB │
│ │creştere├──────────┬───────────┬─────────┤
│ │ │Izoniazidă│Rifampicină│Etambutol│
├────────────┼────────┼──────────┼───────────┼─────────┤
│Concentraţie│0 │0,4 μg/ml │1,0 μg/ml │8 μg/ml │
│substanţă │ │ │ │ │
├────────────┼────────┼──────────┼───────────┼─────────┤
│Zile până la│6 │12 │6 │10 │
│semnalul │ │fără │ │fără │
│pozitiv │ │creştere │ │creştere │
│ │ │ │ │ │
├────────────┼────────┼──────────┼───────────┼─────────┤
│Interpretare│--- │Sensibil │Rezistent │Sensibil │
└────────────┴────────┴──────────┴───────────┴─────────┘
Comentarii la exemplul dat: Termenul de încheiere a testării este de 9 zile, raportat la CC care a generat semnalul pozitiv după 6 zile (timpul de Control pentru detecţie + 3 zile). Orice creştere observată după perioada de testare de 9 zile trebuie ignorată deoarece aceasta nu reprezintă un indicator al rezistenţei. Remarci ale producătorului Kit-ul pentru ABG VTM nu ar trebui să fie utilizat cu izolate obţinute direct din flacoanele cu specimene pozitive (flacoane primare). Producătorul este responsabil pentru autorizarea componentelor sistemului. Testarea fiecărui antibiotic din kit se va realiza numai cu loturi de mediu VersaTREK Myco şi VersaTREK Myco GS iar activitatea fiecărei substanţe va fi evaluată cantitativ. În Certificatul de analiză al produsului este menţionat un interval pentru limitele de activitate pentru fiecare substanţă antiTB. Producătorul va aproba şi furniza loturi de mediu VersaTREK Myco şi VersaTREK Myco GS care urmează să fie utilizate împreună cu fiecare lot al kit-ului pentru ABG Myco VersaTREK iar utilizatorul va folosi aceste loturi la efectuarea testării în laborator. Utilizatorul va verifica dacă loturile de mediu VersaTREK Myco şi VersaTREK Myco GS au fost aprobate pentru a fi utilizate împreună cu kit-ul de ABG Myco VersaTREK înainte de începerea testării. Loturile aprobate sunt enumerate în Certificatul de analiză pentru fiecare kit în parte. Examinaţi vizual toate flacoanele pentru a detecta contaminarea, fisuri sau alte semne de deteriorare. Nu folosiţi flacoane care par tulburi sau deteriorate. Inocularea se poate realiza prin deschiderea flacoanelor şi adăugarea probelor cu ajutorul pipetelor sterile. 5. Metode de biologie moleculară Pentru diagnosticul TB prin metode de biologie moleculară sunt disponibile mai multe metode bazate pe principii diferite, care pot identifica secvenţe genetice micobacteriene diverse. Dintre acestea, în laboratoarele reţelei naţionale de micobacteriologie se folosesc în condiţii de program de control al TB două sisteme. Unul bazat pe revers-hibridizare pe suport de nitroceluloză- LPA (GenoType-HAIN), celălalt bazat pc reacţie cantitativă de polimerizare în lanţ a ADN în timp real - RTPCR (GeneXpert MTB-Rif- Cepheid). Metodele moleculare de hibridizare pe suport permit detecţia rapidă a rezistenţei la RMP (singura sau în asociere cu INH) şi au fost aprobate de către OMS încă din anul 2008, când s-au emis ghiduri de introducere a lor la nivel naţional^32,33. Dezavantajul metodelor de hibridizare este că la INH rezistenţa poate fi subestimată, se detectează doar MDR, fiind necesară ABG convenţională pentru detecţia TB extrem de rezistentă (XDR), iar pentru monitorizarea tratamentului cazurilor MDR este necesară cultura şi ABG convenţională pentru aflarea spectrului complet de rezistenţă^33. Dacă se confirmă rezistenţa la RMP sau TB-MDR prin unul din testele de biologie moleculară folosit, se recomandă efectuarea imediată a testului GenoType MTBDRsl direct pentru identificarea rapidă a rezistenţei la aminoglicozide şi fluorochinolone.^33a Sistemul GenoType foloseşte un ansamblu de echipamente, specifice pentru fiecare etapă de lucru, cu chituri de reacţie diferite în funcţie de scopul testării: ● MTBDRplus este kitul de analiză genetică folosit pentru identificarea simultană a complexului M.tuberculosis şi evidenţierea mutaţiilor de rezistenţă la RMP şi INH, iar în cazul MTBDRsl, pentru identificarea cazurilor de TB-XDR prin evidenţierea mutaţiilor de rezistenţă la aminoglicozide şi fluorochinolone. ● Kiturile MTBC şi CM sunt folosite pentru identificarea speciilor de Mycobacterium în culturile pozitive pe mediul solid LJ şi mediul lichid în sistem MGIT. Deoarece producătorul are o politică de îmbunătăţire continuă a performanţelor metodelor, acesta include o fişă de avertizare în ambalajul care conţine reactivii dintr-o versiune nouă şi este necesar să se acorde atenţie acestor informaţii. În această fişă se face trimitere la instrucţiunea de lucru care va trebui folosită în noile condiţii. Instrucţiune de lucru pentru GenoType^34, 35 EXTRACŢIA ADN Pregătirea materialului în vederea extracţiei ADN-ului micobacterian ● produsul patologic (specimen clinic), în cazul MTBDRplus şi sl ● cultura în mediul lichid ● cultura în mediul solid. Produsul patologic Produsele patologice (spută, lavaj bronho-alveolar, aspirat bronşic) trebuie păstrate la frigider la 2-8°C până la maximum 4 zile. După decontaminarea prin metoda Petroff sau NALC-NaOH se resuspendă sedimentul în 1 ml SFS până la un volum total maxim de 1,5 ml. Sedimentul astfel prelucrat poate fi păstrat la congelator la -20°C până la -80°C maxim 5 zile. Pregătirea extracţiei ADN Din sedimentul rezultat după decontaminare: ● transferă 500 μl în microtuburi conice de 1,5 ml cu capac înfiletat ● centrifughează 15 min la 10 000 x g ● îndepărtează complet cu pipeta supernatantul şi resuspendă sedimentul în 100 μl tampon Lys (A-Lys) prin vortexare scurtă. ● colectează materialul infecţios rezultat în timpul lucrului în recipiente dedicate care conţin dezinfectant micobactericid. Din cultura în mediu lichid ● transferă 1000 μl din cultura în mediul lichid omogenizat în prealabil prin agitare uşoară, în microtuburi conice de 1,5 ml cu capac înfiletat ● centrifughează 15 min la 10 000 x g ● îndepărtează complet supernatantul şi resuspendă sedimentul în 100 microlitri Lys Buffer (A-Lys) prin vortexare scurtă. ● colectează materialul infecţios rezultat în timpul lucrului în recipiente dedicate care conţin dezinfectant micobactericid. Din cultura în mediu solid ● prepară suspensia bacteriană prin colectarea cu ansa bacteriologică de unică folosinţă din cât mai multe colonii. ● resuspendă coloniile direct în 100 μl Lys Buffer (A-Lys), în microtuburi conice de 1,5 ml cu capac înfiletat, urmat de vortexare scurtă. În cazul kitului Mycobacterium CM ver 2.0, pentru fiecare probă se amestecă cei 100 microlitri Lysis Buffer (A-Lys) cu câte 2 microlitri control intern (IC) prin vortexare. Extracţia propriu-zisă a ADN se continuă cu următoarele etape, indiferent de natura produsului prelucrat în vederea extracţiei, prin metodă chimică sau fizică (ultrasonicare). Extracţie chimică ● incubează 5 min probele la 95°C în baie de apă ● agită puţin în microcentrifugă (spin-down) ● adaugă 100 μl tampon pentru neutralizare (A-NB) şi vortexează minim 5 sec. ● apoi pune pentru 5 min la viteza maximă a microcentrifugii (14 500 rpm) ● 5 μl supernatant (soluţie ADN) se folosesc în reacţia PCR. Extracţie prin ultrasonicare ● Dacă ai resuspendat coloniile în apă PCR, incubează 25 minute în THERMOBLOCK pentru denaturare la 95°C. ● porneşte baia de ultrasonicare şi pune probele pentru 20 minute ● apoi pune pentru 5 min la viteza maximă a microcentrifugii (14 500 rpm) ● 5 μl supernatant (soluţie ADN) se folosesc în reacţia PCR. Pentru păstrarea de durată (indefinită) a ADN-ului extras, supernatantul rămas se transferă într-un tub nou, ADN free şi se congelează la -80°C. Alicotare dacă se consideră necesar. AMPLIFICAREA PCR ● În cazul kiturilor MTBDRplus, MTBDRsl, CM ver 2.0 şi MTBC se va prepara amestecul de nucleotide (mastermix) prin amestecarea Mixului de amplificare A cu B din componenta 2 a kitului, păstrată la -20°C. AM-A conţine tampon, nucleotide şi ADN polimeraza; AM-B conţine primeri biotinilaţi şi colorant. ● După reechilibrarea termică a soluţiilor în aria prePCR, se amestecă pentru fiecare probă de testat câte 10 μl AM-A cu 35 μl AM-B (conform tabelului XVI). Amestecul este instabil şi este necesară preparare de fiecare dată când se lucrează, într-o zonă fără sursă posibilă de ADN contaminant. Se verifică de fiecare dată etichetele de pe flacoanele cu reactivi pentru amplificare astfel încât ampliconul rezultat să corespundă cu stripul specific folosit pentru testul dorit. Conţinutul unui flacon AM-A cu al unui flacon AM-B în amestec este suficient pentru 26 probe. Calcul AM-A+AM-B = număr probe + număr controale + rezervă o probă Control negativ, pentru controlul extracţiei (ENC): 5 μl apă PCR (în loc de ADN) Control pozitiv MTBC sensibil (H37 Ra) sau MTBC cu rezistenţă cunoscută: 5 μl ADN Prepararea amestecului de amplificare (tabelul XVI): ● GenoType MTBDRplus ver 2.0 ● GenoType MTBDRsl ver 2.0 ● GenoType MTBC ver 1.x Tabel XVI. Cantităţile necesare pentru realizarea amestecului de nucleotide în funcţie de numărul de probe de testat
┌────────┬────┬─────┬────┬────────┬────────┐
│Pipeta │ │ │ │ │Pipeta │
│de │AM-A│NR. │AM-B│Pipeta │Mix │
│folosit │(μl)│PROBE│(μl)│AM-B │ │
│AM-A │ │ │ │ │ │
├────────┼────┼─────┼────┼────────┼────────┤
│10-100 │10 │1 │35 │10-100 │10-100 │
│ ├────┼─────┼────┼────────┼────────┤
│ │50 │5 │175 │ │ │
├────────┼────┼─────┼────┤ │ │
│ │100 │10 │350 │ │ │
│ ├────┼─────┼────┤ │ │
│ │120 │12 │420 │ │ │
│ ├────┼─────┼────┤ │ │
│100-1000│150 │15 │525 │100-1000│100-1000│
│ ├────┼─────┼────┤ │ │
│ │200 │20 │700 │ │ │
│ ├────┼─────┼────┤ │ │
│ │240 │24 │840 │ │ │
│ ├────┼─────┼────┤ │ │
│ │480 │48 │1680│ │ │
└────────┴────┴─────┴────┴────────┴────────┘
Mix: amestec de nucleotide. Polimeraza este inclusă în reactivi. În cazul kitului CM versiunea 2.0 (Common Mycobacterium-specii comune, altele decât TB) prepararea amestecului de nucleotide se face lot conform tabelului XVI. Adu amestecul pregătit în camera pre-PCR spre camera de amplificare în cutii separate pentru fiecare tip de test şi aici adaugi ADN-ul extras în microtuburi şi începi amplificarea. Conectează aparatul GTQ-Cycler 96 la reţeaua electrică. Aşează microtuburi le de 0,2 ml cu probe în locaşurile centrale. Închide capacul. Porneşte programul: ● MDR-DIR.scr pentru testul MTBDRplus direct şi pentru testul MTBDRsldirect ● MDR-CUL.scr pentru testul MTBDRplus indirect, MTBDRsl indirect MTBC sau CM La volum/probă se introduce valoarea de 50 μl. Selectează RUN PROGRAM. După terminarea ciclurilor scoate tuburile cu amplicon şi păstrează-le până a doua zi la frigiderul din camera de amplificare, în cutii separate, etichetate. HIBRIDIZAREA PROBELOR CU GT-BLOT 48 Reactivii au dopuri colorate diferit pentru prevenirea confuziilor. În tabelul XVII sunt prezentate codurile de culori ale reactivilor folosiţi pentru hibridizare. Tabel XIII. Codul de culori al reactivilor
┌───────────┬───────┬────────┬──────────┐
│Reactiv │Culoare│Reactiv │Culoare │
├───────────┼───────┼────────┼──────────┤
│HIBRIDIZANT│VERDE │CONJUGAT│PORTOCALIU│
├───────────┼───────┼────────┼──────────┤
│STRINGENT │ROŞU │APA │ALBASTRU │
├───────────┼───────┼────────┼──────────┤
│RINSE │ALB │SUBSTRAT│GALBEN │
└───────────┴───────┴────────┴──────────┘
1. Desfă tija de susţinere a tăviţei pentru stripuri (bandeletele de nitroceluloză) 2. Ridică senzorul central şi poziţionează-l în interiorul tăviţei 3. Apasă butonul START şi selectează GT FAST V2 4. Pipetează 20 μl sol DEN în fiecare godeu şi 20 μl amplicon, începând cu primul godeu de sus, amestecând uşor cu vârful pipetei, fără barbotare. 5. Pune reactivii HYB, STR şi RIN cu flaconul original în suportul aparatului şi imersează sonda corespunzătoare în soluţie. 6. Apasă butonul START şi selectează numărul de godeuri de lucru cu săgeata < > (rândul 1 sus, rândul 2 jos) 7. Dacă numărul de probe este mai mic de 22 şi senzorul nu are strip în godeul respectiv, aici trebuie puşi 5 μl soluţie HYB. Godeurile fără stripuri vor fi umplute cu apă de către sistem. 8. Pune ADS în flaconul cu capac albastru. 9. START. Închide capacul protector cu atenţie. Se porneşte automat pipetarea soluţiei HYB. 10. Când pe ecran apare "Add amplicon" ridică capacul, imersează cu pensa stripurile specifice fiecărui test în godeuri în sol HYB, fără contaminarea pensei. 11. Închide capacul şi dă START. 12. În partea stângă jos a GT Blot apare cu led verde temperatura de lucru setată şi cu led roşu temperatura realizată. 13. Introdu sonda corespunzătoare în flaconul cu soluţia STR preîncălzită la 37°C în ultimele 10 minute de HYBRIDIZATION. 14. Prepară amestecul de CON-C cu CON-D (amestec instabil, de preparat proaspăt de fiecare dată) şi SUB-C cu SUB-D (stabil 4 săptămâni la temperatura camerei, protejat de lumină). Calcularea volumului de reactivi se face conform tabelului XVIII: Tabel XVIII. Calcularea volumului de reactivi necesari în funcţie de numărul probelor
┌─────┬────────┬─────┬─────┬─────┬─────┐
│Nr. │Plus │ │ │ │ │
│probe│necesar │CON-D│CON-C│SUB-D│SUB-C│
│ │de │ml │Ml │ml │μl │
│ │reactivi│ │ │ │ │
├─────┼────────┼─────┼─────┼─────┼─────┤
│1 │ │1 │10 │1 │10 │
├─────┼────────┼─────┼─────┼─────┼─────┤
│<10 │Calculat│ │ │ │ │
│ │ca pt. │20 │200 │20 │200 │
│ │20 probe│ │ │ │ │
├─────┼────────┼─────┼─────┼─────┼─────┤
│10-15│+10 │25 │250 │25 │250 │
├─────┼────────┼─────┼─────┼─────┼─────┤
│16-25│+12 │37 │370 │37 │370 │
├─────┼────────┼─────┼─────┼─────┼─────┤
│26-35│+14 │49 │490 │49 │490 │
├─────┼────────┼─────┼─────┼─────┼─────┤
│36-39│+16 │55 │550 │55 │550 │
├─────┼────────┼─────┼─────┼─────┼─────┤
│40-43│+22 │65 │650 │65 │650 │
├─────┼────────┼─────┼─────┼─────┼─────┤
│44-48│+24 │72 │720 │72 │720 │
└─────┴────────┴─────┴─────┴─────┴─────┘
15. În ultima etapă de reacţie cu substratul, stinge lumina pentru a proteja godeurile de lucru. 16. După terminarea spălărilor scoate stripurile cu grijă, păstrând ordinea lor, usucă-le pe suport de hârtie absorbantă apoi lipeşte-le pe formularul pentru teste. Curăţarea aparatului 1. După ultima spălare, scoate sondele din toate flacoanele de lucru şi spală în recipientul cu ADS caldă; după uscare aşează-le înapoi în flacoanele aparatului, marcate în prealabil. 2. Îndepărtează la deşeuri CON de lucru, spală flaconul aparatului cu ADS şi usucă. 3. SUB de lucru rămas se poate păstra până la 4 săptămâni într-un flacon cu pereţi opaci, la temperatura camerei în spaţiu întunecos. 4. Spală cu ADS flaconul aparatului, usucă şi aşează sonda în interior. La terminarea ciclurilor de spălare se poate începe o nouă serie de hibridizare, pentru alte probe. În cazul în care nu se doreşte o nouă hibridizare, aparatul se opreşte din butonul START/STOP de pe panoul din spate stânga. Cu ajutorul unei pensule se înlătură orice urmă de reactiv din godeurile de lucru ale aparatului şi ale tăviţei folosite. Scoate tăviţa din aparat şi pulverizeaz-o cu reactiv decontaminant LTK şi ADS. Un şir de godeuri al tăviţei se foloseşte de maxim două ori la hibridizare, de aceea trebuie marcat pe laterală fiecare folosire. Spălarea aparatului Programul de spălare se poate porni doar după parcurgerea tuturor etapelor de lucru, folosind ADS caldă în loc de reactivi şi scurtând diferitele etape, după cum urmează: ● În etapele cu încălzire, apasă pe tasta QUIT, întrerupe alarma sonoră apăsând pe tasta START de două ori. ● În etapele fără încălzire, apasă lung pe tasta săgeata dreapta. Control intern al GT Slot 48 (aparatul atenţionează necesitatea) Din 3 în 3 luni se derulează ciclul de control OQ. În panoul SETTINGS, apasă pe OPEN în "Cycler information", în "Cycler Management" apasă pe CYCLER TESTS şi pe ENGINE TEST până când apare OK. Disfuncţionalităţile aparatelor se consemnează în fişele tehnice şi se comunică reprezentantului furnizorului. EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR Pentru evaluarea şi interpretarea reacţiei, stripurile trebuie uscate şi fixate în poziţie corectă pe fişa de lucru. La fiecare probă se verifică: ● apartenenţa la Complexul M.tuberculosis (banda TUB pozitivă), ● martorul reacţiei de amplificare (AC) şi ● martorul reacţiei de conjugare (CC). Lipsa uneia dintre aceste benzi indică erori în cadrul procesului de amplificare, testul nu este validat şi se impune retestarea folosind altă probă. În cazul controlului negativ (ENC - extraction negativ control) pe strip trebuie să apară doar benzile CC şi AC. Prezenţa de benzi suplimentate semnalează contaminarea, iar rezultatele pentru pacienţi nu pot fi interpretate corect. Se analizează sursa contaminării şi se fac corecţiile necesare. Rezultate pentru GenoType MTBDRplus După ce testul a fost validat, urmează verificarea prezenţei benzilor de control pentru genele rpoβ, katG, inhA, a benzilor pentru tipurile sălbatice şi pentru mutaţii: ● locus control (rpoβ, katG, inhA) ● wild type WT (lipsa acestora semnifică deleţie sau mutaţie în secvenţa respectivă) ● mutaţii existente MUT atât la rpoβ (pentru RMP), cât şi la katG şi inhA (pentru INH). Locus control (rpoβ, katG, inhA) Prezenţa benzilor este obligatorie dacă zona TUB atestă prezenţa M. tuberculosis. În cazul unui rezultat pozitiv, semnalul acestor zone poate fi slab sau, în unele cazuri, inexistent. În cazuri rare, locusul katG poate lipsi complet (inclusiv banda Locus Control) semnificând rezistenţă la INH a tulpinii testate. Dacă benzile rpoβ şi/sau inhA nu sunt evidente, testul nu poate fi evaluat pentru aceste gene. Secvenţe tip sălbatic (wild type - WT) RMP Se iau în considerare doar benzile al căror semnal este la fel de puternic sau mai puternic decât semnalul din zona de control (AC). Sunt 8 secvenţe sălbatice notate de la WT1 până la WT8. Sondele rpoβ WT reprezintă o excepţie de la această schemă de evaluare. Un semnal mai slab decât zona (AC) în zona rpoβ WT8 trebuie considerat pozitiv dacă banda corespunzătoare mutaţiei rpoβ MUT3 nu este evidentă, (deci nu semnifică rezistenţă la RMP). INH Sunt luate în considerare doar benzile al căror semnal este la fel de puternic sau mai puternic decât semnalul exprimat în zona de control (AC). În zona katG există un singur WT, iar la inhA WT1 şi WT2. Rezistenţa de nivel înalt este indicată de mutaţiile în katG (codifică enzima activatoare: catalaza). Rezistenţa de nivel jos este indicată de mutaţiile în inhA (codifică enzima enoyl-ACP reductaza) şi regiunea promoter (gene reglatoare). Sonde de tip mutant Sondele tip mutant detectează cele mai frecvente mutaţii de rezistenţă. Sunt luate în considerare doar benzile al căror semnal este la fel de puternic sau mai puternic decât semnalul exprimat în zona AC. Comparativ cu alte sonde, semnalele pozitive pentru mutaţiile rpoβ MUT2A şi rpoβ MUT2B pot apărea mai slabe ca intensitate. Dacă banda rpoβ MUT3 este pozitivă, un semnal slab detectat în zona rpoβ WT8 trebuie considerat negativ (cu semnificaţie de rezistenţă la RMP). Variantele de rezultat la testul Genotype MTBDRplus: ● MTBC nedetectat - în cazul absenţei benzii TUB ● MTBC detectat cu rezultat invalid pentru mutaţii de rezistenţă la RMP şi/sau INH (absenţa benzilor locus/WT la rpoβ şi/sau inhA) ● MTBC detectat cu prezenţa benzilor TUB şi WT fără mutaţii; rezistenţe nedetectate. ● MTBC detectat cu prezenţa benzilor TUB cu absenţa WT şi prezenţa MUT la rpoβ şi katG sau inhA; rezistenţe detectate (MDR) ● MTBC detectat, cu test invalid pentru rpoβ, valid pentru katG şi inhA ● MTBC detectat, cu test valid pentru rpoβ şi invalid pentru inhA. Rezultate pentru GenoType MTBDRsl După ce testul a fost validat, urmează verificarea prezenţei benzilor de control pentru genele gyrA, gyrB, rrs şi eis, a benzilor pentru tipurile sălbatice şi pentru mutaţii: ● locus control (gyrA, gyrB, rrs şi eis) ● wild type WT (lipsa acestora semnifică modificări în secvenţa respectivă) ● mutaţiile MUT existente, la gvrA şi/sau gyr B (pentru fluoroquinolone), rrs (pentru aminoglicozide), eis (pentru kanamicină) Locus control (gyr A, gyr B, rrs şi eis) Prezenţa lor este obligatorie dacă zona TUB atestă prezenţa M. tuberculosis. În cazul unui rezultat pozitiv, semnalul acestor zone poate fi slab sau, în unele cazuri, inexistent. Secvenţe tip sălbatic (wild type - WT) Se iau în considerare doar benzile a căror intensitate este la fel de puternică sau mai puternică decât semnalul exprimat în zona de control pentru amplificare (AC). gyrA: 3 secvenţe notate de la WT1 la WT3. gyr B: 1 secvenţă notată WT1. rrs: 2 secvenţe WT1 şi WT2. eis: 3 secvenţe notate de la WT1 la WT3. Sonde tip mutant Sondele tip mutant detectează cele mai frecvente mutaţii de rezistenţă. Se iau în considerare doar benzile al căror semnal este la fel de puternic sau mai puternic decât semnalul exprimat în zona AC. Variantele de rezultat pentru testul Genotype MTBDRsl: ● MTBC nedetectat - în cazul absenţei benzii TUB ● MTBC detectat cu rezultat invalid pentru mutaţii de rezistenţă la Q şi/sau AG şi/sau K (absenţa benzilor locus/WT la gyr şi/sau rrs şi/sau eis) ● MTBC detectat cu prezenţa benzilor TUB şi WT fără mutaţii ● MTBC detectat cu prezenţa benzii TUB cu absenţa WT şi prezenţa MUT la gyrA şi/sau gyrB, la rrs şi/sau eis. ● MTBC detectat cu prezenţa benzilor TUB şi WT pentru gyrA, gyrB şi absenţa WT cu prezenţa MUT la rrs şi/sau eis ● MTBC detectat cu QrAGn - prezenţa benzilor TUB şi WT la rrs şi eis şi absenţa WT cu prezenţa MUT la gyrA şi/sau gyrB Rezultate pentru GenoType MTBC şi CM În cazul acestor teste de identificare a speciei de Mycobacterium se verifică: ● Prezenţa benzilor control de CC şi UC ● Prezenţa benzii de conjugare MTBC în cazul testului GenoType MTBC ● Prezenţa benzii de conjugare GC în cazul testului GenoType CM După identificarea benzilor de control se citeşte combinaţia benzilor de conjugare cu intensitatea cel puţin egală cu a benzii control UC, se notează pe fişele de lucru şi se compară cu tabelul conţinând combinaţiile de benzi pentru speciile identificate. (a se vedea imaginea asociată) Figura 2. Algoritmul pentru sistemul GenoType Pe parcursul efectuării testelor pot să apară probleme care pot afecta calitatea rezultatelor, de aceea trebuie cunoscute şi prevenite sau corectate, în funcţie de situaţie. (tabelul XIX) Tabel XIII. Probleme care pot să apară şi rezolvarea lor
┌───────────┬────────────┬──────────────────┬─────────────────┐
│Problema │Etapa de │Cauză posibilă │Rezolvarea │
│apărută │lucru │ │problemei │
├───────────┼────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │Stripuri acoperite│ │
│ │ │incomplet de │ │
│Colorare │ │soluţiile de │ │
│neomogenă a│hibridizare │reactivi în timpul│Repetă │
│stripurilor│ │etapelor │hibridizarea │
│ │ │de incubare. │ │
│ │ ├──────────────────┤ │
│ │ │Tăviţa de │ │
│ │ │hibridizare │ │
│ │ │incorect agitată. │ │
├───────────┼────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │Reactivii CON-C şi│ │
│Fondul │ │/sau SUB-C nu au │ │
│colorat │hibridizare │fost │ │
│puternic │ │diluaţi │Repetă │
│ │ │corespunzător. │hibridizarea │
│ │ ├──────────────────┤ │
│ │ │Etape de spălare │ │
│ │ │necorespunzătoare.│ │
│ │ ├──────────────────┤ │
│ │ │Soluţia de spălare│ │
│ │ │a fost prea rece. │ │
├───────────┼────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │Temperatura │ │
│ │ │camerei prea │ │
│Lipsă benzi│ │scăzută sau │ │
│sau benzi │ │reactivi │ │
│slabe │hibridizare │neechilibraţi │Repetă │
│(inclusiv │ │termic. │hibridizarea │
│CC) │ ├──────────────────┤ │
│ │ │Lipsa sau o │ │
│ │ │cantitatea prea │ │
│ │ │mică de │ │
│ │ │CON-C şi/sau │ │
│ │ │SUB-C. │ │
├───────────┼────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │Calitatea ADN-ului│ │
│ │extracţia │extras nu permite │Repetă extracţia.│
│ │ADN │o │ │
│Lipsa benzi│ │amplificare │ │
│sau benzi │ │eficientă. │ │
│slabe (cu ├────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│excepţia │ │Mixurile de │ │
│zonei CC) │preparare │amplificare (AM-A │ │
│ │mix │şi AM-B) │Prepară un nou │
│ │ │au fost inversate,│mix şi │
│ │ │ori adăugate în │repetă testul. │
│ │ │cantităţi greşite,│ │
│ │ │nu au fost agitate│ │
│ │ │corespunzător. │ │
│ ├────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │Temperatura de │Repetă │
│ │hibridizare │incubare prea │hibridizarea │
│ │ │ridicată. │ │
├───────────┼────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │Condiţii │ │
│ │etapa │necorespunzătoare │Solicită altă │
│ │preanalitică│pentru │probă şi │
│ │ │recoltarea, │repetă testarea │
│ │ │stocarea, │ │
│ │ │transportul sau │ │
│ │ │pregătirea probei.│ │
├───────────┼────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │Erori în timpul │ │
│ │ │extracţiei ADN. │ │
│ │extracţia ├──────────────────┤ │
│ │ADN │Contaminarea ADN │Repetă extracţia.│
│ │ │extras cu ADN │ │
│ │ │extras │ │
│ │ │sau amplificat │ │
│ │ │anterior. │ │
│ │ ├──────────────────┤ │
│ │ │Folosirea unor │ │
│ │ │culturi mixte. │ │
│ ├────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│Rezultate │ │Contaminarea │ │
│neaşteptate│ │reactivilor de │ │
│ │ │extracţie. │Repetă │
│ │ │În acest caz, │amplificarea │
│ │ │controlul negativ │folosind reactivi│
│ │ │(ENC) │proaspeţi. │
│ │ │arată benzi │ │
│ │amplificare │suplimentare în │ │
│ │ │afară de ├─────────────────┤
│ │ │benzile CC şi AC. │ │
│ │ │Temperatura de │ │
│ │ │incubare │ │
│ │ │necorespunzătoare.│ │
│ │ ├──────────────────┤Atenţie la │
│ │hibridizare │Hybridization │pipete! │
│ │ │Buffer şi/sau │ │
│ │ │Stringent │Repetă │
│ │ │Wash │hibridizarea │
│ │ │Soluţii │ │
│ │ │necorespunzător │ │
│ │ │preîncălzite │ │
│ │ │sau agitate. │ │
│ │ ├──────────────────┤ │
│ │ │Contaminarea │ │
│ │ │probelor alăturate│ │
│ │ │prin │ │
│ │ │stropirea cu │ │
│ │ │soluţia de │ │
│ │ │hibridizare. │ │
│ ├────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │În funcţie de │ │
│ │ │cantitatea ADN │Întrerupe │
│ │ │amplificată │incubarea │
│ │hibridizare │folosită în │substratului │
│ │ │condiţii specifice│îndată ce │
│ │ │de │benzile devin │
│ │ │reacţie, apare │evidente │
│ │ │colorare puternică│pentru prevenirea│
│ │ │şi │apariţiei │
│ │ │rapidă a benzilor.│benzilor de │
│ │ │ │cross-hibridizare│
│ │ │ │ │
├───────────┼────────────┼──────────────────┼─────────────────┤
│ │ │Culturi mixte de M│ │
│ │ │tuberculosis şi │ │
│Lipsă │ │specii NTM, zona │Reia cultura │
│semnal în │ │TUB rămâne cu │pentru a │
│zona │ │semnal │obţine cultură │
│TUB │ │slab/lipsă din │pură. │
│ │ │cauza competiţiei │ │
│ │ │dintre │ │
│ │ │diferitele specii │ │
│ │ │bacteriene. │ │
└───────────┴────────────┴──────────────────┴─────────────────┘
Pentru fiecare lot de reactivi recepţionaţi în laborator se verifică dacă producătorul a adus îmbunătăţiri (fişa de alertare este inclusă în cutia cu reactivi), etapele de lucru fiind obligatoriu adaptate recomandărilor din instrucţiunea de lucru actualizată de către producător. GeneXpert MTB-Rif GeneXpertMTB/Rif este un sistem genetic pentru detectarea simultană a MTB şi a rezistenţei la RMP (prin mutaţii în gena rpoβ) prin metoda de amplificare semi-cantitativă în lanţ în timp real (RT-PCR).^36 Este un sistem complet integrat, cu cartuşe de unică folosinţă în care proba pregătită în prealabil este introdusă şi procesată în aparat. Cartuşul conţine sisteme de control a procesării probei: ● SPC: (sample processing control), control pentru prelucrarea probei care verifică prelucrarea adecvată a ei şi monitorizează prezenţa inhibitorilor reacţiei de polimerizare în lanţ (PCR) ● PCC: (probe check control), verifică rehidratarea reactivilor, nivelul de umplere al cartuşului, integritatea probei şi stabilitatea colorantului. Primerii (secvenţe de ADN) conţinuţi amplifică porţiunea "core" de 81 perechi de baze a genei rpoβ. Testul are capacitatea să facă distincţie între secvenţele de tip sălbatic (fără mutaţii) şi secvenţele cu mutaţii din această regiune. Consideraţii generale ● Înainte de a începe folosirea echipamentului trebuie să te asiguri că ai citit instrucţiunile de lucru şi ai înţeles informaţiile oferite în timpul instruirii. ● Nu este permis lucrul fără instruire prealabilă. Se pot produce daune care conduc la pierderea garanţiei. ● Prelucrarea tuturor probelor clinice trebuie să se facă respectând standardele de biosiguranţă. ● Consideră toate sputele, inclusiv cartuşele folosite, ca potenţial infecţioase. ● Foloseşte echipament personal de protecţie (halat, mănuşi) când mânuieşti sputa sau reactivii. ● Spală mâinile cu grijă după mânuirea sputei sau reactivilor. ● Toate mesele trebuie decontaminate la sfârşitul lucrului sau după scurgerea sau prelingerea din cartuş cu dezinfectant tuberculicid (hipoclorit de sodiu 1% urmat de ştergere cu alcool 70%). ● Nu deschide capacul cartuşului decât pentru introducerea probei. ● Nu refolosi cartuşele. ● Îndepărtează cartuşele folosite conform procedurii de colectare a materialului infecţios. Echipament şi materiale ● Sistem GeneXpert Dx echipat cu GX2.1 software/computer/printer/cititor manual de cod de bare (Cepheid Inc, Sunnyvale, USA) (Cat Item N° GXIV-4N1-6). ● CPM (cabinet de protecţie microbiologică) de clasa II ● Kitul Xpert MTB/RIF conţine câte 10 cartuşe ambalate împreună: o Păstrează cartuşele şi reactivii Xpert MTB/RIF la 2-28°C. o Nu deschide cartuşele decât atunci când eşti pregătit să faci testul. o Foloseşte cartuşul în maxim 30 de minute după ce i-ai deschis capacul. o Cartuşele sunt stabile până la 7 zile după deschiderea pachetului (notează data deschiderii pe ambalaj) ● Reactivul furnizat în kit conţine câte 8 ml pentru fiecare cartuş. Soluţia este limpede dar poate fi de la incoloră până la galben auriu. ● Foloseşte marker permanent pentru numerotarea cartuşelor. ● Foloseşte pipete sterile ambalate individual pentru prelucrare. ● Încarcă cartuşul cu pipetă de unică folosinţă furnizată odată cu kitul, marcată pentru volumul minim de pipetat (2 ml). ● Sputa trebuie să fie recoltată în recipient steril cu capac înfiletat. ● Toate materialele folosite şi sputa rămasă se îndepărtează urmând procedura de îndepărtare a deşeurilor infecţioase. ● Trebuie planificată prelucrarea ţinând cont că pot rula la un moment dat maxim 4 probe, cu durata testului de 2 ore. ● Datele pacientului se introduc în fişa de lucru. Procedura de lucru a. Sputa expectorată ● Ia 1 ml spută din recipientul de colectare cu pipetă sterilă şi pune-l în tubul de lucru; după folosire pune-o în recipientul de colectare a materialului infecţios. ● Adaugă cu altă pipetă reactivul din kit în proporţie de 2:1 (2 ml reactive la 1 ml spută). Se pot prelucra 2-3 ml spută, dar trebuie să fie respectată proporţia reactiv: spută. ● Strânge bine dopul tubului de lucru (să nu se scurgă). ● Agită tubul prin inversare de 10-20 x. ● Incubează la temperatura camerei până la 15 minute. ● În perioada incubării agită cel puţin odată tubul, ca mai sus. ● La sfârşitul incubării sputa trebuie să fie lichefiată complet, fără fragmente sau filamente vizibile. ● Scrie pe cartuş, cu marker, numărul de registru (un cartuş pentru fiecare probă). ● Scrie la baza frontală a tubului sau pe lateral, dar niciodată pe capac sau peste codul de bare. b. Sediment (aspirat gastric, aspirat bronşic, lavaj bronşic, spută indusă) ● proba clinică trebuie centrifugată pentru concentrare, la 3000x g, 20 minute. ● Decantează supernatantul şi reţine 1 ml (sau 0,5 ml). ● Ia 1 ml din sediment cu pipetă sterilă şi pune-l în tubul de lucru; după folosire pune pipeta în recipientul de colectare a materialului infecţios ● Adaugă cu altă pipetă reactivul din kit în proporţie de 3:1 (3 ml reactiv la 1 ml sediment. Dacă se prelucrează 0,5 ml sediment, se adaugă 1,5 ml reactiv, dar trebuie să fie respectată proporţia dintre reactiv şi sediment. ● Strânge bine dopul tubului de lucru (să nu se scurgă) ● Agită tubul prin inversare de 10-20 x. ● Incubează la temperatura camerei până la 15 minute. ● În perioada incubării agită cel puţin odată tubul, ca mai sus. ● La sfârşitul incubării sputa trebuie să fie lichefiată complet, fără fragmente sau filamente vizibile ● Scrie pe cartuş, cu marker, numărul de registru (un cartuş pentru fiecare probă). ● Scrie la baza frontală a tubului sau pe lateral, dar niciodată pe capac sau peste codul de bare. Prepararea cartuşului Note: a. introdu cartuşul în aparat în maxim 30 de minute după deschiderea lui şi adăugarea probei. b. când mânuieşti cartuşul nu atinge niciodată partea din spate. Ţine-l din laterale. Procedura de lucru ● Foloseşte pipetă sterilă furnizată cu kitul, aspiră proba lichefiată astfel ca meniscul format să depăşească marcajul minim. Nu se procesează proba în continuare dacă volumul este insuficient - sub marcajul de pe pipetă! ● Evită atingerea pipetei sterile. Deschide ambalajul pipetei la extremitatea cu pară şi scoate atent pipeta. Păstrează ambalajul pipetei. ● Deschide capacul cartuşului şi transferă lent proba în cartuş prin orificiul de încărcare din colţul din dreapta, faţă. Minimizează riscul de formare de aerosoli prin pipetarea lentă. ● Pune pipeta cu atenţie în ambalajul de plastic şi descarc-o în recipientul de colectare a materialului infecţios. ● Închide ferm capacul cartuşului. ● Proba lichefiată rămasă după umplerea cartuşului poate fi păstrată până la 12 ore la 2-8°C, pentru repetarea testului, dacă se consideră necesar. Pentru aceasta trebuie să ne asigurăm că a fost prelucrată cantitate suficientă din proba primară, adică cel puţin 2 ml spută. ● Important: Asigură-te că introduci cartuşul în aparat în maxim 30 de minute după adăugarea probei şi că ai încărcat minim 2 ml de probă prelucrată. Pornirea testului Important: Înainte de începerea testului asigură-te că sistemul este conectat la o sursă de curent neîntreruptibilă (UPS). ● Porneşte instrumentul ● Porneşte computerul, cu parola "xxxx", în fereastra cphd. ● Dă dublu clic pe pictograma "GeneXpert Dx" de pe ecranul monitorului. ● În fereastra GeneXpert Dx dă clic pe "Create Test" şi apare fereastra de dialog "Scan Cartridge Barcode". Dă cancel sau ignoră introducerea manuală şi scanează codul de bare prin poziţionarea scanerului în zona centrală a acestuia. ● Scrie numărul probei în fereastra "Sample ID" şi asigură-te că este corect. ● Dă clic pe "Start test" ● Se aude un clinchet şi la unul dintre module apare lumină verde. Deschide uşiţa respectivă şi introdu cu grijă cartuşul. ● Închide ferm uşiţa modulului, încât să auzi un click. ● Lumina verde nu mai pâlpâie ci rămâne aprinsă atunci când începe testul. La terminarea testului lumina verde se stinge. ● Se introduc toate cartuşele urmând aceiaşi paşi. "Create test"......... Un test complet durează 1 oră şi 55 minute. Rezultatul este generat automat, la terminarea testului. ● Aşteaptă până când sistemul deblochează uşiţa la sfârşitul testului, deschide-o şi îndepărtează cartuşul folosit. ● Depune cartuşul în recipientul pentru colectarea materialului infecţios. ● Foloseşte formularul tipărit sau transcrie rezultatul în caietul de lucru pentru Xpert şi introdu rezultatul în buletinul de solicitare, semnează, parafează, datează. Controlul calităţii Fiecare cartuş are inclus un control pentru prelucrarea probei (Sample processing control -SPC) şi control pentru probă (Probe Check control - PCC) care ne asigură că proba a fost prelucrată corect. SPC = control pentru prelucrarea probei ● verifică prelucrarea adecvată a MTB. ● ar trebui să fie pozitiv pentru un produs negativ sau poate fi negativ sau pozitiv la un produs pozitiv. ● se consideră că testul de control al probei a trecut atunci când este validat criteriul de acceptare. Testul este "INVALID" dacă SPC nu este detectat în testul negativ. PCC = control pentru probă ● înainte de începerea reacţiei PCR sistemul măsoară semnalul fluorescent al probei pentru monitorizarea hidratării particulelor, umplerea tuburilor de reactivi, integritatea probei şi stabilitatea colorantului. ● Testul este trecut dacă întruneşte criteriile de acceptare. Erori ● MTB-NO RESULT ● SPC-NO RESULT ● PCC-NA (neaplicabil) Motive pentru repetarea probei Repetă testul folosind un cartuş nou dacă: ● rezultatul "INVALID" indică faptul că testul SPC de control pentru prelucrarea probei nu a fost trecut. ● Apare eroarea SPC când proba nu a fost prelucrată corect sau PCR a fost inhibată. ● "ERROR": mesaj care indică eşuarea controlului pentru probă (PCC) şi testul s-a întrerupt datorită umplerii necorespunzătoare a cartuşului, sau a fost detectată o problemă de integritate a reactivilor, sau limita de presiune a fost depăşită sau modulul GeneXpert a eşuat. ● "NO RESULT", lipsa unui rezultat, indică faptul că au fost colectate prea puţine informaţii. De exemplu, operatorul a oprit testul care era în desfăşurare. Interpretarea rezultatelor GeneXpert MTB/RIF ● Fiind un test bazat pe detectarea ADN-ului MTB se adresează doar cazurilor noi de TB. Trebuie să ne asigurăm că nu se prelucrează probe la monitorizarea tratamentului. ● Rezultatele sunt interpretate de sistemul GeneXpert Dx prin măsurarea semnalului fluorescent şi calculul algoritmilor care apar în fereastra "View Results". ● Cea mai mică valoare Ct (numărul ciclurilor de amplificare) la pornire reprezintă cea mai mare concentraţie de ADN a matricei; cea mai mare valoare a Ct reprezintă cea mai mică concentraţie de ADN a matricei. MTB DETECTED = Mycobacterium tuberculosis detectat ● Dacă este detectat ADN ţintă în probă, rezultatul MTB afişat va fi "High, Medium, Low sau Very Low", respectiv în cantitate mare, medie, mică sau foarte mică, depinzând de valoarea Ct a ţintei MTB prezentă în spută (tabel XX). Tabel XX. Valorile rangului Ct corespunzătoare rezultatelor MTB afişate
┌──────────────────────────┬───────────┐
│Rezultat MTB │Rangul Ct │
├──────────────────────────┼───────────┤
│High = mare │<16 │
├──────────────────────────┼───────────┤
│Medium = mediu │16-22 │
├──────────────────────────┼───────────┤
│Low = mic │22-28 │
├──────────────────────────┼───────────┤
│Very Low = foarte mic │>28 │
└──────────────────────────┴───────────┘
● Când MTB este detectat, rezultatele pentru RMP pot fi: o Rezistenţă la RMP DETECTATĂ (Rifampicin resistance DETECTED): a fost detectată mutaţie în gena rpoβ în intervalul valid de variaţie a Ct. o Rezistenţă la RMP NEDETECTATĂ (Rifampicin resistance NOT DETECTED): nu a fost detectată nici o mutaţie în gena rpoβ. o Rezistenţă la RMP INDETERMINATĂ (Rifampicin resistance INDETERMINATE): concentraţia MTB a fost foarte mică şi rezistenţa nu poate fi detectată. MTB NEDETECTAT (MTB NOT DETECTED) ● Ţinta ADN - MTB nu este detectată. SPC are criterii de acceptare. o MTB NOT DETECTED - MTB NEDETECTAT - ţinta AND- MTB nu este detectată. o SPC - testul de verificare trecut dar variaţia Ct şi valoarea finală sunt sub nivelul minim stabilit. o PCC - testul de verificare trecut: toate rezultatele verificate au fost acceptate. RIF NEDETECTAT (RIF NOT DETECTED) ● Ţinta ADN pentru Rif (RMP) nu este detectată, SPC - are criteriu de acceptare. o Rifampicină nedetectată (RIF NOT DETECTED) - ţinta ADN pentru RMP nu este detectată. o SPC - test trecut dar variaţia Ct şi valoarea finală sunt sub nivelul minim stabilit. o PCC - testul de verificare trecut: toate rezultatele verificate au fost acceptate. INVALID - nu se poate lua în considerare ● Prezenţa sau absenţa MTB nu poate fi determinată. Repetă testul din alt produs. SPC nu întruneşte criteriile de acceptare, proba nu a fost prelucrată corect sau PCR este inhibată. o MTB INVALID - prezenţa sau absenţa ADN - MTB nu poate fi determinată, o SPC - nu a trecut testul, a eşuat; rezultatul ţintei pentru MTB este negativ şi Ct pentru SPC nu se situează în limitele de acceptare. o PCC - a trecut testul; toate verificările pentru probă au trecut testul. Limitările testului de diagnostic in vitro ● Testele se efectuează folosind această procedură şi instrucţiunile din kituri. ● Calitatea rezultatelor depinde de recoltarea corectă a sputei, mânuirea şi păstrarea ei. ● Rezultatul pozitiv nu indică neapărat MT viabil. Este doar un test prezumptiv pentru prezenţa MT şi a rezistenţei la RMP. ● Rezultatul poate fi afectat de terapie anti-TB precedentă, sau terapie cu efect asupra micobacteriilor. (a se vedea imaginea asociată) Figura 3. Algoritmul pentru sistemul GeneXpert MTB-Rif 6. Asigurarea calităţii Asigurarea calităţii este un proces continuu care are ca scop îmbunătăţirea şi menţinerea performanţelor laboratorului^15. Componentele unui program de asigurare a calităţii sunt: ● controlul intern al calităţii ● control extern al calităţii, comparare între laboratoare ● îmbunătăţirea calităţii Existenţa unui sistem de asigurare a calităţii garantează că rezultatele oferite de laborator sunt exacte, de încredere şi reproductibile. Laboratorul trebuie să monitorizeze toate activităţile şi să păstreze înregistrări referitoare la acestea. Controlul calităţii constituie parte integrată în activitatea laboratorului şi este în responsabilitatea tuturor celor care lucrează în laborator. Pentru aprecierea tendinţelor^37 în privinţa performanţelor laboratorului, acesta trebuie să-şi monitorizeze şi analizeze periodic indicatorii de calitate, cu referire la ţinta propusă. Un program de asigurare a calităţii nu se poate derula fără personal suficient numeric, instruit, interesat şi motivat, care foloseşte corect procedurile de lucru recomandate, care îşi recunoaşte greşelile şi acceptă să le corecteze, când activitatea din laborator se desfăşoară în atmosferă de calm şi bună-înţelegere, fără stres. În fiecare laborator trebuie să existe scrise şi accesibile toate tehnicile de lucru corespunzătoare nivelului de competenţă a laboratorului. Toate laboratoarele trebuie să respecte tehnicile de lucru recomandate şi să facă dovada participării la controlul extern al calităţii pentru toate tehnicile şi metodele folosite. ANEXA 1 Prepararea reactivilor 1. Metoda de decontaminare cu hidroxid de sodiu (metoda Petroff modificată) Materiale: ● dezinfectant tuberculicid: etanol 70% ● tuburi de 10 - 12 ml, 50 ml cu capac cu filet, în funcţie de dimensiunea cuvelor centrifugii ● soluţie sterilă de NaOH 4% ● soluţie sterilă de HCl 8% sau KH(2)PO(4) 15% ● balanţă analitică ● vortex ● stative adecvate pentru tuburi ● centrifugă cu răcire, cu rotor pentru tuburi de 10 - 12 ml, sau 50 ml ● ceas de laborator ● pipete din material plastic, de unică folosinţă, sterile, ambalate individual, de 3 ml ● plită pentru uscat lame ● etichete pentru tuburi ● marker permanent ● lame pentru microscop 26 x 76 x 1 mm, cu un capăt mătuit, curate şi degresate Reactivi^3: ● Soluţie de NaOH 4%. Se dizolvă 4 g NaOH în 100 ml apă distilată şi se sterilizează prin autoclavare timp de 30 minute la 121°C. ● Soluţie de HCl 8%. Se diluează 8 ml de acid clorhidric în 92 ml apă distilată (prin turnarea acidului în apă şi nu invers!). Dacă se foloseşte metoda cu centrifugare, se poate neutraliza cu fosfat monopotasic [KH(2)PO(4)] în soluţie 15% (15 g KH(2)PO(4) în 85 ml apă distilată). ● Soluţie de albastru de bromtimol (indicator). Albastrul de bromtimol se prepară adăugând 0,1 g albastru de bromtimol la 3,2 ml sol. NaOH N/2 şi 250 ml apă distilată. Soluţia de NaOH N/2 se prepară amestecând 1 ml NaOH 4% în 19 ml apă distilată. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 30 minute. Se păstrează în sticlă brună. Culoarea albastră indică pH alcalin culoarea galbenă indică pH acid, iar o culoare galben-verzuie indică pH neutru. Soluţia de albastru de bromtimol poate fi înlocuită cu soluţie de roşu fenol (8 mg roşu de fenol se dizolvă în 20 ml NaOH 4% şi se adaugă apă distilată până la 1000 ml). Culoarea roşie indică pH alcalin; culoarea galbenă persistentă indică pH acid. Dacă există centrifugă conformă, cu cuve pentru tuburi Falcon de 50 ml se recomandă utilizarea acestora cu folosirea întregii probe clinice colectate şi, implicit, recuperarea unei cantităţi mai mari de bacili. 2. Metoda de decontaminare NALC - NaOH^20 Materiale ● dezinfectant tuberculicid: etanol 70% ● tuburi Falcon de 50 ml, gradate, cu capac cu filet, sterile ● N-acetil L-cisteină (NALC), pulbere ● soluţie NaOH 4% ● citrat de sodiu soluţie 2,9% ● tampon fosfat, pH 6,8 ● balanţă analitică ● vortex ● stative pentru tuburi de 10-12 ml, 50 ml ● centrifugă cu răcire şi rotor pentru tuburi de 10-12 ml sau 50 ml ● ceas de laborator ● pipete de plastic, de unică folosinţă, sterile, ambalate individual, de 3 ml ● pH metru ● plită pentru uscat lame ● etichete pentru tuburi ● marker permanent ● agitator plan Soluţie de NaOH 4%. ● Dizolvă 4 g NaOH în 100 ml ADS şi sterilizează prin autoclavare timp de 20 minute la 115°C. Etichetează. Soluţie citrat de sodiu 2,9% ● Dizolvă 2,9 g citrat de sodiu hidratat [2H(2)0] în 100 ml ADS. Sterilizează prin autoclavare timp de 20 minute la 115°C. Etichetează. Pentru lucru, cele două soluţii se amestecă în cantităţi egale şi se adaugă în ziua de lucru cantitatea necesară de NALC pulbere, în funcţie de numărul de produse de prelucrat, astfel:
┌───────────────┬─────┬───────────┬────┐
│Volum de lucru │NaOH │Citrat de │NALC│
│final │4% │sodiu │(g) │
│ │ │2,9 % │ │
├───────────────┼─────┼───────────┼────┤
│50 ml │25 ml│25 ml │0,25│
├───────────────┼─────┼───────────┼────┤
│100 ml │50 ml│50 ml │0,5 │
├───────────────┼─────┼───────────┼────┤
│200 ml │100 │100 ml │1 │
│ │ml │ │ │
└───────────────┴─────┴───────────┴────┘
NALC în soluţie este instabil şi trebuie folosit în ziua preparării. Cantitatea nefolosită se îndepărtează. Bibliografie 1. Mycobacteriology laboratory manual. GLI. First edition, April 2014, StopTB Partnership. 2. European Centre for Disease Prevention and Control. Mastering the basics of TB control: Development of a handbook on TB diagnostic methods. Stockholm: ECDC; 2011. 2a. I Solovic, J Jonsson, M Korzeniewska- Kosela, D I Chiotan, A Pace-Asciak, E Slump, R Rumetshofer, I Abubakar, S Kos, P Svetina-Sorli, W Haas, T Bauer, A Sandgren, M J van der Werf s inwww.eurosurveillance.org diagnosing extrapulmonary tuberculosis i 2b. European Centre for Disease Prevention and Control. Handbook on TB laboratory diagnostic methods for the European Union. Stockholm: ECDC; 2015. 3. Diaconescu C, Homorodean D, Popa MI, Banica D, coord. Bercea O - Ghid de diagnostic bacteriologic al tuberculozei, Bucureşti, 1998. 4. Daniela Homorodean, Olga Moldovan, Daniela Diculencu, Graţiela Chiriac, Ionela A Muntean, revizie tehnică de specialitate IM Popa. Îndrumar de tehnici de laborator de bacteriologie BK- Bucureşti 2005, ISBN 973-0-04173-3 5. Ghid metodologic de implementare a programului naţional de prevenire, supraveghere şi control al tuberculozei. Bucureşti, 2015. ISBN 978-973-139-325-4. 5a. Meenu Singh, N.V. Ahsan Moosa, Lata Kumar and Meera Sharma. Indian Pediatrics 2000;37:947-951 6. Lumb R., Van Deun A., Bastian I, Fitz-Gerald M. Laboratory Diagnosis of Tuberculosis by Sputum Microscopy. The handbook. Global edition. 2012 7. TB diagnostics and laboratory straeghtening - WHO policy, 2007. Proposed reduction of number of smears for the diagnosis of pulmonary TB: background document. www.who.int 8. Ghid de reglementări pentru Transportul Substanţelor Infecţioase 2011 - 2012. WHO/HSE/IHR/2010.8 9. IATA Packing Instruction 650 - Biological Substances, Category B (http://www.iata.Org/NR/rdonlyres/9C7E382B-2536-47CE-84B4-9A883ECFA040/0/Guidance_Doc62DGR_50.pdf) 10. DOT 49 CFR Parts 171-180 (http://ecfr.gpoaccess.gov/cgi/t/text/text-idx?c=ecfr&tpl=/ecfrbrowse/Title49/49cfrv2_02.tpl) 11. DOT Pipeline and Hazardous Materials Safety Administration: How to transport infectious substances (https://hazmatonline.phmsa.dot.gov/services/publication_documents/Transporting.Infectious.Substances.Safely.pdf) 12. Vessel Sanitation Program Operations Manual 2005 (http://www.cdc.gov/nceh/vsp/operationsmanual/OPSManual2005.pdf) 13. I.N. de Kantor, S. Jae Kim, T. Frieden, A. Laszlo, F. Luelmo, P-Y. Norval, H. Rieder, P. Valenzuela, K. Weyer. Laboratory services in tuberculosis control. Organization and management. Part I. WHO/TB/98.258 14. Tuberculosis laboratory biosafety manual. WHO/HTM/TB/2012.11 15. SR EN ISO 15189. Laboratoare medicale - cerinţe pentru calitate şi competenţă. ASRO. 16. De Kantor IN, Kim SJ, Frieden T, Laszlo A, Luelmo F, Norval P-Y, Rieder H, Valenzuela P, Weyer K. Laboratory services in tuberculosis control, part II: Microscopy, WHO/TB/98.258, 1998 17. WHO. Policy statement on fluorescent light-emitting diode (LED) microscopy for diagnosis of tuberculosis. Geneva, 2010.http://www.who.int/tb/laboratory/policy_statements/en/ 18. Vincent Levy-Frebault V, Portaels F, Proposed minimal standards for the genus Mycobacterium and for description of new slowly growing Mycobacterium species, Int. j. of Systematic Bacteriology, Apr, 1992, 315-323 19. Kent PT, Kubica GP. Public Health Mycobacteriology. A guide for the level III laboratory, 1985, Atlanta Georgia. 20. Cornaglia G., Courcol R., Herrmann J-L. et al. European Manual of Clinical Microbiology. ESCMID, ed 1, 2012. 21. Daniela Homorodean, Olga Moldovan, Mihaela Stoian, Mihaela Brojboiu, Graţiela Chiriac, Ionela Sorina Muntean, Domnica Ioana Chiotan, Iuliana Nicolae, Constantin Marica, Nicolae Galie. Organizarea şi managementul laboratorului de micobacteriologie. Bucureşti 2008. ISBN: 978-973-0-05558-0 22. Murray P.R. et al. Manual of Clinical Microbiology, vol. I, ed. 9, 2007. American Society of Microbiology, Washington D.C. 23. Francis Varaine, Michael L. Rich. Tuberculosis. Practical guide for clinicians, nurses, laboratory technicians and medical auxiliaries, 2013, Medicins sans Frontieres and Partners in Health. 24. De Kantor IN, şi col-Laboratory services in tuberculosis control, part III: Culture, WHO/TB/98.258, 1998 25. K.M. Kam. Laboratory issues in the context of MDR TB. Malaysia, 2007. 26. WHO. Policy Framework for Implementing New Tuberculosis Diagnostics. March 2010. http://www.who.int/ 27. R.Brown. Trek diagnostic systems. The new energy in microbiology. 28. http://www.publicbookshelf.com 29. Hyeon-Seop Byeonl, Mi Jung Ji, Shin-Seok Kang, Sang Woo Kim, Seung-Cheol Kim, Song-Yong Park, Geehyuk Kim, Jiro Kim, Jang-Eun Cho, Bok Kyung Ku, Jae-Myung Kim, Bo-Young Jcon. Performance of the SD Bioline TB Ag MPT64 Rapid test for quick confirmation of Mycobacterium bovis isolates from animals.JVet Sci 2015, 16(1), 31-35. 30. Mi Young Park, Young Jin Kim, Sang Hyun Hwang, Hyoung Hoi Kim, Eun Yup Lee, Seok Hoon Jeong, Chulhun L. Chang. Evaluation of an Immunochromatographic Assay Kit for Rapid Identification of Mycobacterium tuberculosis Complex in Clinical Isolates. J Clin Microbiol, Feb. 2009, Vol. 47, No. 2: 481-484. 31. Dominguez J, EC Boetger, D Cirillo, F Cobelens, KD Eisenach, S Gagneaux, D Hilleman, R Horsburgh, B Molina-Moya, S Nieman, E Tortoli, A Whitelaw, C Lange. Clinical implications of molecular drug resistance testing for Mycobacterium tuberculosis: a TBNET/RESIST_TB consensus statement. Int J Tuberc Lung Dis 20(1):24-42. 32. Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis - 4th ed. WHO/HTM/TB/2009.422 32a. M. LIGOZZI, E. PELOSI and R. FONTANA. Development of a rapid method for quantitative evaluation of Mycobacterium tuberculosis growth based on competitive polymerase chain reaction-technical note. J. Med. Microbiol. - Vol. 47 (1998), 933-936 33. World Health Organization. Policy statement. Molecular line probe assay for rapid screening of patients at risk of multidrug-resistant (MDR) TB. Geneva, 2008. 33a. WHO treatment guidelines for drug resistant tuberculosis-2016 update, WHO/HTM/TB/2016.04. 34. Marinus Barnard, Linda Parsons, Paolo Miotto, Daniella Cirillo, Knut Feldmann, Cristina Gutierrez, Akos Somoskovi. Molecular Detection of Drug-Resistant Tuberculosis By Line Probe Assay. Laboratory Manual for Resource-Limited Settings. FIND, 2012. www.finddiagnostics.org 35. IFU-3174-01/02.2015. GenoType MTBDRsl. www.hainlifescience.com 36. Procedură dezvoltată de FIND pentru adoptarea şi folosirea în laboratoarele TB. Xpert MTB-Rif TB 06-03_V1.0.doc 37. New technologies for tuberculosis control. A framework for their adoption, introduction and implementation. WHO/HTM/STB/2007.40 ----- 
