----------- *) Aprobată prin Ordinul nr. 399/2001 publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, Nr. 203 din 26 martie 2002 ANEXA 1 LISTA METODELOR DE ANALIZA A COMPOZIŢIEI PRODUSELOR COSMETICE IN VEDEREA CONTROLULUI CALITĂŢII ACESTORA, PREVĂZUTE IN ANEXELE Nr. 2-39 1. Metoda pentru prelevarea de probe de produse cosmetice, prezentată în anexa nr. 2. 2. Metoda pentru prepararea în laborator a probelor pentru testare, prezentată în anexa nr. 3. 3. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru hidroxid de sodiu şi hidroxid de potasiu în stare libera, prezentată în anexa nr. 4. 4. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru acid oxalic şi pentru sarurile sale alcaline din produsele pentru îngrijirea parului, prezentată în anexa nr. 5. 5. Metoda de determinare cantitativă pentru cloroform din produsele pentru îngrijirea dinţilor, prezentată în anexa nr. 6. 6. Metoda de determinare cantitativă pentru zincul din sarurile sale conţinute în produsele cosmetice, prezentată în anexa nr. 7. 7. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru acid 4-hidroxibenzensulfonic, prezentată în anexa nr. 8. 8. Metoda de identificare pentru agenţii oxidanti şi de determinare cantitativă pentru apa oxigenata din produsele pentru îngrijirea parului, prezentată în anexa nr. 9. 9. Metoda de identificare şi determinare semi-cantitativă pentru anumiţi coloranţi oxidanti din produsele pentru îngrijirea parului (nuantatoare şi decolorante), prezentată în anexa nr. 10. 10. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru nitriti în produsele cosmetice, prezentată în anexa nr. 11. 11. Metoda de determinare cantitativă pentru rezorcinol din produsele pentru îngrijirea parului, prezentată în anexa nr. 12. 12. Metoda de determinare cantitativă pentru metanol fata de etanol sau 2-propanol, prezentată în anexa nr. 13. 13. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru formaldehida libera, prezentată în anexa nr. 14. 14. Metoda de determinare cantitativă pentru diclormetan şi pentru 1,1,1-tricloretan, prezentată în anexa nr. 15. 15. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru 8-chinolinol şi pentru bis (8-hidroxichinolin) sulfat, prezentată în anexa nr. 16. 16. Metoda de determinare cantitativă pentru amoniac liber în produsele cosmetice, prezentată în anexa nr. 17. 17. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru nitrometan, prezentată în anexa nr. 18. 18. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru acid mercaptoacetic din produsele pentru îngrijirea parului şi din depilatoare, prezentată în anexa nr. 19. 19. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru hexaclorofen, prezentată în anexa nr. 20. 20. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru tosilcloramida de sodiu (cloramina-T), prezentată în anexa nr. 21. 21. Metoda de determinare cantitativă pentru fluorul total din produsele pentru îngrijirea dinţilor, prezentată în anexa nr. 22. 22. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru compuşi organo-mercurici, prezentată în anexa nr. 23. 23. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru sulfuri alcaline şi alcalino-pamantoase, prezentată în anexa nr. 24. 24. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru alfa-mono-gliceril (4-aminobenzoat), prezentată în anexa nr. 25. 25. Metoda de determinare cantitativă pentru clorbutanol, prezentată în anexa nr. 26. 26. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru chinina, prezentată în anexa nr. 27. 27. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru sulfiti anorganici şi sulfiti acizi, prezentată în anexa nr. 28. 28. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru clorati ai metalelor alcaline, prezentată în anexa nr. 29. 29. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru iodat de sodiu, prezentată în anexa nr. 30. 30. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru azotat de argint, prezentată în anexa nr. 31. 31. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru bisulfura de seleniu din produsele pentru îngrijirea parului, prezentată în anexa nr. 32. 32. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru bariul solubil şi pentru strontiul solubil din bazele nuantatoare (din pigmenti sub forma de saruri sau lacuri), prezentată în anexa nr. 33. 33. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru alcool benzilic, prezentată în anexa nr. 34. 34. Metoda de identificare pentru zirconiu, metoda de determinare cantitativă pentru zirconiu, aluminiu şi clor din antiperspirante non-aerosolice, prezentată în anexa nr. 35. 35. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru hexamidina, dibromhexamidina, dibrompropamidina şi clorhexidina, prezentată în anexa nr. 36. 36. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru acid benzoic, acid 4-hidroxibenzoic, acid sorbic, acid salicilic şi acid propionic, prezentată în anexa nr. 37. 37. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru hidrochinona, monometileter hidrochinona, monoetileter hidrochinona, monobenzileter hidrochinona, prezentată în anexa nr. 38. 38. Metoda de identificare şi determinare cantitativă pentru 2-fenoxietanol, 1-fenoxipropan-2-ol, şi 4-hidroxibenzoat de: metil, etil, propil, butil sau benzil, prezentată în anexa nr. 39. ANEXA 2 METODA PENTRU PRELEVAREA DE PROBE DE PRODUSE COSMETICE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Metoda descrisă reglementează prelevarea de probe care urmează a fi analizate în scopul controlului compoziţiei produselor cosmetice. 2. DEFINIŢII 2.1. Proba de baza: o unitate luată dintr-un lot de fabricaţie oferit spre comercializare. 2.2. Proba totală: suma tuturor probelor de baza având acelaşi număr de lot de fabricaţie. 2.3. Proba de laborator: o fractie reprezentativa din proba totală care urmează a fi analizata în laboratoarele specializate de profil. 2.4. Proba pentru testare: o porţiune reprezentativa din proba de laborator care este necesară pentru o analiza. 2.5. Recipient: ambalajul primar care conţine produsul şi este în contact direct şi continuu cu acesta. 3. PROCEDEU PENTRU PRELEVARE DE PROBE 3.1. Probele de produse cosmetice vor fi prelevate în recipientele lor originare şi vor fi înaintate nedeschise laboratoarelor de analiza specializate de profil. 3.2. Pentru produsele cosmetice care sunt puse pe piaţa în vrac sau comercializate en-detail într-un recipient diferit de cel originar al producătorului, trebuie stabilite instrucţiuni specifice pentru prelevarea de probe la locul utilizării sau comercializării. 3.3. Numărul de probe de baza necesare pentru prepararea probei de laborator va fi determinat de numărul de analize necesare şi de metodele de analiza reglementate care urmează a fi aplicate în laboratoarele specializate de profil. 4. IDENTIFICAREA PROBEI 4.1. Probele vor fi sigilate la locul de preluare şi identificate în conformitate cu principiile de buna practica de laborator. 4.2. Fiecare proba de baza prelevata va fi etichetata cu următoarele date: - numele produsului cosmetic; - data, ora şi locul de prelevare a probei; - numele persoanei responsabile de prelevarea probei; - numele organismului de control care efectuează verificarea produsului cosmetic 4.3. Se va redacta un raport privind prelevarea probelor, în conformitate cu principiile de buna practica de laborator. 5. DEPOZITAREA PROBELOR 5.1. Probele de baza trebuie depozitate în conformitate cu instrucţiunile specificate pe eticheta de către producător, dacă acestea exista. 5.2. Probele de laborator vor fi depozitate la intuneric, la temperaturi între 10°C şi 25°C, dacă nu sunt specificate alte condiţii de către producător. 5.3. Probele de baza nu se deschid pana la începerea analizei. ANEXA 3 METODA PENTRU PREPARAREA IN LABORATOR A PROBELOR PENTRU TESTARE 1. GENERALITATI 1.1. Acolo unde este posibil, analizele vor fi efectuate pe fiecare proba de baza. Dacă proba de baza este prea mica, trebuie utilizat un număr minim de probe de baza. Prelevarea probei pentru testare se face după ce s-au amestecat perfect împreună toate probele de baza. 1.2. Se deschide recipientul, sub un gaz inert dacă acest lucru este specificat în metoda de analiza şi se extrag rapid probele pentru testare necesare. Proba pentru testare trebuie analizata în laborator în cel mai scurt timp posibil după prelevare, pentru a înlătura orice risc de degradare sau contaminare. Dacă proba pentru testare trebuie conservată, recipientul trebuie resigilat sub un gaz inert. 1.3. Produsele cosmetice pot fi în faza lichidă, solida sau semi-solida. Dacă un produs iniţial omogen s-a separat pe faze, acesta trebuie reomogenizat înainte de a se preleva proba pentru testare. 1.4. Dacă produsul cosmetic este pus în vânzare sub o forma specială care nu permite prelevarea de probe pentru testare în conformitate cu instrucţiunile de la pct. 1.1-1.3. şi dacă nu exista o alta metoda reglementată, se poate adopta o metoda originala, cu condiţia ca aceasta sa fie specificată în scris în raportul studiului în conformitate cu principiile de buna practica de laborator. 2. PREPARAREA IN LABORATOR A PROBELOR PENTRU TESTARE PRODUSE COSMETICE LICHIDE. 2.1. Produsele cosmetice lichide sunt: soluţiile în ulei, în alcool şi în apa, apele de toaleta, lotiunile sau emulsiile fluide. Se ambalează în flacoane, sticle, fiole sau tuburi. 2.2. Extragerea probei pentru testare: - se agita foarte bine recipientul înainte de a fi deschis; - se deschide recipientul; - se toarna cativa mililitri de lichid într-o eprubeta pentru examinarea vizuala a caracteristicilor produsului, în scopul extragerii probei pentru testare în conformitate cu instrucţiunile de la pct. 1.1-1.4.; - se resigileaza recipientul dacă nu pot fi îndeplinite instrucţiunile de la pct. 1.1-1.4, sau - se extrag probele necesare pentru testare; - se resigileaza cu grija recipientul. 3. PREPARAREA IN LABORATOR A PROBELOR PENTRU TESTARE PRODUSE COSMETICE SEMISOLIDE 3.1. Produsele cosmetice semisolide sunt: pastele, cremele, emulsiile dense şi gelurile. Se ambalează în tuburi, recipiente din plastic sau sticla. 3.2. Extragerea probei pentru testare, în cazul: 3.2.1. - recipientelor cu gat ingust. Se indeparteaza cel puţin primul centimetru din produs, se extrage proba pentru testare şi se resigileaza imediat recipientul. 3.2.2. - recipientelor cu gat larg. Se razuie suprafaţa în vederea indepartarii stratului de deasupra, se extrage proba pentru testare şi se resigileaza imediat recipientul. 4. PREPARAREA IN LABORATOR A PROBELOR PENTRU TESTARE PRODUSE COSMETICE SOLIDE 4.1. Produsele cosmetice solide sunt: pudrele pulbere, pudrele compacte, baloanele. Se ambalează într-o mare varietate de recipiente. 4.2. Extragerea probei pentru testare, în cazul: 4.2.1. - pudrei pulbere: se agita puternic înainte de desurubarea capacului sau deschidere. Se deschide şi se extrage proba pentru testare. 4.2.2. - pudrei compacte sau batoanelor: se indeparteaza stratul de suprafaţa prin razuire uniforma şi se extrage proba pentru testare din zona curăţata. 5. PREPARAREA IN LABORATOR A PROBELOR PENTRU TESTARE PRODUSE COSMETICE DIN RECIPIENTE PRESURIZATE (produse pulverizate ca aerosoli, ambalate în pulverizatoare de aerosoli). 5.1. Produse în recipiente presurizate sunt produse care sunt eliberate din recipient cu ajutorul agenţilor de pulverizare (propulsori). 5.2. Extragerea probei pentru testare: După o agitare puternica, o cantitate reprezentativa din conţinutul pulverizatorului de aerosoli (din produsul pulverizat ca aerosoli) este transferata cu ajutorul unui dispozitiv de conectare adecvat (vezi Figura 1; în cazuri speciale metodele de analiza pot necesita utilizarea altor dispozitive de conectare) într-un flacon de sticla cu invelis exterior din material plastic (Figura 4) prevăzut cu ventil pentru produse pulverizate (aerosoli), dar neechipat cu tub de imersie. In timpul transferului, flaconul este ţinut cu ventilul în jos. Acest transfer face conţinutul flaconului vizibil, pentru detectarea caracteristicilor produsului prelevat, care se pot înscrie în unul dintre următoarele patru cazuri: 5.2.1. Un produs pulverizat ca aerosoli sub forma de soluţie omogenă, corespunzător pentru analiza directa; 5.2.2. Un produs pulverizat ca aerosoli constând din doua faze lichide. Fiecare faza poate fi analizata după ce faza inferioară a fost separată şi transferata într-un alt flacon. In acest caz primul flacon de transfer este ţinut cu ventilul în jos. Într-o astfel de situaţie faza inferioară este adesea un lichid separat de gazul propulsor (ex. formula butan/apa). 5.2.3. Un produs pulverizat ca aerosoli conţinând o pudra în suspensie. Faza lichidă poate fi analizata după îndepărtarea pudrei. 5.2.4. Un produs pulverizat ca spuma sau crema, în primul rând se cantaresc exact într-un flacon de transfer 5-10 g de 2-metoxietanol. Aceasta substanta previne formarea de spuma în timpul operatiei de degazare şi astfel este posibila îndepărtarea gazului propulsor fără pierderi de produs lichid. 5.3. Accesorii. Dispozitivul de conectare (Figura 1) este confecţionat din duraluminiu sau alama. Este proiectat pentru a putea fi adaptat la diferite tipuri de ventile, prin intermediul unui adaptor de polietilena. Dispozitivul de conectare din Figura 1 este dat ca exemplu; pot fi utilizate şi alte dispozitive de conectare (vezi Figura 2 şi Figura 3). Flaconul de transfer (Figura 4) este confecţionat din sticla alba cu invelis exterior protector din material plastic transparent. Capacitatea volumica este de 50 la 100 ml. Este prevăzut cu un ventil pentru produse pulverizate (aerosoli) fără tub de imersie. 5.4. Procedeu Pentru ca sa poată fi transferata o cantitate suficienta de proba, flaconul de transfer trebuie degazat (golit de aer). In acest scop, se introduc prin intermediul dispozitivului de conectare cea. 10 ml de diclordiflormetan sau butan (în funcţie de produsul pulverizat ca aerosoli care trebuie examinat) şi apoi se degazeaza complet pana când faza lichidă dispare, ţinând flaconul de transfer cu ventilul în poziţia cea mai înalta. Se indeparteaza dispozitivul de conectare. Se cântăreşte flaconul de transfer ("a" grame). Se agita puternic pulverizatorul de aerosoli din care urmează sa se ia proba. Se ataşează conectorul la ventilul de pe recipientul pulverizator de aerosoli (ventilul orientat în sus), se conecteaza flaconul de transfer (cu gatul orientat în jos) la conector şi se apasa. Se umple flaconul de transfer aproximativ doua treimi din volum. Dacă transferul încetează prematur datorită egalizarii presiunii, se poate relua prin racirea flaconului de transfer. Se indeparteaza dispozitivul de conectare, se cântăreşte flaconul umplut ("b" grame) şi se determina greutatea probei de produs (pulverizat ca aerosoli) transferata, m(1): [m(1) = b-a] Proba astfel obţinută poate fi utilizata pentru: - analize chimice obişnuite - analiza chimica a componentilor volatili prin cromatografie de gaze 5.4.1. Analiza chimica Ţinând flaconul de transfer cu ventilul orientat în sus, se procedează după cum urmează: - se degazeaza. Dacă operaţia de degazare produce spumare, se utilizează un flacon de transfer în care a fost introdusă în prealabil, cu o seringa, prin dispozitivul de conectare, o cantitate exact cantarita (între 5 şi 10 g) de 2-metoxietanol. - se definitivează îndepărtarea constituenţilor volatili fără pierderi prin agitarea într-o baie de apa menţinută la 40°C. Se detaşează conectorul, - se recantareste flaconul de transfer ("c" grame) în scopul de a determina greutatea reziduului, M(2) [M(2) = c - a]. (NB: Când se calculează greutatea reziduului, se scade greutatea cantităţii de 2-metoxietanol utilizat) - se deschide flaconul de transfer prin îndepărtarea ventilului. - se dizolva complet reziduul într-o cantitate cunoscută dintr-un solvent adecvat. - se efectuează determinarea dorita. Formulele de calcul sunt:
r x M(2) R x P
R = ──────── şi Q = ───────
m(1) 100
unde: m(1) = masa de produs pulverizat prelevata în flaconul de transfer. M(2) = masa reziduului după încălzirea la 40°C. R = procentul de substanta specifica în M(2) (determinat conform unei metode reglementate) R = procentul de substanta specifica în aerosolul colectat Q = masa totală a substanţei specifice în pulverizatorul de aerosoli P = masa neta a pulverizatorului de aerosoli iniţial (proba de baza) 5.4.2. Analiza constituenţilor volatili prin cromatografie de gaze 5.4.2.1. Principiu Utilizând o seringa de cromatografie de gaze, se ia o cantitate adecvată din flaconul de transfer. Se injecteaza conţinutul seringii într-un cromatograf de gaze. 5.4.2.2. Accesorii Seringa de cromatografie de gaze (Figura 5) de 25 æl sau 50 æl, seria A2 "precision sampling", sau echivalent. Aceasta seringa este echipata cu un ventil cu sertar la capătul cu ac. Seringa este conectata la flaconul de transfer prin intermediul unui conector şi a unui tub de polietilena (lungime 8 mm, diametru interior 2,5 mm). Procedeu După ce o cantitate adecvată de produs pulverizat ca aerosoli a fost preluată în flaconul de transfer, se monteaza capătul conic al seringii la flaconul de transfer asa cum este descris la 5.4.2.2. Se deschide ventilul şi se aspira o cantitate adecvată de lichid. Se elimina bulele de gaz prin actionarea pistonului de mai multe ori (se raceste seringa dacă este necesar). Se închide ventilul în momentul când seringa conţine cantitatea potrivita de lichid fără bule de gaz şi se detaşează seringa de flaconul de transfer. Se monteaza acul, se introduce seringa în injectorul cromatografului de gaze, se deschide ventilul şi se injecteaza. 5.4.2.3. Standard intern Dacă este necesar un standard intern, acesta este introdus în flaconul de transfer (cu ajutorul unei seringi obişnuite din sticla, folosind un conector). Figura 1 Dispozitiv de conectare P1 Figura 2 Dispozitiv de conectare M2 pentru legătura între ventile cu filet exterior, respectiv interior Figura 3 Dispozitiv de conectare M1 pentru legătura între ventile cu filet exterior Figura 4 Flacon de transfer Capacitate: 50 ml pana la 100 ml Figura 5 Seringa de gaze presurizate ANEXA 4 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU HIDROXID DE SODIU SI HIDROXID DE POTASIU IN STARE LIBERA 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Metoda reglementează metoda de identificare a produselor cosmetice conţinând cantităţi semnificative de hidroxid de sodiu si/sau potasiu liber şi pentru determinare cantitativă pentru hidroxizii de sodiu si/sau potasiu liberi în preparatele pentru întărirea parului şi în preparatele pentru dizolvarea cuticulelor unghiilor. 2. DEFINIŢIE Hidroxidul de sodiu şi potasiu liber este definit de volumul de acid standard necesar pentru neutralizarea produsului în condiţii specifice, cantitatea rezultată fiind exprimată ca % de masa hidroxid de sodiu liber. 3. PRINCIPIU Proba este dizolvată sau dispersata în apa şi titrata cu o soluţie de concentraţie cunoscută de acid. Valoarea pH-ului este înregistrată concomitent cu adăugarea de acid: pentru o soluţie simpla de hidroxizi de sodiu sau potasiu punctul final este dat de variatia valorii înregistrate a pH-ului. Curba de titrare simpla poate fi alterata de prezenta următoarelor substanţe: (a) Amoniac sau alte baze organice slabe, care au chiar ele o curba de titrare destul de plata. Amoniacul este îndepărtat în aceasta metoda prin evaporarea la presiune scăzută, dar la temperatura camerei. (b) Saruri ale acizilor slabi, care pot da naştere la o curba de titrare cu mai multe puncte de inflexiune, în astfel de cazuri numai prima parte a curbei pana la primul dintre aceste puncte de inflexiune corespunde neutralizarii ionului hidroxil provenind din hidroxidul de sodiu sau potasiu liber. Acolo unde apare interferenta excesiva datorată sarurilor acizilor anorganici slabi, este indicat un procedeu alternativ de titrare în alcool. Exista posibilitatea teoretică ca alte baze tari solubile, de ex. hidroxidul de litiu, hidroxidul de tetraamoniu, sa fie prezente dând naştere la o valoare mare a pH-ului, însă prezenta acestora în acest tip de produse cosmetice este foarte puţin probabila. 4. IDENTIFICARE 4.1. Reactivi 4.1.1. Soluţie tampon alcalină cu pH 9,18 la 25°C: 0,05 M tetraborat de sodiu decahidrat. 4.2. Aparatura 4.2.1. Sticlarie obişnuită de laborator 4.2.2. pH-metru 4.2.3. Electrod de sticla 4.2.4. Electrod de referinţa (de calomel). 4.3. Procedeu Se etaloneaza pH-metrul cu electrozii folosind o soluţie tampon standard. Se prepara o soluţie sau o dispersie 10%, în apa, a produsului care urmează a fi analizat şi se filtreaza. Se măsoară pH-ul. Dacă pH-ul este 12 sau mai mare este necesară o determinare cantitativă. 5. DETERMINARE 5.1. Titrare în mediu apos 5.1.1. Reactivi 5.1.1.1. Acid clorhidric 0,1 N 5.1.2. Aparatura 5.1.2.1. Sticlarie obişnuită de laborator 5.1.2.2. pH-metru de preferinţa cu înregistrare 5.1.2.3. Electrod de sticla 5.1.2.4. Electrod de referinţa (de calomel) Procedeu Într-un pahar de 150 ml se cântăreşte cu precizie o proba de testare cu masa cuprinsă între 0,5 şi 1,0 g. In prezenta amoniacului se adauga câteva granule de fierbere, se pune paharul într-un exsicator cu vid, se evacueaza folosind o pompa de apa pana când mirosul de amoniac nu mai este detectabil (cca. trei ore). Se adauga 100 ml apa, se dizolva sau se disperseaza reziduul şi se titreaza cu soluţie acid clorhidric 0,1 N (5.1.2.1) inregistrand schimbarea de pH (5.1.2.2). Calcul Se identifica punctele de inflexiune pe curba de titrare. Dacă primul punct de inflexiune apare la un pH sub 7, proba este libera de hidroxid de sodiu sau potasiu. Dacă sunt doua sau mai multe puncte de inflexiune pe curba atunci numai primul este relevant. Se noteaza volumul de titrant la acest prim punct de inflexiune. Fie V volumul de titrant, în ml, şi M masa porţiunii de testare, în grame. Conţinutul de hidroxid de sodiu si/sau potasiu în proba, exprimat ca % de masa hidroxid de sodiu, se calculează folosind formula: % = 0,4 V/M Situaţia poate evolua de asa natura încât, în ciuda indicaţiilor prezentei unei cantităţi semnificative de hidroxizi de sodiu si/sau potasiu, curba de titrare sa nu indice un punct distinct de inflexiune, în acest caz determinarea trebuie repetată în izopropanol. 5.2. Titrarea în izopropanol 5.2.1. Reactivi 5.2.1.1. Izopropanol 5.2.1.2. Acid clorhidric standard, soluţie apoasă 1,0 N Acid clorhidric 0,1 N în izopropanol preparat imediat înaintea folosirii prin diluarea acidului clorhidric 1,0 N în izopropanol. 5.2.2. Aparatura 5.2.2.1. Sticlarie uzuală de laborator 5.2.2.2. pH-metru de preferinţa cu inregistrator 5.2.2.3. Electrod de sticla 5.2.2.4. Electrod de referinţa (de calomel) 5.2.3. Procedeu Într-un pahar de 150 ml se cântăreşte cu precizie o proba pentru testare cu masa cuprinsă între 0,5 şi 1,0 g. In prezenta amoniacului se adauga câteva granule de fierbere, se pune paharul într-un exsicator cu vid, se evacueaza folosind o pompa de apa pana când mirosul de amoniac nu mai este detectabil (cca. trei ore). Se adauga 100 ml izopropanol, se dizolva sau se disperseaza reziduul şi se titreaza cu acid clorhidric 0,1 N în izopropanol (5.2.1.3) inregistrand schimbarea de pH aparent (5.2.2.2). 5.2.4. Calcul Ca la 5.1.4. Primul punct de inflexiune este la un pH aparent de circa 9. 5.3. Repetabilitate (vezi ISO/DIS 5725) Pentru un conţinut de hidroxid de sodiu sau potasiu în domeniul de 5% de masa echivalent hidroxid de sodiu, diferenţa între rezultatele a doua determinări executate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,25%. ANEXA 5 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU ACID OXALIC SI PENTRU SARURILE SALE ALCALINE DIN PRODUSELE PENTRU ÎNGRIJIREA PARULUI 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Metoda reglementează determinarea şi identificarea acidului oxalic şi a sarurilor sale alcaline în produsele pentru îngrijirea parului. Poate fi folosită pentru soluţii apoase/alcoolice incolore şi lotiuni care conţin cca. 5% acid oxalic sau o cantitate echivalenta de oxalat alcalin. 2. DEFINIŢIE Conţinutul de acid oxalic si/sau sarurile sale alcaline determinat prin aceasta metoda este exprimat ca procente de masa (m/m) de acid oxalic liber în proba. 3. PRINCIPIU După îndepărtarea oricărui agent tensioactiv anionic prezent cu hidroclorura de p-toluidina, acidul oxalic si/sau oxalatii se precipita ca oxalat de calciu, după care soluţia se filtreaza. Precipitatul se dizolva în acid sulfuric şi se titreaza cu permanganat de potasiu. 4. REACTIVI Toate substanţele trebuie sa fie de puritate analitica. 4.1. soluţie acetat de amoniu 5% (m/m) 4.2. soluţie clorura de calciu 10% (m/m) 4.3. etanol 95% (V/V) 4.4. tetraclorura de carbon 4.5. dietileter 4.6. soluţie dihidroclorura de p-toluidina 6.8% (m/m) 4.7. permanganat de potasiu soluţie 0,1 N 4.8. acid sulfuric 20% (m/m) 4.9. acid clorhidric 10% (m/m) 4.10. acetat de sodiu trihidratat 4.11. acid acetic glacial 4.12. acid sulfuric (1:1) 4.13. hidroxid de bariu, soluţie saturata. 5. APARATURA 5.1. Palnii de separare, 500 ml. 5.2. Pahare de laborator, 50 ml şi 600 ml 5.3. Creuzete filtrante din sticla, G-4 5.4. Cilindru gradat, 25 ml şi 100 ml 5.5. Pipete, 10 ml 5.6. Vas de aspiraţie, 500 ml 5.7. Trompa de apa 5.8. Termometru gradat de la 0 la 100°C 5.9. Agitator magnetic cu încălzire 5.10. Tije de agitare magnetica, teflonate 5.11. Biurete, 25 ml 5.12. Baloane conice, 250 ml 6. PROCEDEU 6.1. Într-un pahar de 50 ml se cantaresc între 6 la 7 g proba, se aduce pH-ul la 3 prin diluţie cu acid clorhidric (4.9) şi se spala într-o palnie de separare cu 100 ml apa distilata. Se adauga succesiv 25 ml etanol (4.3), 25 ml soluţie de diclorura de p-toluidina (4.6) şi 25-30 ml tetraclorura de carbon (4.4) şi se agita puternic amestecul. 6.2. După separarea fazelor, se indeparteaza faza inferioară (organică) şi se repeta extracţia folosind reactivii menţionaţi la 6.1 şi din nou se indeparteaza faza organică. 6.3. Se trece soluţia apoasă într-un pahar de 600 ml si, prin fierberea soluţiei, se indeparteaza tetraclorura de carbon prezenta încă. 6.4. Se adauga 50 ml soluţie de acetat de amoniu (4.1), se aduce soluţia la fierbere (5.9) şi se adauga în soluţia la fierbere 10 ml soluţie fierbinte de clorura de calciu (4.2); se lasa precipitatul sa se aşeze. 6.5. Se verifica dacă precipitarea este completa prin adăugarea catorva picaturi de soluţie de clorura de calciu (4.2.), se lasa sa se raceasca la temperatura camerei şi apoi se amesteca cu 200 ml etanol (4.3); (5.10) se lasa sa stea timp de 30 minute. 6.6. Se filtreaza lichidul printr-un creuzet filtrant din sticla (5.3), cu o mica cantitate de apa fierbinte (50 la 60°C) se transfera precipitatul în creuzetul filtrant şi se spala precipitatul cu apa rece. 6.7. Se spala precipitatul de cinci ori cu puţin etanol (4.3) şi apoi de cinci ori cu puţin dietil eter (4.5) şi se dizolva precipitatul în 50 ml de acid sulfuric fierbinte (4.8) prin trecerea acestuia prin creuzetul filtrant la presiune redusă. 6.8. Se transfera soluţia fără pierderi într-un balon conic şi se titreaza cu soluţie de permanganat de potasiu (4.7) pana când apare o uşoară colorare în roz. 7. CALCUL Conţinutul probei, exprimat ca procente masice de acid oxalic, se calculează cu formula:
A x 4,50179 x 100
% acid oxalic = ───────────────────
E x 1000
în care: A: este consumul de permanganat de potasiu 0,1 N măsurat conform 6.8 E: este cantitatea de test a probei în grame (6.1) 4,50179 este factorul de conversie al acidului oxalic 8. REPETABILITATE (vezi ISO/DIS 5725) Pentru un conţinut de acid oxalic de circa 5%, diferenţa dintre rezultatele a doua determinări făcute în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,15%. 9. IDENTIFICARE 9.1. Principiu Acidul oxalic si/sau oxalatii se precipita ca oxalat de calciu şi se dizolva în acid sulfuric soluţie şi se adauga un pic de soluţie de permanganat de potasiu care îşi schimba culoarea şi duce la formarea bioxidului de carbon. Când CO(2) rezultat se trece printr-o soluţie de hidroxid de bariu, se formează precipitatul alb (laptos) de carbonat de bariu. 9.2. Procedeu 9.2.1. Se tratează o porţiune din proba de analizat asa cum s-a descris în secţiunea 6.1 pana la 6.3; aceasta va îndepărta orice urma de detergenti prezenta. 9.2.2. Se adauga o spatula plină de acetat de sodiu (4.10) la circa 10 ml soluţie obţinută conform 9.2.1 şi se aciduleaza soluţia cu câteva picaturi de acid acetic glacial (4.11). 9.2.3. Se adauga soluţie clorura de calciu 10% şi se filtreaza. Se dizolva precipitatul de oxalat de calciu în 2 ml de acid sulfuric (1:1) (4.12). 9.2.4. Se transfera soluţia într-o eprubeta şi se adauga cu picatura circa 0,5 ml soluţie de permanganat de potasiu 0,1 N (4.7). Dacă oxalatul este prezent, soluţia îşi pierde culoarea mai întâi gradat şi apoi rapid. 9.2.5. Imediat după adăugarea permanganatului de potasiu, se pune un tub de sticla adecvat, cu dop, deasupra eprubetei, se incalzeste uşor conţinutul şi se colectează bioxidul de carbon format într-o soluţie saturata de hidroxid de bariu (4.13). Apariţia, după 3 pana la 5 minute a unui nor laptos de carbonat de bariu indica prezenta acidului oxalic. ANEXA 6 METODA DE DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU CLOROFORM DIN PRODUSELE PENTRU ÎNGRIJIREA DINŢILOR 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta metoda reglementează determinarea cloroformului în pasta de dinţi prin cromatografie de gaze. Aceasta metoda este adecvată pentru determinarea cloroformului la nivel de 5% sau mai puţin. 2. DEFINIŢIE Conţinutul de cloroform determinat prin aceasta metoda este exprimat în procente de masice de produs. 3. PRINCIPIU Pasta de dinţi se suspenda într-un amestec de dimetilformamida/metanol la care se adauga o cantitate cunoscută de acetonitril ca standard intern. După centrifugare, o parte a fazei lichidă este supusă cromatografiei de gaze şi se calculează conţinutul de cloroform. 4. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 4.1. Porapak Q, Chromosorb 101 sau echivalent, de la 80 la 100 mesh. 4.2. Acetonitril 4.3. Cloroform 4.4. Dimetilformamida 4.5. Metanol 4.6. Soluţie standard intern 4.7. Se introduc cu pipeta 5 ml dimetilformamida (4.4) într-un balon standard de 50 ml şi se adauga circa 300 mg (M mg) acetonitril, cântărit precis. Se completează pana la semn cu dimetilformamida şi se amesteca. 4.8. Soluţie pentru determinarea factorului de răspuns relativ. Se introduc cu pipeta exact 5 ml soluţie standard intern (4.6) într-un balon standard de 10 ml şi se adauga cca. 300 mg [M(1) mg] cloroform, cântărit precis. Se aduce la semn cu dimetilformamida şi se amesteca. 5. APARATURA SI ECHIPAMENT 5.1. Balanţa analitica 5.2. Cromatograf de gaze cu detector de ionizare cu flacara 5.3. Microseringa cu o capacitate de 5 pana la 10 æl şi gradatie de 0,1 æl 5.4. Pipete cu bula cu capacităţi de 1,4 şi 5 ml 5.5. Baloane cotate de 10 şi 50 ml 5.6. Eprubete, aproximativ 20 ml, cu dop filetat, Sovirel France No. 20 sau echivalent Dopul filetat are o armătura de etansare interioară teflonata pe o parte. 5.7. Centrifuga 6. PROCEDEU 6.1. Condiţii adecvate pentru cromatografia de gaze 6.1.1. coloana: material sticla Lungime: 150 cm. Diametru interior: 4 mm Diametru exterior: 6 mm 6.1.2. Umplutura coloana: Porapak Q, Chromosorb 101 sau echivalent de 80-100 mesh (4.1) cu ajutorul unui vibrator. 6.1.3. Detector cu ionizare în flacara: se regleaza sensibilitatea astfel încât atunci când se injecteaza 3 æl de soluţie 4.7, înălţimea vârfului acetonitrilului este de cca. trei sferturi din înălţimea totală a scalei inregistratorului 6.1.4. Gaze: Purtător: azot, debit de curgere 65 ml/min. Auxiliar: se regleaza debitul de gaze către detector astfel încât debitul de aer sau oxigen sa fie de cinci pana la 10 ori mai mare fata de cel de hidrogen. 6.1.5. Temperaturi: blocul injectorului: 210°C blocul detectorului: 210°C Cuptorul coloanei: 175°C 6.1.6. Viteza de înregistrare a graficului: cca. 100 cm pe ora. 6.2. Preparare proba Se ia proba pentru testare dintr-un tub nedeschis. Se indeparteaza o treime din conţinut, se pune dopul la tub, se amesteca cu atenţie în tub şi apoi se ia porţiunea de testare. 6.3. Determinare 6.3.1. Se cântăreşte într-un tub cu dop filetat (5.6) cu precizie 10 mg, 6 pana la 7 g [M(5) g] de pasta de dinţi preparata în conformitate cu secţiunea 6.2, şi se adauga trei perle mici de sticla. 6.3.2. Se introduc cu pipeta în tub exact 5 ml soluţie standard intern (4.6), 4 ml dimetilformamida (4.4) şi 1 ml metanol (4.5), se închide tubul şi se amesteca. 6.3.3. Se agita o jumătate de ora cu un vibrator mecanic, apoi se centrifugheaza tubul închis pentru 15 minute, la o viteza suficienta pentru a produce o separare neta a fazelor. Nota: ocazional se intampla ca faza lichidă sa nu fie limpede după centrifugare. Se poate obţine o îmbunătăţire prin adăugarea la faza lichidă a 1 pana la 2 g clorura de sodiu şi recentrifugand. 6.3.4. Se injecteaza 3 æl din aceasta soluţie (6.3.3) în condiţiile deschise la pct. 6.1. Se repeta aceasta operaţie. Pentru condiţiile descrise mai sus, pot fi date următoarele valori estimative pentru timpii de retenţie: metanol: cca. 1 minut acetonitril: cca. 2,5 minute cloroform: cca. 6 minute dimetilformamida: > 15 minute 6.3.5. Determinarea factorului de răspuns relativ. Pentru determinarea acestui factor se injecteaza 3 æl de soluţie 4.7. Se repeta operaţiunea. Se determina zilnic factorul de răspuns relativ. 7. CALCUL 7.1. Calculul răspunsului relativ 7.1.1. Se măsoară înălţimea şi lăţimea la jumătatea inaltimii pentru picurile acetonitrilului şi cloroformului şi se calculează aria ambelor picuri folosind formula: înălţime x laţime la jumătatea inaltimii. 7.1.2. Se determina aria picurilor acetonitrilului şi cloroformului din cromatograma obţinută în conformitate cu secţiunea 6.3.5. şi se calculează răspunsul relativ f(s) cu ajutorul următoarei formule:
A(s) x M(i) A(s) x 1/10 M
f(s) = ───────────── = ───────────────
M(s) x A(i) A(i) x M(1)
în care: f(s) = factorul de răspuns relativ pentru cloroform A(s) = aria picului cloroformului (6.3.5) A(i) = aria picului acetonitrilului (6.3.5) M(s) = cantitatea de cloroform, în mg per 10 ml soluţie la care se face referinţa la pct. 6.3.5 [= M(1)]. M(i) = cantitatea de acetonitril, în mg per 10 ml soluţie la care se face referinţa la pct. 6.3.5 (= 1/10 M). Se calculează media citirilor obţinute. 7.2. Calculul conţinutului de cloroform 7.2.1. Se calculează, conform 7.1.1, aria picurilor cloroformului şi acetonitrilului din cromatograma obţinută prin procedura descrisă la punctul 6.3.4. 7.2.2. Se calculează conţinutul de cloroform din pasta de dinţi cu ajutorul următoarei formule:
A(s) x M(i) A(s) x M
% X = ─────────────────── x 100% = ──────────────────────
f(s) x M(sx) x A(i) f(s) x A(i) x M(0) x 100
în care: % X = conţinutul de cloroform din pasta de dinţi exprimat masic A(s) = aria picului cloroformului (6.3.4) A(i) = aria picului acrilonitrilului (6.3.4) M(sx) = masa în mg a probei la care se face referinţa în secţiunea 6.3.1 M(i) = cantitatea de acetonitril în mg per 10 ml de soluţie obţinută conform pct. 6.3.2. (1/10 M). Se calculează media valorilor găsite şi se exprima rezultatul cu o precizie de 0,1%. 8. REPETABILITATE (vezi ISO/DIS 5725) Pentru un conţinut de cloroform de 3%, diferenţa între rezultatele a doua determinări executate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,3%. ANEXA 7 METODA DE DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU ZINCUL DIN SARURILE SALE CONŢINUTE IN PRODUSELE COSMETICE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta metoda reglementează determinarea zincului prezent sub forma de cloruri, sulfat sau 4-hidroxibenzensulfonat, sau ca o asociere a mai multor saruri de zinc, în produsele cosmetice. 2. DEFINIŢIE Conţinutul de zinc al probei este determinat gravimetric ca bis (2-metil-8 chinolil oxid) de zinc şi este exprimat în procente masice de zinc în proba. 3. PRINCIPIU Zincul prezent în soluţie este precipitat într-un mediu acid ca bis (2-metil-8 chinolil oxid) de zinc. După filtrare precipitatul este uscat şi cântărit. 4. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 4.1. Amoniac concentrat 25% (m/m): d(4)^2 [] = 0,91 4.2. Acid acetic glacial 4.3. Acetat de amoniu 4.4. 2 Metilchinolin-8-ol 4.5. Soluţie amoniacala 6% (m/v) Se transfera 240 g amoniac concentrat (4.1) într-un balon standard de 1000 ml, se umple pana la semn cu apa distilata şi se amesteca. 4.6. Soluţie acetat de amoniu 0,2 M Se dizolva 15,4 g acetat de amoniu (4.3) în apa distilata, se umple pana la semn într-un balon standard de 1000 ml şi se amesteca. 4.7. Soluţie 2-Metilchinolin-8-ol Se dizolva 5 g de 2-metilchinolin-8-ol în 12 ml acid acetic glacial şi se transfera cu apa distilata într-un balon standard de 100 ml. Se umple pana la semn cu apa distilata şi se amesteca. 5. APARATURA SI ECHIPAMENT 5.1. Baloane de 100 şi 1000 ml 5.2. Pahare, 400 ml 5.3. Cilindri gradati, 50 şi 150 ml 5.4. Pipete gradate, 10 ml 5.5. Creuzete filtrante din sticla G-4 5.6. Vase de aspiraţie, 500 ml 5.7. Trompa de apa. 5.8. Termometru gradat de la 0 la 100°C 5.9. Exsicator cu agent deshidratant adecvat şi indicator de umiditate, ex. silicagel sau echivalent 5.10. Cuptor de uscare reglat la o temperatura de 150 § 2°C 5.11. pH-metru 5.12. Plita electrica 5.13. Hârtie filtru, Whatman nr. 4 sau echivalent 6. PROCEDEU 6.1. Într-un pahar de 400 ml se cantaresc 5-10 g (M grame) din proba de analizat, conţinând 50 pana la 100 mg zinc, se adauga 50 ml de apa distilata şi se amesteca. 6.1.1. Se filtreaza cu ajutorul pompei de vid dacă este necesar şi se retine filtratul. 6.1.2. Se repeta treapta de extracţie cu un volum suplimentar de 50 ml apa distilata. Se filtreaza şi se combina filtratul. 6.2. Pentru fiecare 10 mg de zinc prezent în soluţie (6.1.2) se adauga 2 ml de soluţie 2-metilchinolin-8-ol (4.7) şi se amesteca. 6.3. Se dilueaza amestecul cu 150 ml apa distilata, se aduce la temperatura de 60°C (5.12) şi se adauga 45 ml de 0,2 M soluţie acetat de amoniu (4.6), agitand continuu. 6.4. Se regleaza pH-ul soluţiei la 5,7-5,9 cu soluţie amoniacala 6% (4.5), agitand continuu; se foloseşte un pH-metru pentru măsurarea pH-ului soluţiei. 6.5. Se lasa soluţia sa stea 30 de minute. Se filtreaza cu ajutorul trompei de apa prin creuzetul filtrant din sticla G-4, care a fost iniţial uscat la 150°C şi cântărit după răcire [M(5) grame] şi se spala precipitatul cu 150 ml apa distilata la 95°C. 6.6. Se pune creuzetul în cuptorul de uscare reglat la 150°C şi se usucă timp de o ora. 6.7. Se scoate creuzetul din cuptorul de uscare, se pune în exsicator (5.9) si, când s-a racit la temperatura camerei, se determina masa [M(1) grame]. 7. CALCUL Se calculează conţinutului de zinc al probei, în procente de masa (% m/m) cu ajutorul următoarei formule:
[M(1) - M(0)] x 17,12
% zinc = ─────────────────────
M
în care: M = masa în grame a probei luate în conformitate cu (6.1) M(5) = masa în grame a creuzetului gol şi uscat (6.5) M(1) = masa în grame a creuzetului cu precipitat (6.7) 8. REPETABILITATE (ISO/DIS 5725) Pentru un conţinut de zinc de cca. 1% (m/m), diferenţa între rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,1%. ANEXA 8 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU ACID 4-HIDROXIBENZENSULFONIC 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta metoda reglementează identificarea şi determinarea cantitativă a acidului 4-hidroxibenzensulfonic din produsele cosmetice ambalate în pulverizatori de aerosoli şi în lotiunile pentru fata. 2. DEFINIŢIE Conţinutul de acid 4-hidroxibenzensulfonic determinat în conformitate cu acesta metoda este exprimat ca procente masice de 4-hidroxibenzensulfonat de zinc anhidru, în produs. 3. PRINCIPIU Proba pentru testare este concentrata la presiune redusă, dizolvată în apa şi purificata prin extracţie cu cloroform. Determinarea acidului 4-hidroxibenzensulfonic se face iodometric pe o porţiune a soluţiei apoase filtrate. 4. REACTIVI Toate substanţele trebuie sa fie de puritate analitica. 4.1. Acid clorhidric concentrat 36%, d=1,18 gmL^-1 4.2. Cloroform 4.3. n-Butanol 4.4. Acid acetic glacial 4.5. Iodura de potasiu 4.6. Bromura de potasiu 4.7. Carbonat de sodiu 4.8. Acid sulfanilic 4.9. Azotit de sodiu 4.10. Bromat de potasiu 0,1 N 4.11. Soluţie tiosulfat de sodiu 0,1 N 4.12. Soluţie apoasă de amidon 1% 4.13. Soluţie apoasă de carbonat de sodiu 2% 4.14. Soluţie apoasă de azotat de sodiu 4,5% 4.15. Soluţie de ditizona în cloroform 0,05 (m/v). 4.16. Solvent de developare: 1-butanol/acid acetic glacial/apa (4:1:5 părţi în volume); după amestecare în palnia de separare se arunca faza inferioară. 4.17. Reactiv Pauly Se dizolva 4,5 g acid sulfanilic (4.8) în 45 ml acid clorhidric concentrat (4.1), se incalzeste în acest timp, şi se dilueaza soluţia cu apa pana la 500 ml. Se racesc 10 ml de soluţie într-un vas cu apa cu gheaţa şi se adauga sub amestecare 10 ml de soluţie rece de azotit de sodiu (4.14). Se lasa soluţia sa stea 15 minute la 0°C (la aceasta temperatura soluţia rămâne stabilă una pana la trei zile) şi imediat înainte de pulverizare (7.5) se adauga 20 ml soluţie de carbonat de sodiu (4.13). 4.18. Plăci de celuloza gata pregătite pentru cromatografie în strat subtire; format 20 x 20 cm, grosimea stratului absorbant 0,25 mm. 5. APARATURA SI ECHIPAMENT 5.1. Baloane cu fund rotund, 100 ml 5.2. Palnie de separare 100 ml 5.3. Pahar conic cu dop de sticla, 250 ml 5.4. Biureta, 25 ml 5.5. Pipete cu bula, 1,2 şi 10 ml 5.6. Pipeta gradata, 5 ml 5.7. Microseringa, 10 æl cu 0,1 æl gradatie 5.8. Termometru gradat de la 0 la 100°C 5.9. Baie de apa cu încălzire 5.10. Cuptor de uscare, bine ventilat şi reglat la 80°C 5.11. Aparatura uzuală necesară executării cromatografiei în strat subtire. 6. PREPARARE PROBA In metoda descrisă mai jos pentru identificarea şi determinarea acidului hidroxibenzensulfonic în aerosoli, se foloseşte reziduul obţinut prin eliberarea din cilindrul pulverizator de aerosoli a solventilor şi a agenţilor de pulverizare care se evapora la presiune normală. 7. IDENTIFICARE 7.1. Cu ajutorul microseringii (5.7) se aplica 5 æl de reziduu (6) sau proba pe fiecare din cele şase puncte pe linia de pornire la o distanta de 1 cm de latura a de jos a placii de strat subtire. 7.2. Se pune placa într-un tanc de developare care conţine deja solventul de developare (4.16) şi se developeaza pana când frontul de solvent atinge o distanta de 15 cm de la linia de pornire. 7.3. Se scoate placa din baie şi se usucă la 80°C pana când nu mai sunt perceptibili vapori de acid acetic. Se pulverizeaza placa cu soluţie de carbonat de sodiu (4.13) şi se usucă la aer. 7.4. Se acoperă o jumătate din placa cu o placa de sticla şi se pulverizeaza partea neacoperita cu soluţie de ditizona 0,05% (4.15). Apariţia unor pete roşu-purpuriu pe cromatograma indica prezenta ionilor de zinc. 7.5. Se acoperă jumătatea peste care s-a pulverizat cu o placa de sticla şi se pulverizeaza cealaltă jumătate cu reactiv Pauly (4.17). Prezenta acidului 4-hidroxibenzensulfonic este indicată prin apariţia unei pete galben-maroniu cu o valoare Rf de cca. 0,26 în timp ce o pata galbena cu o valoare Rf de cca. 0,45 pe cromatograma indica prezenta acidului 3-hidroxibenzensulfonic. 8. DETERMINARE 8.1. Într-un balon cu fund rotund de 100 ml se cantaresc 10 g de proba sau reziduu (6) şi se evapora sub vid pana aproape de uscare, într-un evaporator rotativ peste o baie de apa menţinută la 40°C. 8.2. Într-un pahar se pun cu pipeta 10,0 ml apa [V(1) ml] şi se dizolva prin încălzire reziduul obţinut la evaporare (8.1). 8.3. Se transfera soluţia cantitativ într-o palnie de separare (5.2) şi se extrage soluţia apoasă de doua ori cu portii de 20 ml de cloroform (4.2). După fiecare extracţie se arunca faza cu cloroform. 8.4. Se filtreaza soluţia apoasă printr-un filtru cutat, în funcţie de conţinutul de acid hidroxibenzensulfonic presupus, se introduc cu pipeta 1,0 sau 2,0 ml de filtrat [V(2)] într-un flacon conic de 250 ml (5.3) şi se dilueaza pana la 75 ml cu apa. 8.5. Se adauga 2,5 ml acid clorhidric 36% (4.1) şi 2,5 g bromura de potasiu (4.6), se amesteca şi se aduce temperatura soluţiei pana la 50°C cu ajutorul unei băi de apa. 8.6. Dintr-o biureta, se adauga bromat de potasiu 0,1 N (4.10) pana când culoarea soluţiei, care este încă la 50°C, virează în galben. 8.7. Se adauga mai departe 3,0 ml soluţie de bromat de potasiu (4.10), se închide vasul şi se lasa sa stea în baia de apa la 50°C timp de 10 minute. Dacă după 10 minute soluţia îşi pierde culoarea, se adauga alţi 2,0 ml soluţie de bromat de potasiu (4.10), se închide vasul şi se incalzeste pe baie de apa menţinută la 50°C. Se înregistrează cantitatea totală de soluţie de bromat de potasiu adăugată (a). 8.8. Se raceste soluţia la temperatura camerei, se adauga 2 g iodura de potasiu (4.5) şi se amesteca. Se titreaza iodul format cu soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1 N (4.11). Spre sfârşitul titrarii se adauga câteva picaturi de soluţie de amidon (4.12) ca indicator. Se noteaza cantitatea de tiosulfat de sodiu folosită (b). 9. CALCUL Se calculează conţinutului de hidrobenzendisulfonat de zinc din proba sau reziduu (6) ca procent masic (% m/m) cu ajutorul următoarei formule: (a-b) x V(1) x 0,00514 x 100 0/0 m/m hidroxibenzensulfonat de zinc = ──────────────────────────── m x V(2) în care: a = cantitatea totală de soluţie de bromat de potasiu 0,1 N adăugată, în ml (8.7) b = cantitatea de soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1 N folosită pentru retitrare, în ml (8.9) m = cantitatea de produs sau reziduu analizata, exprimată în miligrame (8.1) V(1)= volumul de soluţie obţinută conform 8.2, exprimată în mililitri V(2) = volumul de reziduu de evaporare dizolvat folosit pentru analiza (8.4), exprimat în mililitri. Nota: ----- In cazul aerosolilor, măsurarea exprimată în % (m/m) de reziduu (6) trebuie sa fie raportată la produsul originar. In scopul acestei conversii, se vor respecta regulile de prelevare a probelor de aerosoli indicate în Anexa nr. 3 la prezentul Ordin. 10. REPETABILITATE (vezi ISO/DIS 5725) Pentru un conţinut de cca. 5% hidroxibenzensulfonat de zinc, diferenţa între rezultatele a doua determinări executate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,5%. 11. INTERPRETAREA REZULTATELOR Conform Ordinului Ministerului Sănătăţii şi Familiei nr. 1004/2000 referitor la produsele cosmetice, concentraţia maxima autorizata de 4-hidrobenzensulfonat de zinc în lotiunile de fata şi deodorante este de 6% (m/m). Aceasta înseamnă ca pe lângă conţinutul de acid hidrobenzensulfonic, trebuie determinat şi conţinutul de zinc. Multiplicarea conţinutului de hidrobenzensulfonat de zinc (9) cu un factor de 0,1588 determina conţinutul minim de zinc în % (m/m) care teoretic trebuie sa fie prezent în produs dat fiind conţinutul de acid hidrobenzensulfonic măsurat. Conţinutul de zinc efectiv măsurat gravimetric (vezi indicaţiile relevante) poate fi, totuşi, mai mare, datorită faptului ca atât clorura de zinc cat şi sulfatul de zinc pot fi folosite de asemenea în produsele cosmetice. ANEXA 9 METODA DE IDENTIFICARE PENTRU AGENŢII OXIDANTI SI DE DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU APA OXIGENATA DIN PRODUSELE PENTRU ÎNGRIJIREA PARULUI SCOP SI DOMENIU DE APLICARE. Determinarea iodometrica a apei oxigenate în cosmetice este posibila numai în absenta altor agenţi de oxidare care generează iod din ioduri. Prin urmare, înainte de determinarea iodometrica a apei oxigenate este necesar a se detecta şi identifica oricare alt agent de oxidare prezent. Aceasta identificare se împarte în doua etape; prima se referă la persulfati, bromati şi apa oxigenata, iar a doua etapa se referă la peroxidul de bariu. A. IDENTIFICAREA PERSULFATILOR, BROMATILOR SI APEI OXIGENATE PRINCIPIU Persulfatul de sodiu, persulfatul de potasiu şi persulfatul de amoniu; bromatul de potasiu, bromatul de sodiu şi apa oxigenata - provenită sau nu din peroxidul de bariu - sunt identificate cu ajutorul cromatografiei pe hârtie, folosindu-se doi solventi de developare, 1. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 1.1. Soluţii apoase de referinţa 0,5% (m/v) ale următorilor compuşi: 1.1.1. Persulfat de sodiu 1.1.2. Persulfat de potasiu 1.1.3. Persulfat de de amoniu 1.1.4. Bromat de potasiu 1.1.5. Bromat de sodiu 1.1.6. Apa oxigenata 1.2. Solvent de developare A, 80% (v/v) etanol 1.3. Solvent de developare B, benzen-metanol-3-metil-1-butanol-apa (34:38:18:10, volumetric) 1.4. Agent de detectare A, soluţie apoasă de iodura de de potasiu 10% (m/v) 1.5. Agent de detectare B, soluţie apoasă de amidon 1% (m/v) 1.6. Agent de detectare C, acid clorhidric 10% (m/m) 1.7. Acid clorhidric 4 N 2. APARATURA SI ECHIPAMENT 2.1. Hârtie cromatografica: hârtie Whatman Nr. 3 şi Nr. 4 ori echivalentii lor 2.2. Micropipete, 1 æl 2.3. Baloane cotate, 100 ml 2.4. Filtre cutate 2.5. Aparatura pentru cromatografie descendenta pe hârtie 3. PREPARARE PROBE 3.1. Produşi solubili în apa Se prepara doua soluţii din fiecare proba prin dizolvarea a 1 g şi respectiv 5 g de produs în 100 ml apa. Se foloseşte 1 æl din fiecare dintre aceste soluţii pentru realizarea cromatografiei pe hârtie, descrisă la punctul 5. 3.2. Produşi greu solubili în apa 3.2.1. Se cantaresc 1 g şi respectiv 5 g de proba şi se dilueaza în 50 ml apa, se aduce la semn cu apa, în fiecare din cele doua cazuri, şi se amesteca. Se filtreaza dispersiile peste filtrul cutat (3.4) şi se foloseşte 1 æl din fiecare filtrat pentru realizarea cromatografiei pe hârtie, descrisă la punctul 5. Se prepara încă o data doua dispersii din fiecare proba prin dilutia a 1 g şi respectiv 5 g în 50 ml apa, acidulata cu acid clorhidric diluat (2.7), se aduce la semn cu apa şi se amesteca. Se filtreaza dispersiile peste filtrul cutat (3.4) şi se foloseşte 1 æl din fiecare filtrat pentru realizarea cromatografiei pe hârtie, descrisă la punctul 5. 3.3. Creme 3.3.1. Se disperseaza 5 g şi 20 g din fiecare produs în 100 ml apa şi se folosesc dispersiile pentru realizarea cromatografiei pe hârtie, descrisă în Secţiunea 5. 4. PROCEDEU 4.1. In doua tancuri cromatografice separate se pun cantităţi adecvate de solvent A (2.2) şi B (2.3) în scopul realizării cromatografiei descendente pe hârtie. Se satureaza tancurile cromatografice pentru cel puţin 24 ore cu vapori de solvent. 4.2. Se pun câte 1 æl din proba şi din soluţia de referinţa preparata conform punctelor 4 şi 2.1 pe câte un punct de pornire de pe banda de hârtie cromatografica (Whatman Nr. 3 ori echivalent) de lungime 40 cm şi laţime 20 cm (3.1) sau alt format adecvat şi se evapora soluţia în aer. 4.3. Se pune banda cromatografica (5.2) în tancul cromatografic umplut cu soluţie de developare A (5.1) şi se developeaza pana când frontul de solvent avansează 35 cm (cca. 15 ore). 4.4. Se repeta procedeul descris la punctele 5.2 şi 5.3, utilizând hârtie cromatografica (Whatman Nr. 4 ori echivalent) (3.1) şi solvent de developare B. Se cromatografiaza pana când frontul solventului avansează 35 cm (cca. 5 ore) 4.5. După developare se scot cromatogramele şi se usucă în aer. 4.6. Se pun în evidenta petele din cromatograma prin pulverizare succesiva cu: 4.6.1. agent de detectare A (2.4) urmat la scurt timp de agentul de detectare B (2.5). Spoturile de persulfati vor aparea primele în cromatograma şi vor fi urmate de spoturile de apa oxigenata. Se marchează spoturile cu un creion. 4.6.2. agent de detectare C (2.6) pe cromatogramele obţinute în conformitate cu punctul 5.6.1; prezenta bromatilor va fi indicată prin spoturi albastru cenusii pe cromatograma. 4.7. In condiţiile mai sus menţionate corespunzătoare solventilor de developare A (2.2) şi B (2.3), valorile Rf ale substanţelor de referinţa (2.1) sunt aproximativ următoarele:
──────────────────────────────────────────────────────────────────────
Solvent de Solvent de
developare A (2.2) developare B (2.3)
──────────────────────────────────────────────────────────────────────
Persulfat de sodiu 0,40 0,10
Persulfat de potasiu 0,40 0,02+0,05
Persulfat de amoniu 0,50 0,10+0,20
Bromat de sodiu 0,40 0,20
Bromat de potasiu 0,40 0,1+0,2
Apa oxigenata 0,80 0,80
──────────────────────────────────────────────────────────────────────
B. IDENTIFICAREA PEROXIDULUI DE BARIU 1. PRINCIPIU Peroxidul de bariu se identifica prin formarea apei oxogenate după acidifierea probei (A.4.2) şi prin prezenta ionului de bariu: - în absenta persulfatilor (A), prin adăugarea de acid sulfuric diluat la o porţiune de soluţie proba de acid (B.4.1), în urma căreia se formează un precipitat alb de sulfat de bariu. Prezenta ionilor de bariu în proba (B.4.1) este încă o data confirmată prin cromatografie pe hârtie în modul descris mai sus (B.5). - unde peroxidul de bariu şi persulfatii sunt prezente simultan (B.4.2) prin asimilarea rezidului din soluţie (B.4.2) într-o baza; după dizolvarea în acid clorhidric, prezenta ionilor de bariu este confirmată în soluţia topiturii (B.4.2.3) prin cromatografie pe hârtie si/sau prin precipitarea sulfatului de bariu. 2. REACTIVI 2.1. Metanol 2.2. Acid clorhidric concentrat 36% (m/m) 2.3. Acid clorhidric 6 N 2.4. Acid sulfuric 4 N 2.5. Sare disodica a acidului rodizonic 2.6. Clorura de bariu [BaCl(2) ● 2H(2)O] 2.7. Carbonat de sodiu anhidru 2.8. Clorura de bariu soluţie apoasă 1% (m/v) 2.9. Solvent de developare constând din metanol, acid clorhidric concentrat (36%) şi apa (80:10:10, volumetric) 2.10. Agent de detectare, soluţie apoasă 0,1% (m/v) de sare disodica a acidului rodizonic, proaspăt preparata imediat înainte de folosire. 3. APARATURA SI ECHIPAMENT 3.1. Micropipete, 5 æl 3.2. Creuzete de platina 3.3. Balon cotat, 100 ml 3.4. Hârtie cromatografica Scheleicher şi Schull 2043 b ori echivalent. Se curata hârtia prin developare peste noapte într-un tanc cromatografic descendent (A.3.5) conţinând solvent de developare (B.2.9) şi apoi se usucă. 3.5. Hârtie de filtru cutata. 3.6. Aparatura uzuală pentru realizarea cromatografiei descendente pe hârtie. 4. PREPARARE PROBE 4.1. Produse în care persulfatii sunt absenţi 4.1.1. Se disperseaza 2 g de produs în 50 ml apa şi se aduce pH-ul dispersiei la cca. 1, cu acid clorhidric (B.2.3) 4.1.2. Se transfera dispersia cu apa într-un balon cotat de 100 ml, se aduce la semn cu apa şi se amesteca. Se foloseşte aceasta dispersie pentru analiza prin cromatografiere pe hârtie descrisă la punctul 5 şi pentru identificarea banului prin precipitarea sulfatului. 4.2. Produse în care persulfatii sunt prezenţi 4.2.1. Se disperseaza 2 g de produs în 100 ml de apa şi se filtreaza. 4.2.2. Se adauga la reziduul uscat carbonat de sodiu (B.2.7) de 7 pana la 10 ori greutatea sa, se amesteca şi se topeste amestecul într-un creuzet de platina (B.3.2) pentru o jumătate de ora. 4.2.3. Se raceste la temperatura camerei, se dizolva topitura în 50 ml apa şi se filtreaza (B.3.5) 4.2.4. Se dizolva reziduul din topitura în acid clorhidric (B.2.3) şi se aduce la 100 ml cu apa. Se foloseşte acesta soluţie pentru analiza prin cromatografiere pe hârtie descrisă la punctul 5 şi pentru identificarea bariului prin precipitare din sulfat. 5. PROCEDEU 5.1. Se pune o cantitate adecvată de solvent de developare (B.2.9.) într-un tanc pentru cromatografie ascendenta pe hârtie şi se satureaza tancul pentru cel puţin 15 ore. 5.2. Pe o bucata de hârtie cromatografica - pretratata conform descrierii de la punctul B.3.4 - se aplica 5 æl din fiecare dintre soluţiile preparate conform punctului B.4.1.2. şi punctului B. 4.2.4 şi soluţie de referinţa B.2.8 în trei puncte de pornire. 5.3. Se usucă în aer spoturile de proba şi de soluţie etalon. Se developeaza cromatograma pana când frontul solventului urca 30 cm. 5.4. Se indeparteaza cromatograma din vas şi se usucă în aer. 5.5. Se pun în evidenta spoturile de pe cromatograma prin pulverizarea hârtiei cu agentul de detectare B.2.10. In prezenta bariului, apar pe cromatograma spoturi roşii cu o valoare Rf de cca. 0,10. C. DETERMINAREA APEI OXIGENATE 1. PRINCIPIU Determinarea iodometrica a apei oxigenate se bazează pe următoarea reactie: + _ H(2)O(2) + 2H + 2I -> I(2) + 2H(2)O Aceasta conversie are loc incet dar poate fi accelerata prin adăugarea molibdatului de amoniu. Iodul format este determinat titrimetric cu tiosulfat de sodiu şi este o măsura a conţinutului de apa oxigenata. 2. DEFINIŢIE Conţinutul de apa oxigenata măsurat în modul descris mai sus este exprimat ca procent masic de produs (% m/m). 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 3.1. Acid sulfuric 2 N 3.2. Iodura de potasiu 3.3. Molibdat de amoniu 3.4. Tiosulfat de sodiu 0,1 N 3.5. Soluţie de iodura de potasiu 10% (m/v), proaspăt preparata imediat înainte de folosire 3.6. Soluţie de molibdat de amoniu 20% (m/v) 3.7. Soluţie de amidon 1% (m/v) 4. APARATURA SI ECHIPAMENT 4.1. Pahare, 100 ml 4.2. Biurete, 50 ml 4.3. Baloane cotate, 250 ml 4.4. Cilindri gradati, 25 şi 100 ml 4.5. Pipete cu bula, 10 ml 4.6. Flacoane conice, 250 ml 5. PROCEDEU 5.1. Într-un pahar de 100 ml se cantaresc 10 g ("m" grame) de produs, conţinând cca. 0,6 g apa oxigenata. Se transfera conţinutul, cu apa, într-un balon cotat de 250 ml, se aduce cu apa la semn şi se amesteca. 5.2. Într-un flacon conic de 250 ml (4.6) se pun cu pipeta 10 ml de soluţie proba (5.1) şi se adauga succesiv 100 ml acid sulfuric 2 N (3.1), 20 ml soluţie iodura de potasiu (3.5) şi trei picaturi soluţie molibdat de amoniu (3.6). 5.3. Se titreaza imediat iodul format cu soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1 N (3.4) şi exact înainte de virare se adauga cativa mililitrii de soluţie de amidon ca indicator (3.7). Se înregistrează consumul de tiosulfat de sodiu 0,1 N (3.4) în mililitrii ("V"). 5.4. In modul descris mai sus la punctele 5.2 şi 5.3, se realizează o determinare oarba, înlocuind 10 ml din soluţia proba cu 10 ml apa. Se înregistrează consumul de soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1 N în determinarea oarba ["V(5)" ml]. 6. CALCUL Se calculează conţinutul de apa oxigenata din produs ca procent masic (% m/m) cu ajutorul formulei de mai jos: [V - V(0)] x 1,7008 x 250 x 100 [V - V(0)] x 4,252 % apa oxigenata = ─────────────────────────────── = ────────────────── m x 10 x 1000 m în care: m = cantitatea în grame de produs analizat (5.1) V(0) = consumul în mililitrii de soluţie de tiosulfat de 0,1 N în determinarea oarba (5.4) V = consumul în mililitrii de soluţie de tiosulfat de 0,1 N în titrarea soluţie proba (5.3) 7. REPETABILITATE (vezi ISO 5725) Pentru un produs conţinând cca. 6% m/m apa oxigenata, diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceiaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,2%. ANEXA 10 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE SEMI-CANTITATIVĂ PENTRU ANUMIŢI COLORANŢI OXIDANTI DIN PRODUSELE PENTRU ÎNGRIJIREA PARULUI (NUANTATOARE SI DECOLORANTE) 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta metoda este reglementată pentru identificarea şi determinarea semi-cantitativă a următoarelor substanţe în vopselele pentru par, sub forma de crema sau lichide:
┌────────────────────────────────────────────────┐────────┐
│ Substanţe │ Simbol │
├────────────────────────────────────────────────┼────────┤
│Fenilendiamine │ │
├────────────────────────────────────────────────┼────────┤
│o-fenilendiamina │ (OPD) │
├────────────────────────────────────────────────┼────────┤
│m-fenilendiamina │ (MPD) │
├────────────────────────────────────────────────┼────────┤
│p-fenilendiamina │ (PPD) │
├────────────────────────────────────────────────┼────────┤
│Metilfenilendiamine │ │
├────────────────────────────────────────────────┼────────┤
│4-metil-1,2-fenilendiamina (toluen-3,4-diamina) │ (OTD) │
├────────────────────────────────────────────────┼────────┤
│4-metil-1,3-fenilendiamina (toluen-2,4-diamina) │ (MTD) │
├────────────────────────────────────────────────┼────────┤
│2-metil-1,4-fenilendiamina (toluen-2,5-diamina) │ (PTD) │
├────────────────────────────────────────────────┼────────┤
│Diaminofenoli │ │
├────────────────────────────────────────────────┼────────┤
│2,4-diaminofenol │ (DAP) │
├────────────────────────────────────────────────┼────────┤
│Hidrochinona │ │
├────────────────────────────────────────────────┼────────┤
│1,4-benzendiol │ (H) │
├────────────────────────────────────────────────┼────────┤
│a-Naftol │(alfa-N)│
├────────────────────────────────────────────────┼────────┤
│Pirogalol │ │
├────────────────────────────────────────────────┼────────┤
│1,2,3-trihidroxibenzen │ (P) │
├────────────────────────────────────────────────┼────────┤
│Rezorcinol │ │
├────────────────────────────────────────────────┼────────┤
│1,3-dihidroxibenzen │ (R) │
└────────────────────────────────────────────────┴────────┘
2. PRINCIPIU Colorantii de oxidare sunt extrasi la un pH 10 cu etanol 96% din vopselele în forma de crema sau lichid şi identificati prin cromatografie în strat subtire, uni sau bi-dimensionala. Pentru determinarea semi-cantitativă a acestor substanţe, cromatograma probelor este comparata prin intermediul a patru sisteme de developare cu cromatograma substanţelor de referinţa produsă în acelaşi timp şi pe cat posibil în condiţii similare. 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 3.1. Etanol, anhidru 3.2. Acetona 3.3. Etanol, 96% v/v 3.4. Soluţie amoniacala, 25% (d(4)^2 [] = 0,91) 3.5. Acid ascorbic L(+) 3.6. Cloroform 3.7. Ciclohexan 3.8. Azot tehnic 3.9. Toluen 3.10. Benzen 3.11. n-butanol 3.12. 2-butanol 3.13. Acid hipofosforos, soluţie 50% v/v 3.14. Reactiv diazo. Unul din următoarele: - clorbenzensulfonat de 3-nitro-1-benzendiazoniu (forma de sare stabilă ca în Roşu 2 JN - Francelor - naftalinbenzoat de 2-clor-4-nitro-1-benzendiazoniu (forma de sare stabilă) ca în Reactiv NNCD - nr. crt. 84150 FLUKA ori un echivalent. 3.15. Azotat de argint 3.16. p-dimetilaminobenzaldehida 3.17. 2,5-dimetilfenol 3.18. Clorura ferica hexahidrata [FeCl(3) ● 6H(2)O] 3.19. Acid clorhidric, soluţie 10% m/v 3.20. Substanţe de referinţa Substanţele de referinţa sunt cele indicate în paragraful 1 "Scop şi domeniu de aplicare". In cazul compusilor de amine, substanţele de referinţa trebuie sa fie ori hidrocloruri (mono sau bi) ori baze libere. 3.21. Soluţii de referinţa 0,5% (m/v) Se prepara o soluţie 0,5% (m/v) din fiecare dintre substanţele de referinţa de la punctul 3.20. Într-un balon cotat de 10 ml se cantaresc 50 mg § 1 mg substanta de referinţa. Se adauga 5 ml de etanol 96% (3.3) şi 250 mg acid ascorbic (3.5). Se alcalinizeaza soluţia prin adăugarea soluţiei amoniacale (3.4) pentru a obţine un pH de aprox. 10 (se verifica cu hârtie indicatoare). Se adauga pana la 10 ml etanol 96% (3.3) şi se amesteca. Soluţiile pot fi păstrate o saptamana într-un loc rece şi ferit de lumina, în anumite cazuri, după adăugarea acidului ascorbic şi a amoniacului, se poate forma un precipitat, în acest caz trebuie lăsat sa se sedimenteze înainte de lucru. 3.22. Solventi de developare 3.22.1. Acetona - cloroform - toluen (35:25:40 volumetric) 3.22.1.1. Acetona - cloroform - etanol absolut - amoniac 25% (80:10:10:1 volumetric) 3.22.1.2. Benzen - 2-butanol - apa (50:25:25 volumetric). Se agita bine şi se foloseşte faza superioară după separare la temperatura camerei (20 pana la 25°C) 3.22.1.3. n-butanol-cloroform-reactiv M (7:70:23 volumetric). Se separa cu grija la temperatura camerei (20 la 25°C) şi se foloseşte faza inferioară. Preparare reactiv M
────────────────────────────────────────────
Soluţie amoniacala 25% (v/v): 24 volume
Acid hipofosforos 50% (3.13): 1 volum
Apa: 75 volume
────────────────────────────────────────────
Nota: ----- Solventii de developare conţinând amoniac trebuie bine agitati imediat înainte de folosire. 3.23. Spray-uri indicatoare 3.23.1. Reactiv diazo Se prepara o soluţie apoasă 0,5% (m/v) de reactiv ales (3.14). Aceasta soluţie trebuie sa fie proaspăt preparata, imediat înainte de folosire. 3.23.2. Reactiv Ehrlich Se dizolva 2 g p-diametilaminobenzaldehida (3.16) în 100 ml acid clorhidric soluţie apoasă 10% (m/v) (3.19) 3.23.3. 2,5-dimetilfenol-clorura ferica hexahidrata Soluţie 1: se dizolva 1 g dimetilfenol (3.17) în 100 ml etanol 96% (3.3) Soluţie 2: se dizolva 4 g clorura ferica hexahidratata (3.18) în 100 ml etanol 96% (3.3) Pentru developare, aceste soluţii sunt pulverizate separat, întâi soluţia 1 apoi soluţia 2. 3.23.4. Azotat de argint amoniacul Amoniac 25% (3.4) este adăugat la o soluţie apoasă de azotat de argint 5% (m/v) (3.15) pana când precipitatul se dizolva. Acest reactiv trebuie preparat imediat înainte de folosire. A nu se depozita. 4. APARATURA 4.1. Echipament uzual de laborator pentru cromatografie în strat subtire. 4.1.1. Capac de plastic sau sticla astfel construit încât placa cromatografica sa fie inconjurata de azot în timpul apariţiei petelor şi uscarii. Aceasta precauţie este necesară din cauza susceptibilitatii la oxidare a anumitor coloranţi. 4.1.2. Microseringa, 10 æl, gradata cu diviziuni de 0,2 æl, cu ac cu secţiune patrata, sau, mai bine, un distribuitor cu repetitie de 50 æl, montat pe un stativ cu clema astfel încât placa sa fie menţinută sub azot. 4.1.3. Plăci de strat subtire cu silicagel, gata preparate, de 25 mm grosime, format 20 x 20 cm (Macherey şi Nagel, Silica G-HR, care au suport de plastic, sau echivalent). 4.2. Centrifuga, 4000 rotatii/minut 4.3. Eprubete de centrifuga, 10 ml, - cu capace filetate captusite cu PTFE sau echivalent. 5. PROCEDEU 5.1. Tratament probe pentru testare Se indeparteaza primii 2 sau 3 cm din crema scoasa din tub. Se pun într-o eprubeta de centrifuga (4.3) anterior suflata cu azot următoarele: 300 mg acid ascorbic cu 3 g crema ori 3 g lichid omogenizat. Se adauga cu picatura amoniac 25% (3.4) pana la un pH 10. Se adauga pana la 10 ml etanol 96%. Se omogenizeaza sub azot (3.8), se pune capacul şi apoi se centrifugheaza (la 4000 rot/min) timp de 10 minute. 5.2. Cromatografiere 5.2.1. Spotarea plăcilor sau depunerea probelor pe plăci Sub atmosfera de azot (3.8), se aplica pe o placa cromatografica (4.1.3) 1 æl din fiecare dintre soluţiile de referinţa descrise mai sus pe 9 puncte situate la cca. 1,5 cm de-a lungul unei linii situata la aproximativ 1,5 cm de muchia placii. Aceste spoturi de soluţie de referinţa sunt dispuse după cum urmează:
────────────────────────────────────────────
1 2 3 4 5 6 7 8 9
R P H PPD DAP PTD OPD OTD MPD
MTD alfa-N
────────────────────────────────────────────
In plus, se aplica la punctele 10 şi 11, câte 2 æl de soluţie de proba pentru testare obţinută în conformitate cu punctul 5.1 Se menţine placa sub azot (3.8) pana în momentul în care este developata. 5.2.2. Developare Se pune placa într-un tanc anterior suflat cu azot (3.8), saturat cu unul dintre cei patru solventi (3.22) şi se lasa la developat la temperatura camerei (20 la 25°C), în intuneric, pana când frontul de solvent migreaza cca. 15 cm fata de linia de baza. Se indeparteaza placa şi se usucă sub azot (3.8) la temperatura camerei. 5.2.3. Pulverizare Se pulverizeaza placa imediat cu una dintre cele patru soluţii specificate la 3.23 5.2.4. Identificare Se compara valoarea Rf şi culoarea obţinută de la proba pentru testare cu acelea ale substanţelor de referinţa cromatografiate. Tabelul I exemplifica valorile Rf şi culorile pentru fiecare substanta depinzand de solvent şi de indicatorul folosit. Confirmarea identificarii incerte poate fi uneori realizată printr-o metoda fixatoare, adaugand soluţia de substanta de referinţa corespunzătoare la extractul de proba pentru testare. 5.2.5. Estimare semi-cantitativă Se compara vizual intensitatea spoturilor pentru fiecare substanta identificata la 5.2.4. cu un şir adecvat de concentraţii al substanţelor de referinţa. Dacă concentraţia uneia sau a mai multor substanţe găsite în proba pentru testare este în exces, se dilueaza extractul de proba şi se repeta măsurarea. TABEL I Valori Rf şi culori obţinute imediat după pulverizare
┌---------┬-----------------------------------┬--------------------------------------------------┐
|Substante| Solventi de developare | Spray-uri indicatoare |
| de ├-----------------------------------+--------------------------------------------------┤
|referinta| Valori Rf | Culori rezultate |
| ├--------┬--------┬--------┬--------┼------------┬-----------┬------------┬------------┤
| (3.20) |(3.22.1)|(3.22.2)|(3.22.3)|(3.22.4)| Diazo | Ehrlich |Dimetilfenol| AgNO |
| | | | | | (3.23.1) | (3.23.2) | (323.3) | (3.23.4) |
├---------+--------+--------+--------+--------+------------+-----------+------------+------------┤
|OPD |0,62 |0,60 |0,30 |0,57 |maro pal |- |- |maro pal |
+---------+--------+--------+--------+--------+------------+-----------+------------+------------+
|MPD |0,40 |0,60 |0,47 |0,48 |maro-violet |galben |maro pal |maro pal |
| | | | | |(*) | | | |
+---------+--------+--------+--------+--------+------------+-----------+------------+------------+
|PPD |0,20 |0,50 |0,30 |0,48 |Maro |rosu aprins|violet |gri |
| | | | | | |(*) | | |
+---------+--------+--------+--------+--------+------------+-----------+------------+------------+
|OTD |0,60 |0,60 |0,53 |0,60 |maro (*) |oranj pal |maro pal |maro cenusiu|
+---------+--------+--------+--------+--------+------------+-----------+------------+------------+
|MTD |0,40 |0,67 |0,45 |0,60 |maro |galben |maro |negru |
| | | | | |rosiatic (*)| | | |
+---------+--------+--------+--------+--------+------------+-----------+------------+------------+
|PTD |0,33 |0,65 |0,37 |0,70 |Maro |oranj |violet (*) |gri |
+---------+--------+--------+--------+--------+------------+-----------+------------+------------+
|DAP |0,07 |- |0 |0,05 |maro (*) |oranj |violet |maro |
+---------+--------+--------+--------+--------+------------+-----------+------------+------------+
|H |0,50 |0,35 |0,80 |0,20 |- |oranj |violet |negru (*) |
+---------+--------+--------+--------+--------+------------+-----------+------------+------------+
|alfa-N |0,90 |0,80 |0,90 |0,75 |maro-oranj |- |violet (*) |negru |
+---------+--------+--------+--------+--------+------------+-----------+------------+------------+
|P |0,37 |- |0,67 |0,05 |maro |violet |maro |maro (*) |
| | | | | | |foarte pal |foarte pal | |
+---------+--------+--------+--------+--------+------------+-----------+------------+------------+
|R |0,50 |0,37 |0,80 |0,17 |oranj (*) |violet pal |maro |maro pal |
| | | | | | | |foarte pal | |
├---------+--------+--------+--------+--------+------------+-----------+------------+------------┤
|Nota |
|1. OPD este indicat numai slab; solventul (3.22.3) trebuie sa fie folosit pentru a-l separa clar|
| de OTD |
|2. (*) Indica developarea celei mai bune culori. |
└------------------------------------------------------------------------------------------------┘
6. EXAMINARE PRIN CROMATOGRAFIE IN STRAT SUBTIRE BIDIMENSIONALA Acest procedeu de cromatografie în strat subtire necesita folosirea unor substanţe, reactivi şi soluţii de referinţa suplimentare. 6.1. Substanţe şi soluţii de referinţa suplimentare 6.1.1. beta-naftol (beta-N) 6.1.2. 2-aminofenol (OAP) 6.1.3. 3-aminofenol (MAP) 6.1.4. 4-aminofenol (PAP) 6.1.5. 2-nitro-1,4-fenilendiamina (2-NPPD) 6.1.6. 4-nitro-1,2-fenilendiamina (4-NOPD) Se prepara o soluţie 0,5% (m/v) din fiecare substanta de referinţa suplimentară conform descrierii de la 3.21. 6.2. Solvent de developare suplimentar 6.2.1. Acetat de etil-ciclohexan - soluţie de amoniac 25% (65:30:0,5 volumetric) 6.3. Sistem de developare suplimentar Se pune un vas de sticla într-un tanc de developare pentru cromatografia în strat subtire, se adauga cca. 2 g iod cristalizat şi se acoperă vasul cu un capac potrivit. 6.4. Cromatografiere 6.4.1. Se traseaza doua linii, asa cum se arata în Figura 1, pe suprafaţa absorbanta a unei plăci în strat subtire (4.1.3). 6.4.2. Sub atmosfera de azot (4.1.1), se pun 1 pana la 4 æl extract (5.1) la punctul de baza 1 (Figura 1) care este la 2 cm fata de cele doua laturi. Cantitatea de extract depinde de intensitatea spoturilor de pe cromatogramele 5.2 6.4.3. Se împart între punctele 2 şi 3 (fig. 1) colorantii de oxidare identificati sau presupusi a fi identificati la 5.2. (distanta între puncte 1,5 cm). Se pun 2 æl din fiecare soluţie de referinţa - cu excepţia DAP din care trebuie puşi 6 æl. Se operează în atmosfera de azot (6.4.2) 6.4.4. Se repeta operaţia de la 6.4.3. la punctele de baza 4 şi 5 (Figura 1) şi se păstrează placa sub atmosfera de azot pana în momentul în care este cromatografiata (distanta între puncte 1,5 cm). 6.4.5. Se sufla cu azot tancul cromatografic (3.8) şi se pune în acesta o cantitate adecvată de solvent de developare 3.22.2. Se pune placa (6.4.4) în tanc şi se developeaza în prima direcţie de elutie (Figura 1), la intuneric. Se elueaza pana când frontul de solvent atinge linia marcata pe placa (aproximativ 13 cm). 6.4.6. Se scoate placa din tanc şi se plaseaza în tancul cromatografic anterior suflat cu azot pentru evaporarea solventului de elutie pentru cel puţin 60 de minute. 6.4.7. Cu o eprubeta gradata, se pune o cantitate adecvată de solvent de elutie (6.2) într-un tanc suflat cu azot (3.8), se pune placa rotita cu 90° în tanc (6.4.6) şi se cromatografiaza în a doua direcţie (de asemenea în intuneric) pana când frontul de solvent atinge linia desenată pe suprafaţa absorbenta. Se scoate placa din tanc şi se evapora solventul de elutie în aer. 6.4.8. Se pune placa pentru 10 minute în tancul cromatografic cu vapori de iod (6.3) şi se interpretează cromatograma bidimensionala folosind valorile Rf şi valorile culorilor ale substanţelor de referinţa cromatografiate în acelaşi timp (Tabelul II este un ghid al valorilor Rf şi al culorilor). Nota: ----- Pentru a obţine colorare maxima a spoturilor se lasa cromatograma expusă în atmosfera timp de 30 minute după developare. 6.4.9. Prezenta coloranţilor de oxidare gasiţi la 6.4.8 poate fi confirmată definitiv prin repetarea operaţiilor descrise de la 6.4.1 la 6.4.8 şi adaugand la punctul de baza 1 în vârful cantităţii de extract specificate la 6.4.2 1 æl din substanţele de referinţa identificate la 6.4.8. Dacă nu se găseşte nici un alt punct în comparaţie cu cromatograma obţinută la 6.4.8, interpretarea cromatogramei 6.4.8 este corecta. TABEL II Culoarea substanţelor de referinţa după cromatografiere şi developare cu vapori de iod
┌──────────────────────┬────────────────────────────────────────┐
│Substanţe de referinţa│Culoare după developare cu vapori de iod│
├──────────────────────┼────────────────────────────────────────┤
│ R │ bej │
├──────────────────────┼────────────────────────────────────────┤
│ P │ maro │
├──────────────────────┼────────────────────────────────────────┤
│ alfa-N │ violet │
├──────────────────────┼────────────────────────────────────────┤
│ beta-N │ maro pal │
├──────────────────────┼────────────────────────────────────────┤
│ H │ maro-violet │
├──────────────────────┼────────────────────────────────────────┤
│ MPD │ maro galbui │
├──────────────────────┼────────────────────────────────────────┤
│ PPD │ maro-violet │
├──────────────────────┼────────────────────────────────────────┤
│ MTD │ maro închis │
├──────────────────────┼────────────────────────────────────────┤
│ PTD │ maro galbui │
├──────────────────────┼────────────────────────────────────────┤
│ DAP │ maro închis │
├──────────────────────┼────────────────────────────────────────┤
│ OAP │ oranj │
├──────────────────────┼────────────────────────────────────────┤
│ MAP │ maro galbui │
├──────────────────────┼────────────────────────────────────────┤
│ PAP │ maro-violet │
├──────────────────────┼────────────────────────────────────────┤
│ 2-NPPD │ maro │
├──────────────────────┼────────────────────────────────────────┤
│ 4-NOPD │ oranj │
└──────────────────────┴────────────────────────────────────────┘
Figura 1 ANEXA 11 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU NITRITI IN PRODUSELE COSMETICE A. IDENTIFICARE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta metoda este adecvată pentru identificarea azotitului în produsele cosmetice, în particular în creme şi paste. 2. PRINCIPIU Prezenta azotitului este indicată prin formarea de derivaţi colorati cu fenilhidrazona 2-aminobenzaldehidei. 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 3.1. Acid sulfuric diluat: se dilueaza 2 ml acid sulfuric concentrat [d(4)^2 [] = 1,84] cu 11 ml apa distilata. 3.2. Acid clorhidric diluat: se dilueaza 1 ml acid clorhidric concentrat [d(4)^2 [] = 1,19] cu 11 ml apa distilata. 3.3. Metanol 3.4. O soluţie de 2-aminobenzaldehida fenilhidrazona (reactiv Nitrin (R)) în metanol Se cantaresc 2,0 g de Nitrin (R) şi se transfera cantitativ într-un balon cotat de 100 ml. Se adauga cu picatura 4 ml acid clorhidric diluat (3.2) şi se amesteca. Se umple pana la semn cu metanol şi se amesteca pana când soluţia devine complet clara. Se depozitează soluţia într-un flacon de sticla maro (4.3). 4. APARATURA 4.1. Pahare de laborator, 50 ml 4.2. Balon cotat, 100 ml 4.3. Flacon de sticla maro, 125 ml 4.4. Sticla de ceas, 10 x 10 cm 4.5. Spatule de plastic 4.6. Hârtie de filtru, 10 x 10 cm 5. PROCEDEU 5.1. Se întinde uniform o parte din proba pe sticla de ceas (4.4), stratul ce acoperă suprafaţa nedepasind 1 cm. 5.2. Se uda hârtia de filtru (4.6) cu apa distilata. Se aseaza peste proba şi se preseaza hârtia de filtru cu spatula de plastic (4.5) 5.3. Se lasa un minut şi se aplica pe centrul hârtiei de filtru: - 2 picaturi de acid sulfuric diluat (3.1) - urmate de 2 picaturi soluţie de Nitrin (R) (3.4) 5.4. După 5 - 10 secunde, se indeparteaza hârtia de filtru şi se examinează la lumina naturala. Prezenta azotitului este indicată prin coloratia purpuriu rosiatica. Dacă conţinutul de azotit este scăzut, coloratia purpuriu rosiatica devine galbena după 5-15 secunde. Aceasta schimbare de culoare are loc numai după 1-2 minute, atunci când cantitatea de azotit prezent este mare. 6. OBSERVATIE Intensitatea culorii purpuriu rosiatice şi durata de timp înainte de modificarea în galben ne poate da o indicaţie asupra conţinutului de azotit în amestec. B. DETERMINARE 1. SCOP Metoda descrie determinarea azotitului în produsele cosmetice. 2. DEFINIŢIE Conţinut de azotit în proba, determinat conform aceastei metode, este exprimat în % masice de azotit de sodiu. 3. PRINCIPIU După diluarea probei în apa şi limpezire, azotitul prezent este făcut sa reactioneze cu sulfonilamida şi N-1-naftiletilendiamina şi se măsoară densitatea optica a culorii obţinute, la 538 nm. 4. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie calitativ analitic. 4.1. Reactivi de limpezire: aceşti reactivi nu pot fi folosiţi la mai mult de 1 saptamana de la preparare. 4.1.1. Reactiv Carrez I: Se dizolva 106 g hexacianoferat de potasiu (II) K(4)Fe(CN)(6) ● 3 H(2)O, în apa distilata şi se dilueaza cu apa pana la 1000 ml. 4.1.2. Reactiv Carrez II: Se dizolva 299,5 g acetat de zinc, Zn[CH(3)COO](2) ● 2H(2)O şi 30 ml acid acetic glacial în apa distilata şi apoi se dilueaza cu apa pana la 1000 ml. 4.2. Soluţie de azotit de sodiu: Într-un balon cotat de 1000 ml se dizolva 0,500 g azotit de sodiu în apa distilata şi se dilueaza cu apa pana la semn. Se dilueaza 10,0 ml din aceasta soluţie standard stoc pana la 500 ml; 1 ml din acesta ultima soluţie = 10 micrograme de NaNO(2). 4.3. Soluţie de hidroxid de sodiu 1 N 4.4. Soluţie de clorhidrat de sulfanilamida 0,2% Se dizolva 2,0 g sulfanilamida în 800 ml apa la cald. Se raceste şi se adauga 100 ml acid clorhidric concentrat agitandu-se în acest timp. Se adauga apa pana la 1000 ml. 4.5. Acid clorhidric 5 N 4.6. Reactiv N-1-naftil: Aceasta soluţie trebuie preparata în ziua în care se foloseşte. Se dizolva 0,1 g diclorhidrat de N-1-naftiletilendiamina în apa şi se dilueaza cu apa pana la 100 ml. 5. APARATURA 5.1. Balanţa analitica 5.2. Baloane cotate de 150, 250, 500 şi 1000 ml 5.3. Pipete gradate sau de gaze 5.4. Cilindrii gradati de 100 ml 5.5. Hârtie de filtru cutata, fără azotit, diametru 15 cm 5.6. Baie de apa 5.7. Spectofotometru cu cuva optica de lungime de cale 1 cm 5.8. pH-metru 5.9. Microbiureta, 10 ml 5.10. Pahare de laborator, 250 ml. 6. PROCEDEU 6.1. Se cantaresc cu o precizie de 0,1 mg cca. 0,5 g ("m" grame) proba pentru testare omogenizata, se transfera cantitativ cu apa distilata fierbinte într-un pahar de 250 ml (5.10) şi se completează cu apa distilata fierbinte pana la 150 ml. Se pune paharul (5.10) în baia de apa (5.6) la 80°C pentru jumătate de ora. In aceasta perioada, conţinutul se agita din când în când. 6.2. Se raceste la temperatura camerei şi se adauga succesiv, sub agitare, 2 ml reactiv Carrez I (4.1.1.) şi 2 ml reactiv Carrez II (4.1.2). 6.3. Se adauga soluţie de hidroxid de sodiu 1 N (4.3) pentru a aduce pH-ul la 8,3 (se foloseşte pH-metrul (5.8)). Se transfera cantitativ conţinutul într-un balon cotat de 250 ml (5.2) şi se aduce la semn cu apa distilata. 6.4. Se amesteca conţinutul şi se filtreaza prin hârtie de filtru cutata (5.5). 6.5. Se pune cu pipeta într-un balon cotat de 100 ml (5.2) o porţiune adecvată ("V" ml) de filtrat limpede, dar nu mai mult de 25 ml, şi se adauga apa distilata pana la un volum de 60 ml. 6.6. După amestecare, se adauga 10,0 ml soluţie hidroclorura de sulfanilamida (4.4) şi 6,0 ml de acid clorhidric 5 N (4.5). Se amesteca şi se lasa sa stea 5 minute. Se adauga 2,0 ml reactiv N-1-naftil (4.6), se amesteca şi se lasa sa stea 3 minute. Se dilueaza cu apa pana la semn şi se amesteca. 6.7. Se prepara un test orb prin repetarea operaţiilor 6.5 şi 6.6 fără adăugarea reactivului N-1-naftil. 6.8. Se măsoară (5.7) densitatea optica la 538 nm a soluţiei obţinute la 6.6 folosind soluţia oarba (6.7) ca referinţa. 6.9. Se citeşte de pe graficul de etalonare (6.10) conţinutul de azotit de sodiu în micrograme per 100 ml de soluţie ("m(1)" micrograme) care corespunde densităţii optice măsurate la (6.8). 6.10. Folosind 10 æg per ml soluţie azotit de sodiu (4.2), se realizează un grafic de etalonare pentru concentraţiile 0, 20, 40, 60, 80, 100 ug de azotit de sodiu per 100 ml. 7. CALCUL Se calculează conţinutului de azotit de sodiu din proba, în procente masice, folosind următoarea formula:
250 100 m(1)
% NaNO(2) = ───── x m(1) x 10^-6 x ───── = ────────────
V m V x m x 40
în care: m = masa probei pentru testare, în grame, luate pentru analiza (6.1) m(1) = conţinutul de azotit de sodiu, în micrograme, găsit la 6.9 V = număr de mililitri de filtrat folosit pentru măsurătoare (6.5) 8. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de cca. 0,2 % m/m azotit de sodiu, diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceiaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,005%. ANEXA 12 METODA DE DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU REZORCINOL DIN PRODUSELE PENTRU ÎNGRIJIREA PARULUI 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta este metoda reglementată pentru determinarea rezorcinolului în sampoane şi lotiuni de par prin cromatografiere de gaze. Metoda este adecvată pentru concentraţii de la 0,1 la 2,0% procente masice în proba. 2. DEFINIŢIE Conţinutul de rezorcinol din proba pentru testare determinat conform acestei metode este exprimat în procente masice. 3. PRINCIPIU Rezorcinolul şi 3,5-dihidroxitoluenul, (5-metilrezorcinol) adăugat ca standard intern, sunt separate de proba prin cromatografiere în strat subtire. Amândoi componenţii sunt izolati prin decuparea spoturilor de pe placa de strat subtire şi extragerea cu metanol. In final compuşii extrasi sunt uscati, sililati şi determinaţi prin cromatografiere de gaze. 4. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 4.1. Acid clorhidric 25% (m/m). 4.2. Metanol 4.3. Etanol 96% (v/v) 4.4. Plăci de strat subtire cu silicagel pentru cromatografie în strat subtire gata preparate (din plastic sau aluminiu) cu indicator fluorescent. Se dezactiveaza după cum urmeza: se pulverizeaza plăcile preacoperite cu silice cu apa pana se glazureaza. Se lasa plăcile pulverizate sa se usuce în aer la temperatura camerei pentru una pana la trei ore. Nota: ----- Dacă plăcile nu sunt dezactivate se pot produce pierderi de rezorcinol prin adsorbtia ireversibila pe silice. 4.5. Solvent de developare; acetona - cloroform - acid acetic (20:75:5 volumetric) 4.6. Soluţie standard de rezorcinol; se dizolva 400 mg rezorcinol în 100 ml etanol 96% (4.3) (1 ml corespunde la 4000 æg rezorcinol). 4.7. Soluţia standard intern: se dizolva 400 mg 3,5-dihidroxitoluen (DHT) în 100 ml etanol 96% (4.3) (1 ml corespunde la 4000 æg DHT). 4.8. Amestec standard: într-un balon cotat de 100 ml se amesteca 10 ml soluţie 4.6 şi 10 ml soluţie 4.7, se aduce la semn cu etanol 96% (4.3) şi se amesteca (1 ml corespunde la 400 æg rezorcinol şi 400 æg DHT). 4.9. Agenţi de sililare 4.9.1. N, O-bi (trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA) 4.9.2. Hexametildisilazan (HMDS) 4.9.3. Trimetilclorosilan (TMCS) 5. APARATURA 5.1. Echipament uzual pentru cromatografia în strat subtire şi cromatografia de gaze 5.2. Sticlarie de laborator 6. PROCEDEU 6.1. Prepararea probei 6.1.1. Într-un pahar de 150 ml se cântăreşte cu precizie o proba pentru testare ("m" grame) din produs care conţine cca. 20 pana la 50 mg rezorcinol. 6.1.2. Se acidifica cu acid clorhidric (4.1) pana când amestecul este acid (cca. 2 pana la 4 ml), se adauga 10 ml (40 mg DHT) soluţie standard intern (4.7) şi se amesteca. Se transfera cu etanol (4.3) într-un balon cotat de 100 ml, se aduce la semn cu etanol şi se amesteca. 6.1.3. Se aplica 250 æl soluţie (6.1.2) pe o folie de silice dezactivata (4.4) sub forma de linie continua de aproximativ 8 cm lungime. Trebuie avut grija ca linia sa fie cat mai subtire posibil. 6.1.4. Se aplica 250 æl amestec standard (4.8) pe aceeaşi placa şi în acelaşi mod (6.1.3). 6.1.5. Se picura pe doua puncte de pe linia de pornire câte 5 æl din fiecare dintre soluţiile 4.6 şi 4.7 pentru a ajuta la localizare după developarea placii. 6.1.6. Se developeaza placa într-un tanc necaptusit (nesaturat) umplut cu solvent de developare 4.5 pana când frontul de solvent a atins 12 cm de la linia de pornire; de obicei aceasta durează 45 minute. Se usucă placa în aer şi se localizeaza zona de rezorcinol/DHT sub lumina UV (254 nm). Cei 2 componenţi au aproximativ aceleaşi valori Rf. Se marchează benzile cu creionul la 2 mm distanta de limita întunecată exterioară a benzilor. Se indeparteaza aceste zone şi se colectează adsorbantul fiecărei benzi într-un flacon de 10 ml. 6.1.7. Se extrage adsorbantul conţinând proba şi cel ce conţine amestecul standard, fiecare în modul următor: Se adauga 2 ml metanol (4.2) şi se extrage timp de o ora sub agitare continua. Se filtreaza amestecul şi se repeta extracţia timp de alte 15 minute cu 2 ml metanol. 6.1.8. Se combina extractele şi se evapora solventul prin uscare peste noapte într-un exsicator cu vid umplut cu desicant adecvat. Nu se incalzeste deloc. 6.1.9. Se silileaza reziduurile (6.1.8) conform 6.1.9.1. sau 6.1.9.2. 6.1.9.1. Cu o microseringa se adauga peste amestec 200 æl BSTFA (4.9.1) şi se lasa 12 ore într-un vas închis la temperatura camerei. 6.1.9.2. Cu o microseringa se adauga 200 æl HMDS (4.9.2) şi 100 æl TMCS (4.9.3) şi se incalzeste amestecul timp de 30 minute la 60°C într-un vas închis. Se raceste amestecul. 6.2. Cromatografiere de gaze 6.2.1. Condiţii de cromatografiere Coloana trebuie sa realizeze o rezoluţie, R, egala sau mai buna decât 1,5, unde:
2d' [r(2) -r(1)]
R = ────────────────
W(1) - W(2)
în care: r(1) şi r(2) - timpii de retenţie, în minute, a doua picuri W(1) şi W(2) = lăţimea aceloraşi picuri la jumătatea inaltimii, în mm d' = viteza inregistratorului graficului, în mm per minut. S-au găsit adecvate următoarele condiţii pentru cromatografia de gaze şi coloana: a.) Coloana: material: oţel inoxidabil lungime: 200 cm diametrul intern aprox. 3 mm umplutura: 10% OV -17 pe Chromosorb WAW 100 pana la 200 mesh b.) Detector cu ionizate în flacara c.) Temperaturi: coloana: 185°C (izoterma) detector: 250°C injector: 250°C d.) Gaz purtător: azot debit: 45 ml/min Pentru reglarea debitelor de hidrogen şi aer se vor urma instrucţiunile producătorului. 6.2.2. Se injecteaza 1 pana la 3 æl din soluţiile obţinute la 6.1.9 în cromatograful de gaze. Se efectuează 5 injectari pentru fiecare soluţie (6.1.9), se măsoară suprafatele picului, se face media acestora şi se calculează proporţia suprafeţei picului: S = suprafaţa picului de rezorcinol/suprafaţa picului DHT. 7. CALCUL Concentraţia de rezorcinol din proba, exprimată în % de masa (% m/m), este data de:
4 S(proba)
% rezorcinol = ─── x ─────────────────────
M S(amestec standard)
în care: M = proba pentru testare în grame (6.1.1) S(proba) = proporţia suprafeţei picului medie conform 6.2.2 pentru soluţia proba S(amestec standard) = proporţia suprafeţei picului medie conform 6.2.2 pentru amestecul standard 8. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de rezorcinol de cca. 0,5% diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceiaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,025%. ANEXA 13 METODA DE DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU METANOL FATA DE ETANOL SAU 2-PROPANOL 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta metoda reglementează analiza prin cromatografie de gaze a metanolului în toate tipurile de produse cosmetice (inclusiv produse pulverizate ca aerosoli). Pot fi determinate nivele relative de 0 pana la 10%. 2. DEFINIŢIE Conţinutul de metanol determinat conform aceastei metode este exprimat în % masice de metanol fata de etanol sau 2-propanol. 3. PRINCIPIU Determinarea se realizează prin cromatografie de gaze. 4. REACTIVI Toţi reactivii sunt de puritate analitica. 4.1. Metanol 4.2. Etanol absolut 4.3. 2-propanol 4.4. Cloroform, liber de alcooli prin spalare cu apa 5. APARATURA 5.1. Cromatograf de gaze: - cu detector catarometru pentru probele cu aerosoli - cu detector cu ionizare cu flacara pentru probele non-aerosoli 5.2. Baloane cotate, 100 ml 5.3. Pipete, 2 ml, 20 ml, 0 pana la 1 ml 5.4. Microseringi 0 pana la 100 æl şi 0 pana la 5 æl şi (numai pentru probele cu aerosoli) seringi de gaz sub presiune cu robinet cu sertar (vezi metoda pentru prepararea probei pentru testare, Fig. 5 din Anexa nr. 3 la prezentul Ordin.) 6. PROCEDEU 6.1. Preparare proba 6.1.1. Produselor pulverizate ca aerosoli li se preleveaza probe conform metodei pentru prepararea probei pentru testare, pct. 5 din Anexa 3 la prezentul Ordin, şi apoi se analizează prin cromatografie de gaze în condiţiile de la punctul 6.2.1. 6.1.2. Produselor non-aerosoli li se preleveaza probe conform Anexei nr. 3 la prezentul Ordin, se dilueaza cu apa pana la un nivel de 1 pana la 2% etanol sau 2-propanol, şi apoi se analizează prin cromatografie de gaze în condiţiile de la punctul 6.2.2. 6.2. Cromatografiere de gaze 6.2.1. Pentru probele cu aerosoli se foloseşte detector catarometru. 6.2.1.1. Coloana este umpluta cu 10% Hallcomid M18 pe Chromosorb WAW cu 100-200 mesh. 6.2.1.2. Coloana trebuie sa realizeze o rezoluţie, R, egala sau mai buna decât 1,5, unde:
d'r(2) - d'r(1)
R = 2 ────────────────
W(1) + W(2)
în care: r(1) şi r(2) = timpii de retenţie în minute pentru doua picuri, W(1) şi W(2) = lăţimea aceloraşi picuri la jumătatea inaltimii în mm, d' = viteza de înregistrare a graficului, în mm per minut. 6.2.1.3. Următoarele condiţii permit atingerea acestei rezoluţii: Coloana material: oţel inoxidabil lungime: 3,5 m diametru: 3 mm Curent punte catarometru: 150 mA Gaz purtător: heliu presiune: 2,5 bar debit: 45 ml/min. Temperaturi: injector: 150°C detector: 150°C incalzitor coloana: 65°C Măsurarea suprafeţelor picurilor poate fi imbunatatita prin integrare electronica. 6.2.2. Pentru probele fără aerosoli 6.2.2.1. Coloana se umple cu Chromosorb 105 sau Porapak QS şi se foloseşte un detector cu ionizare în flacara. 6.2.2.2. Coloana trebuie sa realizeze o rezoluţie, R, egala sau mai buna decât 1,5 unde:
d'r(2) - d'r(1)
R = 2 ────────────────
W(1) + W(2)
în care: r(1) şi r(2) = timpii de retenţie în minute pentru doua picuri, W(1) şi w(2) = lăţimea aceloraşi picuri la jumătatea inaltimii în mm, d' = viteza de înregistrare a graficului în mm per minut. 6.2.2.3. Condiţiile care permit obţinerea acestei rezoluţii sunt: Coloana material: oţel inoxidabil lungime: 2 m diametru: 3 mm Senzitivitate electrometru: 8 x 10^-1 [] A Gaze: purtător: azot presiune: 2,1 bar debit: 40 ml/min auxiliar: hidrogen presiune: 1,5 bar debit: 20 ml/min Temperaturi: injector: 150°C detector: 230°C incalzitor coloana: 120 la 130°C 7. GRAFIC STANDARD 7.1. Pentru procedeul cromatografie de gaze 6.2.1 (coloana Hallcomid M18) se folosesc următoarele amestecuri standard. Aceste amestecuri se prepara prin măsurare cu pipeta, dar se determina cantitatea exactă prin cântărirea imediata a pipetei sau flaconului după fiecare adăugare.
┌────────────┬───────┬──────────┬──────────────┐
│Concentraţie│Metanol│Etanol sau│ Cloroform │
│ relativă │ (ml) │2-propanol│ adăugat pana │
│ (m/m %) │ │ (ml) │la un volum de│
├────────────┼───────┼──────────┼──────────────┤
│cca. 2,5% │ 0,5 │ 20 │ 100 ml │
├────────────┼───────┼──────────┼──────────────┤
│cca. 5,0% │ 1,0 │ 20 │ 100 ml │
├────────────┼───────┼──────────┼──────────────┤
│cca. 7,5% │ 1,5 │ 20 │ 100 ml │
├────────────┼───────┼──────────┼──────────────┤
│cca. 10,0% │ 2,0 │ 20 │ 100 ml │
└────────────┴───────┴──────────┴──────────────┘
Se injecteaza 2 - 3 æl în cromatograf folosind condiţiile de la 6.2.1. Se calculează raportul suprafeţelor picurilor (metanol/etanol) sau (metanol/2-propanol) pentru fiecare amestec. Se traseaza graficul standard folosind: Axa X: % metanol fata de etanol sau 2-propanol Axa Y: raport suprafeţe picuri (metanol/etanol) sau (metanol/2-propanol) 7.2. Pentru procedeul cromatografie de gaze 6.2.2 (Porapac QS sau Chromosorb 105) se folosesc următoarele amestecuri standard. Aceste amestecuri se prepara prin măsurare cu pipeta, dar se determina cantitatea exactă prin cântărirea imediata a pipetei sau flaconului după fiecare adăugare.
┌────────────┬───────┬──────────┬────────────┐
│Concentraţie│Metanol│Etanol sau│Apa adăugată│
│ relativă │ >l │2-propanol│ pana la un │
│ (m/m %) │ │ (ml) │ volum de │
├────────────┼───────┼──────────┼────────────┤
│ cca. 2,5% │ 50 │ 2 │ 100 ml │
├────────────┼───────┼──────────┼────────────┤
│ cca. 5,0% │ 100 │ 2 │ 100 ml │
├────────────┼───────┼──────────┼────────────┤
│ cca. 7,5% │ 150 │ 2 │ 100 ml │
├────────────┼───────┼──────────┼────────────┤
│ cca. 10,0% │ 200 │ 2 │ 100 ml │
└────────────┴───────┴──────────┴────────────┘
Se injecteaza 2 - 3 æl în cromatograf folosind condiţiile de la 6.2.2. Se calculează raportul suprafeţelor picurilor (metanol/etanol) sau (metanol/2-propanol) pentru fiecare amestec. Se traseaza graficul standard folosind: Axa X: % metanol fata de etanol sau 2-propanol Axa Y: raport suprafeţe picuri (metanol/etanol) sau (metanol/2-propanol) 7.3. Graficul standard trebuie sa fie o linie dreapta. 8. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de metanol de 5% fata de etanolul sau 2-propanol diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel nu trebuie sa depăşească 0,25%. ANEXA 14 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU FORMALDEHIDA LIBERA 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta metoda este reglementată pentru identificare şi doua determinări în conformitate cu prezenta sau absenta donorilor de formaldehida. Este aplicabilă la toate produsele cosmetice. 1.1. Identificare 1.2. Determinare generală prin colorimetria cu pentan-2,4-diona Aceasta metoda se aplica când formaldehida este utilizata singura sau împreună cu alţi conservanţi care nu sunt donori de formaldehida. Când nu se intalneste aceasta situaţie, sau dacă rezultatul depăşeşte concentraţia maxima admisă, trebuie folosită următoarea metoda de confirmare. 1.3. Determinare în prezenta donorilor de formaldehida In metoda menţionată mai sus (1.2), în timpul procesului de derivatizare, donorii de formaldehida se desfac şi conduc la rezultate care sunt prea mari (formaldehida combinată şi polimerizata). Este necesară separarea formaldehidei libere prin cromatografia de lichide. 2. DEFINIŢIE Conţinutul de formaldehida libera al probei determinat în conformitate cu aceasta metoda este exprimat în procente de masa. 3. IDENTIFICARE 3.1. Principiu In mediu de acid sulfuric, formaldehida libera şi combinată coloreaza reactivul Schiff în roz sau mov. 3.2. Reactivi Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica iar apa trebuie sa fie demineralizata 3.2.1. Fucsina 3.2.2. Sulfit de sodiu hidratat cu 7H(2)O 3.2.3. Acid clorhidric concentrat (d = 1,19) 3.2.4. Acid sulfuric, cca. 1 M 3.2.5. Reactivul Schiff: Se cantaresc într-un pahar de laborator 100 mg fucsina (3.2.1.) şi se dizolva în 75 ml apa la 80°C. După răcire, se adauga 2,5 g sulfit de sodiu (3.2.2.). Se completează pana la 100 ml. Se utilizează în interval de doua săptămâni. 3.3. Procedeu 3.3.1. Într-un pahar de 10 ml se cantaresc 2 g de proba. Se adauga doua picaturi de acid sulfuric (3.2.4) şi 2 ml de reactiv Schiff (3.2.5). Când este folosit reactivul trebuie sa fie absolut incolor. Se agita şi se lasa sa stea cinci minute. 3.3.2. Dacă în interval de cinci minute se observa o tenta roz sau mov, formaldehida este prezenta în exces de 0,01% şi va fi determinata prin metoda libera sau combinată (4) si, dacă este necesar, prin procedura (5). 4. DETERMINARE GENERALĂ PRIN COLORIMETRIA PENTAN-2,4-DIONEI 4.1. Principiu Formaldehida reactioneaza cu pentan-2,4-diona, în prezenta acetatului de amoniu, şi formează 3,5-diacetil-1,4-dihidrolutidina. Aceasta este extrasa cu 1-butanol şi absorbanta extractului este masurata la 410 nm. 4.2. Reactivi Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica iar apa trebuie sa fie demineralizata 4.2.1. Acetat de amoniu anhidru 4.2.2. Acid acetic concentrat d(4)^2 [] = 1,05 4.2.3. Pentan 2,4-diona proaspăt distilata la presiune redusă 25 mm Hg la 25° - nu trebuie sa absoarba la 410 nm 4.2.4. 1-Butanol 4.2.5. Acid clorhidric, 0,1 M 4.2.6. Acid clorhidric, cca. 0,1 M 4.2.7. Hidroxid de sodiu, 1 M 4.2.8. Soluţie de amidon proaspăt preparata, în conformitate cu European Pharmacopoeia (1 g/50 ml apa), ediţia II-a 1980, part. I-VII-1-1 4.2.9. Formaldehida 37 - 40% m/v 4.2.10. Soluţie de iod standard, 0,05 M 4.2.11. Soluţie de tiosulfat de sodiu standard, 0,1 M 4.2.12. Reactiv pentan-2,4-diona Într-un balon cotat de 1000 ml se dizolva: - 150 g acetat de amoniu (4.2.1) - 2 ml pentan-2,4-diona (4.2.3) - 3 ml acid acetic (4.2.2) Se completează cu apa pana la semn (pH-ul soluţiei cca. 6,4) Acest reactiv trebuie sa fie proaspăt preparat 4.2.13. Reactiv (4.2.12) fără pentan-2,4-diona 4.2.14. Standard formaldehida: soluţie stoc Într-un balon cotat se toarna 5 g de formaldehida (4.2.9) şi se completează cu apa pana la 1000 ml. Se determina concentraţia soluţiei după cum urmează: Se iau 10,00 ml; se adauga 25,00 ml de soluţie de iod standard (4.2.10) şi 10,00 ml soluţie hidroxid de sodiu (4.2.7). Se lasa sa stea 5 minute. Se acidifiaza cu 11,00 ml HCl (4.2.5) şi se determina excesul de iod cu soluţie de tiosulfat de sodiu standard (4.2.11), utilizând soluţie de amidon (4.2.8) ca indicator. 1 ml de iod 0,05 M (4.2.10) consumat este echivalent cu 1,5 mg formaldehida; 4.2.15. Standard formaldehida: soluţie diluata Se dilueaza soluţia stoc de formaldehida succesiv cu 1/20 şi apoi 1/100 cu apa. 1 ml din aceasta soluţie conţine cca. 1 æg de formaldehida. Se calculează conţinutul exact. 4.3. Aparatura 4.3.1. Aparatura standard de laborator 4.3.2. Filtru de separare de faze, Whatman 1 PS (sau echivalent) 4.3.3. Centrifuga 4.3.4. Baie de apa, reglata la 60°C 4.3.5. Spectrofotometru 4.3.6. Cuve de sticla cu cale optica de 1 cm 4.4. Procedeu 4.4.1. Soluţie proba Într-un balon cotat de 100 ml se cântăreşte cu precizie de 0,001 g o cantitate (în g) de proba pentru testare corespunzătoare unei presupuse cantităţi de formaldehida de cca. 150 ug. Se completează pana la 100 ml cu apa şi se amesteca (soluţie S). (Verificaţi pH-ul pentru a fi apropiat de 6, dacă nu, diluati cu soluţie de acid clorhidric (4.2.6)) Într-un pahar Erlenmayer de 50 ml se pun: - 10,00 ml soluţie S - 5,00 ml reactiv pentan-2,4-diona (4.2.12) - apa demineralizata pana la un volum final de 30 ml. 4.4.2. Soluţie de referinţa Posibilele interferente datorate culorii de fond a acest probei de test sunt eliminate prin utilizarea acestei soluţii de referinţa: Într-un pahar Erlenmayer de 50 ml se pun: - 10,00 ml soluţie S - 5,00 ml reactiv (4.2.13) - apa demineralizata pana la un volum final de 30 ml. 4.4.3. Test orb Într-un pahar Erlenmayer de 5,0 ml se pun: - 5,00 ml reactiv pentan-2,4-diona (4.2.12); - apa demineralizata pana la un volum final de 30 ml. 4.4.4. Determinare 4.4.4.1. Se agita amestecurile de 4.4.1, 4.4.2 şi 4.4.3. Se introduc paharele Erlenmayer într-o baie de apa la 60°C pentru exact 10 minute. Se lasa la racit într-o baie de apa cu gheaţa pentru doua minute. 4.4.4.2. Se transfera în palnii de separare de 50 ml conţinând 10 ml de butanol (4.2.4). Se clateste fiecare pahar cu 3 pana la 5 ml de apa. Se agita puternic amestecul exact 30 secunde. Se lasa sa se separe. 4.4.4.3. Se filtreaza faza de 1-butanol în cuvele de măsurare (4.3.2) printr-un filtru cu separare a fazelor. Poate fi de asemenea utilizata centrifugarea (3000 g(n) pentru cinci minute). 4.4.4.4. Se măsoară absorbanta A(2) a extractului soluţiei proba de la 4.4.1, fata de extractul soluţiei de referinţa 4.4.2., la 410 nm. 4.4.4.5. Similar se măsoară absorbanta A(2) a extractului soluţiei oarbe 4.4.3 fata de 1-butanol. N.B.: Toate aceste operaţii trebuie efectuate într-un interval de timp de 25 minute de când paharele Erlenmayer au fost introduse în baia de apa de 60°C. 4.4.5. Curba de etalonare 4.4.5.1. Într-un pahar Erlenmayer de 50 ml se pun: - 5,00 ml de soluţie standard diluata de la 4.2.15 - 5,00 ml de reactiv pentan-2,4-diona (4.2.12) - apa demineralizata pana la un volum final de 30 ml. 4.4.5.2. Se continua conform descrierii de la 4.4.4 şi se măsoară absorbanta fata de 1-butanol (4.2.4). 4.4.5.3. Se repeta procedura cu 10, 15, 20 şi 25 ml soluţie standard diluata (4.2.15) 4.4.5.4. Pentru a obţine valoarea de zero (corespunzătoare coloratiei reactivilor) se procedează ca în 4.4.4.5. 4.4.5.5. Se construieşte curba de etalonare după scăderea valorii de zero din fiecare din absorbantele obţinute în 4.4.5.1 şi 4.4.5.3. Legea lui Beer este valabilă pana la un conţinut de 30 ug formaldehida. 4.5. Calcul 4.5.1. Se scade A(2) din A(1) şi se citeşte din curba de etalonare (4.4.5.5) calitatea C, în æg, de formaldehida din soluţia proba (4.4.1) Se calculează conţinutul de formaldehida din proba (% m/m) cu ajutorul următoarei formule:
C
conţinut formaldehida în % = ─────────
10^3 x m
4.6. Repetabilitate (ISO 5725) Pentru un conţinut de formaldehida de 0,2%, diferenţa între rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceasi proba trebuie sa nu depăşească 0,005% pentru determinarea prin colorimetria cu pentan-2,4-diona. Dacă determinarea formaldehidei libere conduce la rezultate mai mari decât concentraţia maxima stipulată în Ordinul MSF nr. 1004/2000, de ex.: (a) între 0,005% şi 0,2% pentru un produs neetichetat; (b) mai mare decât 0,2% în produs, etichetat sau nu trebuie sa se aplice procedeul descris la punctul 5 5. DETERMINARE IN PREZENTA DONORILOR DE FORMALDEHIDA 5.1. Principiu Formaldehida separată este transformata într-un derivat lutidinic galben print-o reactie cu pentan-2,4-diona într-un reactor post-coloana şi derivatul obţinut este determinat prin absorbanta la 420 nm. 5.2. Reactivi Toţi reactantii trebuie sa fie de puritate analitica iar apa trebuie sa fie demineralizata. 5.2.1. Apa de puritate HPLC sau de calitate echivalenta 5.2.2. Acetat de amoniu anhidru 5.2.3. Acid acetic concentrat 5.2.4. Pentan-2,4-diona (pastrata la 4°C) 5.2.5. Fosfat disodic anhidru 5.2.6. Acid ortofosforic 85% (d = 1,7) 5.2.7. Metanol de puritate HPLC 5.2.8. Diclorometan 5.2.9. Formaldehida de 37 la 40% m/v 5.2.10. Hidroxid de sodiu, 1 M 5.2.11. Acid clorhidric, 1 M 5.2.12. Acid clorhidric, 0,002 M 5.2.13. Soluţie de amidon proaspăt preparata în conformitate cu European Pharmacopoeia (vezi 4.2.8) 5.2.14. Soluţie de iod standard, 0,05 M 5.2.15. Soluţie de tiosulfat de sodiu standard, 0,1 M 5.2.16. Faza mobila: Soluţie apoasă de fosfat disodic (5.2.5), 0,006 M reglata cu acid ortofosforic (5.2.6) la un pH de 2,1; 5.2.17. Reactiv post-coloana Într-un balon cotat de 1000 ml se dizolva: - 62,5 g acetat de amoniu (5.2.2) - 7,5 ml acid acetic; - 5 ml pentan-2,4-diona (5.2.4) Se completează pana la 1000 ml cu apa (5.2.1). Acest reactiv se păstrează ferit de lumina. Timp de conservare: maximum trei zile la 25°C. Nu trebuie sa se observe nici o schimbare de culoare. 5.2.18. Standard formaldehida: soluţie stoc. Într-un balon gradat de 1000 ml se toarna 10 g de formaldehida (5.2.9) şi se completează pana la 1000 ml cu apa. Se determina concentraţia soluţiei în modul următor: Se indeparteaza 5,00 ml; se adauga 25,00 ml de soluţie de iod standard (5.2.14) şi 10,00 ml de soluţie de hidroxid de sodiu (5.2.10). Se lasa sa stea cinci minute; Se acidifiaza cu 11,00 ml de HCl (5.2.11) şi se titreaza excesul de soluţie de iod standard cu soluţie de tiosulfat de sodiu (5.2.15), utilizând soluţie de amidon ca indicator. 1 ml de soluţie de iod (5.2.14) este echivalent cu 1,5 mg formaldehida; 5.2.19. Standard Formaldehida: soluţie diluata. Se dilueaza soluţia stoc la 1/100 din concentraţia sa iniţială în faza mobila (5.2.16). 1 ml din aceasta soluţie conţine cca. 37 mg formaldehida. Se calculează conţinutul exact. 5.3. Aparatura 5.3.1. Aparatura standard de laborator 5.3.2. Pompa HPLC, nepulsatorie 5.3.3. Pompa nepulsatorie de joasa presiune pentru reactiv (sau o a doua pompa HPLC). 5.3.4. Injector cu ventil de injecţie cu o bucla de 10 æl. Reactor post-coloana cu următoarele componente: + un balon cu trei gaturi de 11; + un dispozitiv de încălzire cu manta pentru balonul de 1 l; + doua coloane Vigreux cu minimum 10 talere, racite cu aer; + tub din oţel inoxidabil (pentru schimb de căldura) 1,6 mm - diametru interior 0,23 mm, lungime = 400 mm, + tub de teflon 1,6 mm - diametru interior 0,30 mm, lungimea 5 m ("French knitting"), vezi Anexa 1 + un teu fără volum mort (tip Valco sau echivalent) + trei racorduri fără volum mort Sau: Un modul post-coloana Applied Biosystems PCRS 520 sau echivalent echipat cu un reactor de 1-ml; 5.3.5. Filtru cu membrana, dimensiunea porilor 0,45 um. 5.3.6. Cartus SEP-PAC^R C(18), sau echivalent. 5.3.7. Coloane gata preparate: - Bischoff hypersil RP 18 (tip NC referinţa C25.46 1805) (5 æm, lungime = 250 mm, diametrul interior = 4,6 mm) - sau Dupont, Zorbax ODS (5 um, lungime = 250 mm, diametrul interior = 4,6 mm) - sau Phase SEP, spherisorb ODS 2 (5 um, lungime = 250 mm, diametrul interior = 4,6 mm). 5.3.8. Pre-coloana Bischoff K, hypersil RP 18 (referinţa K1 G 6301 1805) (5 æm, lungime = 10 mm, sau echivalent) 5.3.9. Coloana şi precoloana sunt conectate prin intermediul unui sistem Ecotube (referinţa A 15020508 Bischoff) sau echivalent. 5.3.10. Se asambleaza aparatura (5.3.5.) conform schemei bloc din Anexa 2 Conectorii de după injector trebuie sa fie cat mai scurti posibil, în acest caz, tubul de oţel inoxidabil dintre ieşirea reactorului şi intrarea detectorului raceste amestecul înaintea detectiei iar temperatura în detector este necunoscută dar constanta. 5.3.11. Detector vizibil - UV. 5.3.12. Inregistrator 5.3.13. Centrifuga. 5.3.14. Baie ultrasonica 5.3.15. Agitator vibrator (vortex sau echivalent). 5.4. Procedeu 5.4.1. Curba de etalonare Aceasta este obţinută prin construirea curbei inaltimilor picurilor ca funcţie a concentraţiei standard formaldehida: diluata. Se prepara soluţiile standard prin diluarea soluţiei de referinţa de formaldehida (5.2.19) cu faza mobila (5.2.16) - 1,00 ml de soluţie (5.2.19) diluata la 20,00 ml (cca. 185 æg/100 ml). - 2,00 ml de soluţie (5.2.19) diluata la 20,00 ml (cca. 370 æg/100 ml). - 5,00 ml de soluţie (5.2.19) diluata la 25,00 ml (cca. 740 æg/100 ml). - 5,00 ml de soluţie (5.2.19) diluata la 20,00 ml (cca. 925 æg/100 ml). Soluţiile standard sunt păstrate timp de o ora la temperatura laboratorului şi trebuie sa fie proaspăt preparate. Liniaritatea curbei de etalonare este buna pentru concentraţii între 1,00 şi 15,00 æg/ml. 5.4.2. Prepararea probelor. 5.4.2.1. Emulsii (creme, fond de ten, tus de ochi) Într-un flacon cu dop de 100 ml se cântăreşte cu o precizie 0,001 g o cantitate de proba ptr. testare (m grame) corespunzătoare unei presupuse cantităţi de 100 ug formaldehida. Se adauga 20,00 ml diclormetan (5.2.8.) şi 20,00 ml acid clorhidric (5.2.12), măsurate cu precizie. Se amesteca cu agitator vibrator (5.3.16) şi prin intermediul băii ultrasonice (5.3.15). Se separa cele doua faze prin centrifugare (3000 g^n timp de doua minute), între timp se spala un cartus (5.3.7) cu 2 ml metanol (5.2.7) apoi se condiţionează cu 5 ml apa (5.2.1). Se trec 4 ml din faza apoasă a extractului prin cartusul pregătit, se indeparteaza primii 2 ml şi se recuperează fractia următoare. 5.4.2.2. Lotiuni, sampoane Într-un flacon cu dop de 100 ml se cântăreşte cu o precizie 0,001 g o cantitate de proba pentru testare (m grame) corespunzătoare unei presupuse cantităţi de cca. 500 æg formaldehida. Se completează pana la 100 ml cu faza mobila (5.2.16). Se filtreaza soluţia printr-un filtru (5.3.6.) şi se injecteaza sau se trece printr-un cartus (5.3.7.) condiţionat ca mai sus (5.4.21). Toate soluţiile trebuie injectate imediat după preparare. 5.4.3. Condiţii de cromatografiere - Debitul fazei mobile: 1 ml/min - Debitul reactivului: 0,5 ml/min - Debitul total la ieşirea din detector: 1,5 ml/min - Volumul injectat: 10 æl - Temperatura elutiei: In cazul separarilor dificile, se introduce coloana într-o baie de gheaţa topita: se aşteaptă ca temperatura sa se stabilizeze (15-20 min) - Temperatura reacţiei post-coloana: 100°C; - Detecţie: 420 nm. N.B.: Întregul sistem cromatografic şi post-coloana trebuie spalate abundent cu apa după utilizare. Dacă sistemul nu este folosit mai mult de doua zile, aceasta spalare trebuie urmată de una cu metanol (5.2.7). Înainte de reconditionarea sistemului trebuie trecută apa prin el, pentru evitarea recristalizarii. 5.5. Calcul Emulsii: (5.4.2.1): Conţinut de formaldehida în % (m/m):
C x 10^-6 x 100 C x 10^-4
──────────────── = ──────────
5m 5m
Lotiuni, sampoane: In acest caz formula devine:
C x 10^-6 x 100 C x 10^-4
──────────────── = ──────────
m m
unde: m = masa probei de analizat, în g (5.4.2.1) c = concentraţia de formaldehida în æg/100 ml citită de pe curba de etalonare (5.4.1) 5.6. Repetabilitate (ISO 5725) Pentru un conţinut de 0,05% formaldehida diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceasi proba nu trebuie sa depăşească 0,001 %. Pentru un conţinut de 0,2% formaldehida diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceasi proba nu trebuie sa depăşească 0,005 %. ANEXA A INSTRUCŢIUNI PENTRU "FRENCH KNITTING" ACCESORII NECESARE - O bobina de lemn: diametrul exterior 5 cm cu un orificiu de 1,5 cm diametru prin centru. Se introduc 4 cuie din oţel (după cum se arata Fig. 1 şi 2). Distanta dintre doua cuie trebuie sa fie de 1,8 cm şi ele trebuie sa fie la 0,5 cm de orificiu. - Un ac rigid (de tipul crosetei) pentru a lega tubul de teflon. - Un tub de teflon de 1,6 mm, având diametrul interior de 0,3 mm şi lungimea 5 m. PROCEDEU Pentru a începe "French knitting", tubul de teflon trebuie pozitionat de la partea superioară a bobinei spre partea inferioară via orificiul central (lăsând în jur de 10 cm din tub sa iasa în afară la partea inferioară a bobinei, permitand lantului sa poată fi tras în timpul procesului); apoi se infasoara tubul în jurul celor patru cuie ca în Fig. 3. Părţile superioară şi inferioară ale "French knitting" vor fi protejate cu inele metalice şi suruburi de compresiune; trebuie avut grija sa nu se sparga teflonul când se trage tare. Se infasoara tubul în jurul fiecărui cui, pentru a doua oara şi se fac "impunsaturi" după cum urmează: - cu carligul se ridica tubul inferior peste tubul superior (vezi fig. 4). Se repeta acest proces pe fiecare dintre cele patru cuie în ordine (1, 2, 3, 4 în sens trigonometric), pana când se realizează 5 m sau lungimea dorita. Se lasa cca. 10 cm din tub pentru a închide lantul. Se poziţionează tubul prin fiecare dintre cele patru bucle şi se trage uşor, pentru a închide capătul lantului. N.B. "French knitting" fabricata pentru reactorul post-coloana este disponibil pe piaţa (Supelco). Diagrama schematica a bobinei Figura 1 Figura 2 Figura 3 Primul tub Figura 4 Al doilea tub Pentru a forma un "ochi", se ridica tubul inferior (linia neîntrerupta) peste cel de-al doilea tub (linia întreruptă) Figura 5 ANEXA B 1 = Pompa HPLC 2 = Ventil de injecţie 3 = Coloana cu pre-coloana 4 = Pompa reactivi 5 = Teu fără volum mort 5' = Teu (Vortex) 6-6' = Racord fără volum mort 7 = "French Knitting" 7' = Reactor 8 = Balon de 1 litru cu trei gaturi cu apa fierbinte 9 = Manta de încălzire 10 = Agent de răcire 11 = Tub schimbator de căldura din oţel inoxidabil 12 = Schimbator de căldura 13 = Detector vizibil-UV 14 = Modul post-coloana PCRS 520 IMAGINE IMAGINE 5.3.6. IMAGINE ANEXA 15 METODA DE DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU DICLORMETAN SI PENTRU 1,1,1-TRICLORETAN 1. DOMENIU DE APLICARE Aceasta este metoda reglementată pentru determinarea diclormetanului (clorura de metilen) şi a 1,1,1-tricloretanului (metil cloroform) în toate produsele cosmetice în care este posibil sa apara aceşti solventi. 2. DEFINIŢIE Conţinutul în diclormetan şi 1,1,1-tricloretan în proba determinat în conformitate cu aceasta metoda este exprimat în procente masice. 3. PRINCIPIU Metoda foloseşte cromatografia de gaze, cu cloroform ca standard intern. 4. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 4.1. Cloroform [CHCl(2)] 4.2. Tetraclorura de carbon [CCl(5)] 4.3. Diclormetan [(CH(2)Cl(2)] 4.4. 1,1,1-Tricloretan [CH(2)CCl(2)] 4.5. Acetona 4.6. Azot 5. APARATURA 5.1. Aparatura uzuală de laborator 5.2. Cromatograf de gaze cu detector cu conductivitate termica 5.3. Flacoane de transfer, 50 la 100 ml (vezi metoda pentru prepararea în laborator a probei pentru testare, conform punctului 5.3 din Anexa nr. 3 la prezentul Ordin) 5.4. Seringa cu gaz comprimat, 25 sau 50 æl (vezi metoda pentru prepararea în laborator a probei pentru testare, conform punctului 5.4.2.2 din Anexa nr. 3 la prezentul Ordin) 6. PROCEDEU 6.1. Proba nepresurizata: se cântăreşte cu precizie într-un flacon conic cu dop. Se introduce o cantitate precis cantarita de cloroform (4.1) ca standard intern echivalenta cu cantitatea presupusa de diclormetan şi 1,1,1-tricloretan conţinută în proba. Se omogenizeaza. 6.2. Proba presurizata: se foloseşte metoda pentru prepararea în laborator a probei pentru testare, Anexa nr. 3 la prezentul Ordin, cu următoarele completări: 6.3. După transferarea unei probe într-un flacon de transfer (5.3), în flaconul de transfer se introduce un volum de cloroform (4.1) ca standard intern echivalent cu cantitatea presupusa de diclormetan si/sau 1,1,1-tricloretan conţinută în proba. Se omogenizeaza. Se clateste volumul mort al valvei cu 0,5 ml tetraclorura carbon (4.2). După uscare, se determina prin diferenţa, cu precizie, masa adăugată de standard intern. 6.3.1. După umplerea seringii cu proba, stutul seringii trebuie purjat cu azot (4.6) astfel încât sa nu rămână nici un reziduu înainte de injectarea în cromatograf. 6.3.2. După ce este luată fiecare proba, suprafatele injectorului şi a piesei de transfer trebuie sa fie clatite de mai multe ori cu acetona (4.5) (folosind o seringa hipodermica) şi apoi se usucă complet cu azot (4.6). 6.3.3. Pentru fiecare analiza, se fac măsurătorile folosind doua flacoane de transfer diferite şi cinci măsurători per flacon. 7. CONDIŢII DE CROMATOGRAFIERE 7.1. Precoloana Tub: oţel inoxidabil Lungime: 300 mm Diametru: 3 sau 6 mm Umplutura: acelaşi material ce se foloseşte ca umplutura la coloana analitica 7.2. Coloana Faza stationara este Hallcomid M 18 pe chromosorb. Coloana trebuie sa realizeze o rezoluţie "R" egala cu, sau mai buna decât 1,5 unde:
d'<r(2)-r(1)>
R = ─────────────
W(1) + W(2)
în care: r(1) şi r(2) = timpii de retenţie (în minute) W(1) şi W(2) = lăţimea picurilor la jumătatea inaltimii (în milimetri) d' = viteza de înregistrare a graficului (milimetri per minut) 7.3. Exemple de coloane ce produc rezultatele cautate:
────────────────────────────────────────────────────────────
Coloana I II
────────────────────────────────────────────────────────────
Material: tubulatura de oţel tubulatura de oţel
inoxidabil inoxidabil
Lungime: 350 cm 400 cm
Diametru: 3 mm 6 mm
────────────────────────────────────────────────────────────
Suport:
────────────────────────────────────────────────────────────
chromosorb: WAW WAW-DMCS-HP
analiza sitei: 100 - 120 mesh 60 - 80 mesh
Faza stationara: Hallcomid M 18, 10% Hallcomid M 18, 20%
────────────────────────────────────────────────────────────
Condiţiile de temperatura pot varia în funcţie de aparatura, în teste, acestea au fost setate în următorul mod:
────────────────────────────────────────────────────────────
Coloana I II
────────────────────────────────────────────────────────────
Temperaturi:
coloana: 65°C 75°C
injector: 150°C 125°C
detector: 150°C 200°C
Gaz purtător:
debit de heliu: 45 ml/min 60 ml/min
presiune de intrare: 2,5 bar 2 bar
Injecţie: 15 æl 15 æl
────────────────────────────────────────────────────────────
8. AMESTEC PENTRU STABILIREA FACTORILOR DE RĂSPUNS Într-un flacon conic cu dop se realizează următorul amestec cântărit cu precizie: Diclormetan (4.3), 30% (m/m) 1,1,1-tricloretan (4.4), 35% (m/m) Cloroform (4.19, 35% (m/m) 9. CALCULE 9.1. Calculul factorului de răspuns al substanţei "p" relativ la substanta "a" aleasă ca standard intern. Fie prima substanta "p", unde: k(p) = factorul sau de răspuns m(p) = masa sa în amestec A(p) = suprafaţa picului sau Fie a doua substanta "a", unde: k(a) = factorul sau de răspuns (considerat egal cu unitatea) M(a) = masa sa în amestec A(a) = suprafaţa picului sau atunci:
m(p) x A(a)
k(p) = ─────────────
M(a) x A(p)
Ca exemple, s-au obţinut următorii factorii de răspuns (pentru cloroform: k = 1): Diclormetan: k(1) = 0,78 § 0,03 1,1,1 -triclormetan: k(2) = 1,00 § 0,03 9.2. Calculul concentraţiei în procente % (m/m) de diclormetan şi 1,1,1-tricloretan prezente în proba de analizat: Fie: m(a) = masa de cloroform introdus (în grame) M(s) = masa probei de analizat (în grame) A(a) = suprafaţa picului cloroformului A(1) = suprafaţa picului diclormetanului A(2) = suprafaţa picului 1,1,1-tricloretanului atunci:
m(a) x A(1) x k(1) x 100
%(m/m) CH(2)Cl(2) = ─────────────────────────
A(a) x M(s)
m(a) x A(2) x k(2) x 100
%(m/m) CH(3)CCl(3) = ─────────────────────────
A(a) x M(s)
10. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de diclormetan si/sau 1,1,1-tricloretan de 25% (m/m), diferenţa dintre rezultatele a doua determinări executate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 2,5% (m/m). ANEXA 16 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU 8-CHINOLINOL SI PENTRU BIS (8-HIDROXICHINOLIN) SULFAT 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta metoda reglementează identificarea şi determinarea cantitativă a 8-chinolinolului şi a sulfatului sau. 2. DEFINIŢIE Conţinutul de 8-chinolinol şi de sulfat de bis (8-hidroxichinolin) din proba determinat prin aceasta metoda este exprimat în procente masice de 8-chinolinol. 3. PRINCIPIU 3.1. Identificare Identificarea se face prin cromatografie în strat subtire. 3.2. Determinare Determinarea se realizează prin spectrofotometria la 410 nm a complexului obţinut prin reactie cu soluţie Fehling. 4. REACTANTI Toţi reactantii trebuie sa fie de puritate analitica. 4.1. 8-chinolinol 4.2. Benzen. Din cauza toxicitatii sale se lucrează cu mare atenţie. 4.3. Cloroform 4.4. Soluţie apoasă de hidroxid de sodiu, 50% (m/m) 4.5. Sulfat de cupru pentahidratat 4.6. Tartrat de sodiu şi potasiu 4.7. Acid clorhidric M 4.8. Acid sulfuric 0,5 M 4.9. Soluţie de hidroxid de sodiu M 4.10. Etanol 4.11. 1-butanol 4.12. Acid acetic glacial 4.13. Acid clorhidric 0,1 4.14. "Celita 545" sau echivalent 4.15. Soluţii standard. 4.15.1. Într-un balon cotat de 100 ml se cantaresc 100 mg 8-chinolinol (4.1). Se dizolva în puţin acid sulfuric (4.8). Se umple pana la semn cu acid sulfuric (4.8). 4.15.2. într-un balon cotat de 100 ml se cantaresc 100 mg 8-chinolinol (4.1). Se dizolva în etanol (4.10). Se completează pana la semn cu etanol (4.10) şi se amesteca. 4.16. Soluţie Fehling. Soluţia A Într-un balon cotat de 100 ml se cantaresc 7 g de sulfat de cupru pentahidratat (4.5). Se dizolva în putina apa. Se completează pana la semn cu apa şi se amesteca. Soluţia B Într-un balon cotat de 100 ml se cantaresc 35 g de tartrat de sodiu şi potasiu (4.6). Se dizolva în 50 ml de apa. Se adauga 20 ml hidroxid de sodiu (4.4). Se aduce la semn cu apa şi se amesteca. Imediat înainte de folosire, într-un balon cotat de 100 ml, se pun cu pipeta 10 ml de soluţie A şi 10 ml de soluţie B. Se aduce la semn şi se amesteca. 4.17. Solventi de elutie pentru cromatografia în strat subtire I: 1-butanol (4.11)/acid acetic (4.12)/apa (80:20:20; v/v/v) II: Cloroform (4.13)/acid acetic (4.12) (95:5; v/v). 4.18. 2,6-dicloro-4- (cloroimino) ciclohexa-2,5-dienona, 1% (m/v) soluţie în etanol (4.10). 4.19. Carbonat de sodiu, 1% (m/v) soluţie în apa. 4.20. Etanol (4.10), 30% (v/v) soluţie în apa. 4.21. Etilendiaminotetraacetat dibazic de disodiu, 5% (m/v) soluţie în apa. 4.22. Soluţie tampon, pH 7 Într-un balon cotat de 1 l se cantaresc 27 g ortofosfat dibazic de potasiu anhidru şi 70 g ortofosfat monobazic de dipotasiu trihidratat. Se aduce la semn cu apa. 4.23. Prepararea placii de strat subtire Sunt plăci pregătite cu o grosime de 0,25 mm (de ex.: Merck Kieselgel 60 sau echivalent), înainte de folosire, se pulverizeaza 10 ml de reactiv (4.21) şi se usucă la 80°C. 5. APARATURA 5.1. Balon cu fund rotund şi gat rodat de 100 ml 5.2. Baloane cotate 5.3. Pipete gradate, 10 şi 5 ml 5.4. Pipete cu bula (rezervor), 20, 15, 10 şi 5 ml 5.5. Palnii de separare, 100, 50 şi 25 ml 5.6. Hârtie de filtru cutata, diametru 90 mm 5.7. Evaporator rotativ 5.8. Condensator de reflux cu gat rodat 5.9. Spectofotometru 5.10. Cuve optice cu lungime de cale de 10 mm 5.11. Fierbator cu agitator 5.12. Dimensiunile coloanei cromatografice de sticla: 160 mm lungime cu un diametru de 8 mm, o gatuire la capătul de jos conţinând un dop de vata de sticla şi un adaptor la capătul de sus pentru aplicarea presiunii. 6. PROCEDEU 6.1. Identificare 6.1.1. Probe lichide 6.1.1.1. pH-ul porţiunii probei de testat se regleaza la 7,5 şi 10 æl se spotuleaza pe linia de start a unei plăci de strat subtire pretratate de silicagel (4.23). 6.1.1.2. 10 şi 30 æl soluţie standard (4.15.2) se picura pe încă doua puncte pe linia de start, după care placa este developata în unul dintre cei doi eluenti (4.17). 6.1.1.3. Când frontul de solvent a avansat 150 mm, placa se usucă la 110°C (15 minute). Sub o lampa UV (366 nm) spoturile de 8-chinolinol prezintă fluorescenta galbena. 6.1.1.4. Se pulverizeaza placa cu soluţie de carbonat de sodiu (4.19). Se usucă şi se pulverizeaza cu soluţie 2,6-dicloro-4- (clorimino) ciclohexa-2,5-dienona (4.18). 8-chinolinolul devine vizibil ca un spot albastru. 6.1.2. Probe solide sau creme 6.1.2.1. Se disperseaza 1 g de proba în 5 ml soluţie tampon (4.22). Apoi se transfera cu 10 ml cloroform (4.3) într-o palnie de separare şi se agita. După separarea stratului de cloroform se extrage încă de doua ori stratul apos cu 10 ml de cloroform (4.3). Extractele de cloroform filtrat şi combinat se evapora pana aproape de uscare într-un balon cu fundul rotund de 100 ml (5.1) pe un evaporator rotativ (5.7). Se dizolva reziduul în 2 ml de cloroform (4.3) şi se picura 10 şi 30 æl din soluţia obţinută pe placa de strat subtire de silicagel (4.23) conform metodei descrisă mai sus la 6.1.1.1. 6.1.2.2. Se aplica 10 şi 30 æl de soluţie standard (4.15.2) pe placa şi se continua asa cum s-a descris de la 6.1.1.2. pana la 6.1.1.4. 6.2. Determinare 6.2.1. Probe lichide 6.2.1.1. Se cantaresc 5 g de proba într-un balon cu fund rotund de 100 ml. Se adauga 1 ml soluţie de acid sulfuric (4.8) şi se evapora amestecul pana aproape de uscare, la presiune redusă şi 50°C. 6.2.1.2. Se dizolva acest reziduu în 20 ml apa calda. Se transfera într-un balon cotat de 100 ml. Se clateste de trei ori cu 20 ml de apa. Se completează cu apa pana la 100 ml şi se amesteca. 6.2.1.3. Se pun cu pipeta 5 ml din aceasta soluţie într-o palnie de separare de 50 ml (5.5). Se adauga 10 ml soluţie Fehling (4.16). Se extrage complexul 8-chinolinol cupru [cupru oxina (ISO)] obţinut cu de trei ori câte 8 ml de cloroform (4.3). 6.2.1.4. Se filtreaza şi se colectează stratul de cloroform într-un balon cotat de 25 ml (5.2). Se aduce la semn cu cloroform (4.3) şi se agita vasul. Se măsoară densitatea optica a soluţiei galbene fata de cloroform la 410 nm. 6.2.2. Probe solide sau creme 6.2.2.1. Într-un balon cu fund rotund de 100 ml se cantaresc 0,500 g proba (4.1). Se adauga 30 ml benzen (4.2) şi 20 ml acid clorhidric (4.7). Se fierbe conţinutul vasului la reflux, cu amestecare, timp de 30 minute. 6.2.2.2. Se transfera conţinutul vasului într-o palnie de separare de 100 ml (5.5). Se clateste cu 5 ml de 1 N HCl (4.7). Se transfera faza apoasă într-un balon cu fund rotund (5.1) şi se spala faza de benzen cu 5 ml de acid clorhidric (4.7). 6.2.2.3. In cazul emulsiilor care stanjenesc tratarea mai departe, se amesteca 0,500 g proba cu 2 g Celita 545 (4.14) pentru a forma o pudra liber curgătoare. Se transfera amestecul în porţiuni mici într-o coloana cromatografica de sticla (5.12). După fiecare adăugare, se indeasa umplutura coloanei. De îndată ce tot amestecul a fost transferat în coloana se elueaza cu acid clorhidric (4.13) astfel încât 10 ml de eluat este obţinut în circa 10 minute (dacă este necesar, aceasta elutie poate fi realizată sub o uşoară presiune de azot), în timpul elutiei trebuie avut grija ca tot timpul sa existe acid clorhidric peste umplutura coloanei. Primii 10 ml de eluat vor fi trataţi mai departe conform 6.2.2.4. 6.2.2.4. Se evapora fazele apoase colectate (6.2.2.2) sau eluatul (6.2.2.3) aproape pana de uscare într-un evaporator rotativ la presiune redusă. 6.2.2.5. Se dizolva reziduul în 6 ml soluţie hidroxid de sodiu (4.9). Se adauga 20 ml soluţie Fehling (4.16) şi se transfera conţinutul balonului într-o palnie de separare de 50 ml (5.5). Se clateste vasul cu 8 ml de cloroform (4.3). Se agita şi se filtreaza faza de cloroform într-un balon cotat de 50 ml. Se repeta extracţia de trei ori cu 8 ml de cloroform (4.3). Se filtreaza faza de cloroform şi se colectează într-un balon cotat de 50 ml. Se completează pana la semn cu cloroform (4.3) şi se agita. Se măsoară densitatea optica a soluţiei galbene fata de cloroform la 410 nm (4.3). 7. CURBA STANDARD In patru baloane cu fund rotund de 100 ml (5.1), fiecare conţinând 3 ml soluţie apoasă de etanol 30% (4.20) se pun cu pipeta 5, 10, 15 şi 20 ml soluţie standard (4.15.1) corespunzand la 5, 10, 15 şi 20 mg de 8-chinolinol. Se procedează conform 6.2.1. 8. CALCUL 8.1. Probe pentru testare lichide.
a
conţinut 8-chinolinol (în % (m/m)) = ─── x 100
m
unde: a = miligrame de 8-chinolinol pe curba standard (7) m = masa (în miligrame) a probei pentru testare (6.2.1.1) 8.2. Probe pentru testare solide sau creme
2a
conţinut 8-chinolinol (în % (m/m)) = ──── x 100
m
unde: a = miligrame de 8-chinolinol pe curba standard (7). m = masa (în miligrame) a probei pentru testare (6.2.2.1) 9. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de circa 0,3% 8-chinolinol, diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,02%. ANEXA 17 METODA DE DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU AMONIAC LIBER 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Metoda reglementează determinarea amoniacului liber din produsele cosmetice. 2. DEFINIŢIE Conţinutul de amoniac din proba determinat conform acestei metode este exprimat în procente masice de amoniac. 3. PRINCIPIU Se adauga soluţie de clorura de bariu la o proba pentru testare de produs cosmetic diluata într-un mediu de soluţie apoasă de metanol. Precipitatul care se poate forma se filtreaza sau se centrifugheaza. Acest procedeu evita pierderile de amoniac, în timpul distilării cu abur, de la anumite saruri de amoniu cum ar fi carbonatul şi carbonatii bazici precum şi al acizilor grasi, cu excepţia acetatului de amoniu. Amoniacul se distileaza cu abur din filtrat sau supernatant şi se determina prin titrare potentiometrica sau alt gen de titrare. 4. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica 4.1. Metanol 4.2. Clorura de bariu dihidrata, soluţie 25% (m/v) 4.3. Acid ortoboric, soluţie 4% (m/v) 4.4. Acid sulfuric, soluţie standard 0,25 M 4.5. Lichid anti-spumant 4.6. Hidroxid de sodiu, soluţie standard 0,5 M 4.7. Indicator, dacă este necesar: se amesteca 5 ml soluţie roşu de metil 0,1% (m/v) în etanol cu 2 ml soluţie albastru de metilen 0,1% (m/v) în apa. 5. APARATURA 5.1. Aparatura uzuală de laborator 5.2. Centrifuga cu flacoane cu dop de 100 ml 5.3. Aparatura de distilare cu abur 5.4. Potentiometru 5.5. Electrod de sticla indicator şi electrod de referinţa diclorura de dimercur (calomel) 6. PROCEDEU 6.1. Într-un balon cotat de 100 ml se cântăreşte o cantitate (m) de proba pentru testare corespunzătoare unui maximum de 150 mg de amoniac. 6.2. Se adauga 10 ml apa, 10 ml metanol (4.1) şi 10 ml soluţie clorura de bariu (4.2). Se aduce la semn cu metanol (4.1). 6.3. Se amesteca şi se lasa sa stea peste noapte în frigider (5°C). 6.4. Apoi se filtreaza sau se centrifugheaza soluţia încă rece în eprubete închise pentru 10 minute, astfel încât sa se obţină un strat de filtrat sau supernatant clar. 6.5. Se pun cu pipeta 40 ml din acesta soluţie clara în aparatura de distilare cu abur (5.3), urmat de 0,5 ml de lichid anti-spumant (4.5), acolo unde este necesar. 6.6. Se distileaza şi se colectează 200 ml de distilat într-un pahar de 250 ml conţinând 10 ml acid sulfuric standard (4.4) şi 0,1 ml indicator (4.7). 6.7. Se retitreaza excesul de acid cu soluţie standard de hidroxid de sodiu (4.6). 6.8. N.B.: Pentru determinarea potentiometrica, se colectează 200 ml de distilat într-un pahar de 250 ml conţinând 25 ml soluţie acid ortoboric (4.3) şi se titreaza cu acid sulfuric standard (4.4), inregistrand curba de neutralizare. 7. CALCUL 7.1. Calcul în cazul retitrarii Fie: V(1) = volumul (în mililitrii) de soluţie de hidroxid de sodiu (4.6) folosită M(1) = molaritatea sa reală (4.6). M(2) = factorul de molaritate reală al soluţiei de acid sulfuric (4.4). m = masa (în miligrame) probei pentru testare (6. 1) luate atunci: 7.2. Calcul în cazul titrarii potentiometrice directe Fie:
[20M(2) - V(1)M(1)] x 17 x 100 [20M(2) - V(1)M(1)] x 4250
% amoniac (m/m) = ────────────────────────────── = ──────────────────────────
0,4 m m
V(2) = volumul (în mililitrii) de soluţie de acid sulfuric (4.4) folosită M(2) = molaritatea sa reală (4.4). m = masa (în miligrame) probei pentru testare (6.1) luate atunci:
V(2) x M(2) x 17 x 100 4250 V(2)M(2)
% amoniac (m/m) = ────────────────────── = ─────────────
0,4 m m
8. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de circa 6% amoniac, diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,6%. ANEXA 18 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU NITROMETAN 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta metoda este reglementată pentru identificarea şi determinarea nitrometanului pana la cca. 0,3%, conţinut în produsele cosmetice din ambalaje presurizate, pulverizate ca aerosoli. 2. DEFINIŢIE Conţinutul de nitrometan din proba determinat conform acestei metode este exprimat în procente masice de nitrometan, din totalul conţinutului pulverizatorului de aerosoli. 3. PRINCIPIU Nitrometanul este identificat prin reactie de culoare. Nitrometanul este determinat prin cromatografie de gaze după adăugarea unui standard intern. 4. IDENTIFICARE 4.1. Reactivi Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 4.1.1. Hidroxid de sodiu, soluţie 0,5 M 4.1.2. Reactiv Folin Se dizolva 0,1 g 3,4-dihidro-3,4-dioxonaftalina-1-sulfonat de sodiu în apa şi se dilueaza pana la 100 ml. 4.2. Procedeu La 1 ml proba se adauga 10 ml de 4.1.1. şi 1 ml de 4.1.2. Prezenta nitrometanului este indicată printr-o colorare violeta. 5. DETERMINARE 5.1. Reactivi Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 5.1.1. Cloroform (standard intern 1) 5.1.2. 2,4-dimetilheptan (standard intern 2) 5.1.3. Etanol 95% 5.1.4. Nitrometan 5.1.5. Soluţie de referinţa de cloroform Într-un balon cotat de 25 ml căruia i s-a luat ţara, se introduc circa 650 mg cloroform (5.1.1). Se recantareste cu precizie vasul şi conţinutul. Se aduce la semn cu etanol 95% (5.1.3). Se cântăreşte şi se calculează procentele masice de cloroform în aceasta soluţie. 5.1.6. Soluţie de referinţa de 2,4-dimetilheptan. Se realizează similar cu soluţia de referinţa de cloroform, dar cantarind 270 mg de 2,4-dimetilheptan (5.1.2) într-un balon cotat de 25 ml. 5.2. Aparatura 5.2.1. Cromatograf de gaze cu detector cu ionizare în flacara 5.2.2. Aparatura de prelevare a probelor de aerosoli (flacon de transfer, conectori de microseringi), conform metodei de preparare în laborator a probelor pentru testare, Anexa 3 la prezentul Ordin. 5.2.3. Aparatura uzuală de laborator 5.3. Procedeu 5.3.1. Prepararea probei Într-un flacon de transfer tarat de 100 ml, degazat conform procedeului descris la punctul 5.4., din Anexa 3 la prezentul Ordin, se introduc circa 5 ml din una dintre soluţiile standard intern (5.1.5. sau 5.1.6.). Se foloseşte o seringa de sticla de 10 sau 20 ml, fără ac, adaptată la piesa de transfer urmând tehnica descrisă la paragraful 5 al Anexei 3 la prezentul Ordin. Se recantareste pentru a determina cantitatea introdusă. Folosind aceeaşi tehnica, se transfera în acest flacon cca. 50 g din conţinutul probei de produs pulverizat ca aerosoli. Din nou se recantareste pentru a determina cantitatea de proba transferata. Se omogenizeaza. Se injecteaza 10 æl folosind microseringa specificată (5.2.2.). Se efectuează cinci injectari. 5.3.2. Prepararea standardului Într-un balon cotat de 50 ml se cantaresc cu precizie cca. 500 mg nitrometan (5.1.4) si, sau 500 mg cloroform (5.1.1) sau 210 mg 2,4-dimetilheptan (5.1.2). Se aduce la semn cu etanol 95% (5.1.3). Se amesteca bine. Se pun 5 ml din aceasta soluţie într-un balon cotat de 20 ml. Se aduce la semn cu etanol 95% (5.1.3). Se injecteaza 10 æl cu microseringa specificată (5.2.2). Se efectuează cinci injectari. 5.3.3. Condiţii pentru cromatografia de gaze 5.3.3.1. Coloana Coloana este alcătuită din doua părţi, prima conţinând ftalat didecilic pe Gaz Chrom Q ca umplutura, a doua având Ucon 50 HB 280X pe Gaz Chrom Q ca umplutura. Coloana combinată astfel pregatita trebuie sa producă o rezoluţie "R" egala cu, sau mai buna decât, 1,5, unde:
d'[r(2) - r(1)]
R = 2 ───────────────
W(1) + W(2)
fie: r(1) şi r(2) = timpii de retenţie (în minute). W(1) şi W(2) = lăţimea picului la jumătatea inaltimii (în milimetri), d' = viteza de înregistrare a graficului (în milimetrii per minut). Rezoluţia cerută se realizează cu următoarele doua părţi: Coloana A: Material: oţel inoxidabil Lungime: 1,5 m Diametru: 3 mm Umplutura: 20% ftalat didecilic pe Gaz Chrom Q (100 la 120 ochiuri) Coloana B: Material: oţel inoxidabil Lungime: 1,5 m Diametru: 3 mm Umplutura: 20% Ucon 50 HB 280X pe Gaz Crom Q (100 la 120 ochiuri) 5.3.3.2. Detector O setare adecvată a sensibilităţii pentru electrometrul detectorului cu ionizare în flacara este 8 x 10^-1 [] A. 5.3.3.3. Condiţii de temperatura S-au găsit următoarele condiţii adecvate: Injector: 150°C Detector: 150°C Coloana: între 50 şi 80°C depinzand de coloanele individuale şi de aparatura. 5.3.3.4. Alimentari cu gaz adecvat Gaz purtător: azot Presiune: 2,1 bar Debit: 40 ml/min Alimentari detector: conform specificatiilor fabricantului detectorului. 6. CALCULE 6.1. Factorul de răspuns al nitrometanului, calculat cu referire la standardul intern folosit Dacă "n" reprezintă nitrometanul: fie: k(n) = factorul sau de răspuns m'(n) = masa sa (în grame) în amestec S'(n) = aria picului sau Dacă "c" reprezintă standardul intern, cloroform sau 2,4 dimetilheptan: fie: m'(c) = masa sa (în grame) în amestec S'(c) = aria picului sau atunci:
m'(n) S'(c)
k(n) = ─────── x ───────
m'(c) S'(n)
(k(n) este o funcţie de aparatura). 6.2. Concentraţia nitrometanului în proba Dacă "n" reprezintă nitrometanul: fie: k(n) = factorul sau de răspuns S(n) = aria picului sau Dacă "c" reprezintă standardul intern, cloroform sau 2,4-dimetilheptan: fie: m(c) = masa sa (în grame) în amestec S(c) = aria picului sau M = masa (în grame) de aerosol transferat, atunci procentul % (m/m) de nitrometan în proba este:
m(c) k(n) x S(n)
────── x ───────────── x 100
M S(c)
7. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de nitrometan de circa 0,3% (m/m), diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,03% (m/m) ANEXA 19 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU ACID MERCAPTOACETIC DIN PRODUSELE PENTRU ÎNGRIJIREA PARULUI SI DIN DEPILATOARE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta este metoda reglementată pentru identificarea şi determinarea acidului mercaptoacetic din produsele pentru ondularea parului, pentru întinderea parului şi pentru depilare în care pot fi prezenţi şi alţi agenţi de reducere. 2. DEFINIŢIE Conţinutul de acid mercaptoacetic în proba determinat conform acestei metode este exprimat în procente masice de acid mercaptoacetic. 3. PRINCIPIU Acidul mercaptoacetic se identifica prin teste în picatura şi prin cromatografie în strat subtire şi se determina prin iodometrie sau cromatografie de gaze. 4. IDENTIFICARE 4.1. Identificare prin teste în picatura 4.1.1. Reactivi Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 4.1.1.1. Hârtie cu diacetat de plumb. 4.1.1.2. Soluţie acid clorhidric (un volum acid clorhidric concentrat plus un volum apa) 4.1.2. Procedeu 4.1.2.1. Identificarea acidului mercaptoacetic prin reactie de culoare cu diacetat de plumb Se pune o picatura de proba pentru testare pe hârtia cu diacetat de plumb (4.1.1.1). Dacă apare o culoare galben intens, probabil este prezent acidul mercaptoacetic. Sensibilitate: 0,5%. 4.1.2.2. Caracterizarea sulfurilor anorganice prin formarea hidrogenului sulfurat la acidifiere Într-o eprubeta se introduc câteva miligrame de proba pentru testare. Se adauga 2 ml apa distilata şi 1 ml de acid clorhidric (4.1.1.2). Se eliberează hidrogen sulfurat, recunoscut după miros, şi pe hârtia cu diacetat de plumb se formează un precipitat negru de sulfura de plumb. (4.1.1.1) Sensibilitate: 50 ppm. 4.1.2.3. Caracterizarea sulfurilor prin formarea dioxidului de sulf la acidifiere. Se procedează conform descrierii de la 4.1.2.2. Se aduce la fierbere. Dioxidul de sulf se recunoaşte după miros şi prin proprietăţile sale reducatoare în raport, de exemplu, cu ionii de permanganat. 4.2. Identificare prin cromatografie în strat subtire 4.2.1. Reactivi Toţi reactivii, exceptându-i pe cei pentru care se specifica neobligativitatea, trebuie sa fie de puritate analitica. 4.2.1.1. Acid mercaptoacetic (acid tioglicolic), puritate minima determinata prin iodometrie 98% 4.2.1.2. Acid 2,2'-ditiodiacetic, puritate minima determinata prin iodometrie 99% 4.2.1.3. Acid 2-mercaptopropionic (acid tiolactic), puritate minima determinata prin iodometrie 95% 4.2.1.4. Acid 3-metcaptopropionic, puritate minima determinata prin iodometrie 98% 4.2.1.5. 3-mercaptopropan-1,2-diol (1-tioglicerol), puritate minima determinata prin iodometrie 98% 4.2.1.6. Plăci de strat subtire, silicagel, gata preparate, 0,25 mm grosime 4.2.1.7. Plăci de strat subtire, oxid de aluminiu, Merck F 254 E sau echivalent 4.2.1.8. Acid clorhidric concentrat, d(4)^2 [] = 1,19 g/ml 4.2.1.9. Acetat de etil 4.2.1.10. Cloroform 4.2.1.11. Eter diizopropilic 4.2.1.12. Tetraclorura de carbon. 4.2.1.13. Acid acetic glacial 4.2.1.14. Iodura de potasiu, soluţie în apa 1% (m/v) 4.2.1.15. Tetraclorura de platina, soluţie în apa 0,1% (m/v) 4.2.1.16. Solventi de elutie 4.2.1.16.1. Acetat de etil (4.2.1.9), cloroform (4.2.1.10), eter diizopropilic (4.2.1.11), acid acetic (4.2.1.13) (20:20:10:10, în volume) 4.2.1.16.2. Cloroform (4.2.1.10.), acid acetic (4.2.1.13) (90:20, în volume) 4.2.1.17. Reactivi de detectare 4.2.1.17.1. Se amesteca, imediat înainte de folosire, volume egale de soluţie (4.2.1.14) şi soluţie (4.2.1.15). 4.2.1.17.2. Soluţie de brom 5% (m/v); Se dizolva 5 g brom în 100 ml tetraclorura de carbon (4.2.1.12). 4.2.1.17.3. Soluţie de fluoresceina, 0,1% (m/v); Se dizolva 100 mg fluoresceina în 100 ml etanol 4.2.1.17.4. Heptamolibdat de hexaamoniu, soluţie în apa 10% (m/v). 4.2.1.18. Soluţii etalon 4.2.1.18.3. Acid mercaptoacetic (4.2.1.1), soluţie în apa 0,4% (m/v). 4.2.1.18.4. Acid ditiodiacetic (4.2.1.2), soluţie în apa 0,4% (m/v) 4.2.1.18.5. Acid 2-mercaptopropionic (4.2.1.3), soluţie în apa 0,4% (m/v) 4.2.1.18.6. Acid 3-mercaptopropionic (4.2.1.4), soluţie în apa 0,4% (m/v) 4.2.1.18.7. 3-mercaptopropan-1,2 diol (4.2.1.5), soluţie în apa 0,4% (m/v) 4.2.2. Aparatura Aparatura uzuală pentru cromatografia în strat subtire. 4.2.3. Procedeu 4.2.3.1. Tratamentul probelor Se aciduleaza pana la pH 1 cu câteva picaturi de acid clorhidric (4.2.1.8) şi se filtreaza dacă este necesar. In anumite cazuri poate fi indicată diluarea probei, în acest caz, se acidifiaza cu acid clorhidric înainte de diluare. 4.2.3.2. Elutie Se pune pe placa 1 æl soluţie de proba (4.2.3.1.) şi câte un litru din fiecare dintre cele cinci soluţii etalon (4.2.1.18). Se usucă cu grija în curent uşor de azot şi se elueaza placa cu solventi (4.2.1.16.1 sau 4.2.1.16.2). Se usucă placa cat se poate de repede pentru a minimiza oxidarea tiolilor. 4.2.3.3. Detectare Se pulverizeaza placa cu unul dintre cei trei reactivi (4.2.1.17.1, 4.2.1.17.3 sau 4.2.1.17.4). Dacă placa se pulverizeaza cu reactiv (4.2.1.17.3), se tratează mai departe cu vapori de brom (de ex. într-un rezervor conţinând un mic pahar de reactiv) pana când spoturile devin vizibile. Detectarea cu pulverizare de reactiv (4.2.1.17.4) va fi satisfăcătoare numai dacă timpul de uscare pentru stratul subtire nu a depăşit 30 minute. 4.2.3.4. Interpretare Se compara valorile Rf şi culoarea soluţiilor etalon cu cele ale standardelor. Valorile medii Rf date mai jos ca ghid informativ au numai valoare de comparaţie. Ele depind de: - starea de activare a stratului subtire în momentul cromatografierii - temperatura în rezervorul cromatografie. Exemple de valori Rf obţinute pe un strat de silicagel
┌──────────────────────────┬───────────────────────────────────────┐
│ │ Solventi de elutie │
├──────────────────────────┼────────────────────┬──────────────────┤
│ │ 4.2.1.16.1 │ 4.2.1.16.2 │
├──────────────────────────┼────────────────────┼──────────────────┤
│Acid mercaptoacetic │ 0,25 │ 0,80 │
├──────────────────────────┼────────────────────┼──────────────────┤
│Acid 2-mercaptopropionic │ 0,40 │ 0,95 │
├──────────────────────────┼────────────────────┼──────────────────┤
│Acid 2,2'-ditiodiacetic │ 0,00 │ 0,35 │
├──────────────────────────┼────────────────────┼──────────────────┤
│Acid 3-mercaptopropionic │ 0,45 │ 0,95 │
├──────────────────────────┼────────────────────┼──────────────────┤
│3-mercaptopropan-1,2,-diol│ 0,45 │ 0,35 │
└──────────────────────────┴────────────────────┴──────────────────┘
5. DETERMINARE: Determinarea acidului mercaptoacetic trebuie realizată pe un produs nefolosit din recipiente proaspăt deschise, pentru a preveni oxidarea. Determinarea trebuie sa înceapă întotdeauna cu procedeul iodometric. 5.1. Iodometrie 5.1.1. Principiu Determinarea se realizează prin oxidarea grupării "-SH" cu iod într-un mediu acid conform ecuatiei: _ + 2HOOC - CH(2)SH + I(2) -> [HOOC-CH(2)-S](2) + 2I + 2H 5.1.2. Reactivi Iod, soluţie standard 0,05 M 5.1.3. Aparatura Echipament obişnuit de laborator 5.1.4. Procedeu Se cântăreşte cu precizie o cantitate între 0,5 şi 1 g proba într-un flacon conic cu capac de 150 ml conţinând 50 ml apa distilata. Se adauga 5 ml acid clorhidric (4.1.1.2) (pH-ul soluţiei cca. 0) şi se titreaza cu soluţie de iod (5.1.2) pana la apariţia unei culorii galbene. Dacă se doreşte se poate folosi un indicator (de ex. soluţie de amidon sau tetraclorura de carbon). 5.1.5. Calcul Conţinutul de acid mercaptoacetic se calculează cu formula:
92 x n x 100 0,92n
% (m/m) = ─────────────── x ───────
1000 x 10 x m m
unde: m = masa (în grame) a probei pentru testare n = volumul soluţiei de iod (5.1.2) folosită 5.1.6. Observaţii Dacă rezultatul, calculat ca acid mercaptoacetic, este 0,1% sau mult sub concentraţia maxima autorizata, nu este necesară continuarea determinarilor. Dacă rezultatul este egal cu sau peste concentraţia maxima admisă, şi identificarea a arătat prezenta unor agenţi de reducere, este necesară realizarea unei determinări prin cromatografie de gaze. 5.2. Cromatografiere de gaze 5.2.1. Principiu Acidul mercaptoacetic se separa din excipient prin precipitare cu soluţie de diacetat de cadmiu. După metilare cu diazometan, preparat în situ sau anterior într-o soluţie de dietileter, derivatul metilic al acidului mercaptoacetic este măsurat prin cromatografie de gaz/lichid, octanoatul de metil fiind folosit ca standard intern. 5.2.2. Reactivi Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 5.2.2.1. Acid mercaptoacetic, 98% 5.2.2.2. Acid clorhidric, d(4)^2 [] = 1,19 g/ml 5.2.2.3. Metanol 5.2.2.4. Diacetat de cadmiu dihidratat, soluţie în apa 10% (m/v) 5.2.2.5. Octanoat de metil, soluţie în metanol 2% (m/v) 5.2.2.6. Soluţie tampon de acetat (pH 5) Acetat de sodiu trihidratat, 77 g Acid acetic (glacial), 27,5 g Apa demineralizata pana la un volum final de 1 litru 5.2.2.7. Acid clorhidric, soluţie în metanol 3 M (5.2.2.3), proaspăt preparat 5.2.2.8. 1-metil-3-nitro-1-nitrozoguanidina 5.2.2.9. Hidroxid de sodiu, soluţie 5 M 5.2.2.10. Iod, soluţie standard 0,05 M 5.2.2.11. Dietileter 5.2.2.12. Soluţie diazometan preparata din N-metil-N-nitrozotoluen-4-sulfonamida (Fieser, Reagents for Organic Synthesis (Wiley), 1967) Soluţia obţinută conţine cca. 1,5 g diazometan în 100 ml dietileter. Diazometanul fiind un gaz toxic şi foarte instabil, toate experimentele trebuie efectuate sub o hota puternica şi trebuie sa se evite folosirea aparaturii de sticla rodata (pentru acest scop exista truse speciale). 5.2.3. Aparatura 5.2.3.1. Aparatura obişnuită de laborator 5.2.3.2. Aparatura pentru prepararea diazometanului în situ (vezi Fales, H.M., Jaouni, T.M. şi Babashak, J.F. Analyt. Chem. 1973, 45, 2302) 5.2.3.3. Aparatura pentru pregătirea avansată a diazometanului (Fiesen). 5.2.4. Prepararea probei Într-o eprubeta de centrifugare de 50 ml se cântăreşte precis o cantitate suficienta de proba pentru a rezulta o presupusa cantitate de 50 pana la 70 mg acid mercaptoacetic. Se aciduleaza cu câteva picaturi de acid clorhidric (5.2.2.2.) pentru a obţine un pH de cca. 3. Se adauga 5 ml apa demineralizata şi 10 ml soluţie tampon de acetat (5.2.2.6) Se verifica cu hârtie de pH dacă valoarea pH-ului este cca. 5. Apoi se adauga 5 ml soluţie de diacetat de cadmiu (5.2.2.4). Se aşteaptă 10 minute şi apoi se centrifugheaza pentru cel puţin 15 minute la 4000 g. Se elimina supernatantul lichid care poate conţine o grasime insolubila (în cazul produselor crema). Aceasta grasime nu poate fi confundată cu tiolii care colectează într-o masa compacta la fundul eprubetei. Se verifica ca nici o precipitare sa nu se producă la adăugarea catorva picaturi de soluţie de diacetat de cadmiu (5.2.2.4.) la supernatant. Acolo unde identificarea anterioară nu a relevat alţi agenţi reducatori în afară de tioli, se verifica iodometric dacă tiolul prezent în lichidul supernatant nu depăşeşte 6 pana la 8% din cantitatea iniţială. Se introduc 10 ml de metanol (5.2.2.3.) într-o eprubeta de centrifugare conţinând precipitatul şi se disperseaza fin precipitatul cu o tija agitatoare. Se centrifugheaza din nou pentru cel puţin 15 minute la 4000g. Se scurge supernatantul şi se verifica absenta tiolilor. Se spala precipitatul a doua oara urmând acelaşi procedeu. Încă folosind aceiaşi eprubeta de centrifuga, se adauga: - 2 ml soluţie octanoat de metil (5.2.2.5), - 5 ml de acid clorhidric în metanol (5.2.2.7). Se dizolva complet tiolii (din excipient poate persista putina materie insolubila). Aceasta este soluţia "S". Cu o porţiune din aceasta soluţie, se verifica iodometric dacă conţinutul de tioli este de cel puţin 90% din cel obţinut la 5.1. 5.2.5. Metilare Metilarea se realizează ori prin preparare în situ (5.2.5.1) ori cu soluţie de diazometan preparata anterior (5.2.5.2.) 5.2.5.1. Metilare în situ In aparatura de metilare (5.2.3.2) conţinând 1 ml de eter (5.2.2.11) se introduc 50 æl soluţie "S" şi se metileaza prin metoda (5.2.3.2) cu cca. 300 mg de 1-metil-3-nitro-1-nitrozoguanidina (5.2.2.8). După 15 minute (soluţia de eter trebuie sa fie galbena pentru a indica excesul de diazometan) se transfera soluţia de proba într-un flacon de 2 ml având un dop etanş. Se depozitează în frigider peste noapte. Se metileaza doua probe simultan. 5.2.5.2. Metilare cu soluţie de diazometan preparata anterior Într-un flacon cu dop de 5 ml se introduc 1 ml soluţie de diazometan (5.2.2.12), apoi 50 æl soluţie "S". Se lasa în frigider peste noapte. 5.2.6. Preparare standard Se prepara o soluţie standard de acid mercaptoacetic (5.2.2.1) de concentraţie cunoscută conţinând cca. 60 mg acid mercaptoacetic pur (5.2.2.1) la 2 ml. Aceasta este soluţia "E". Se precipita, determina şi metileaza conform 5.2.4 şi 5.2.5. 5.2.7. Condiţii pentru cromatografia de gaze 5.2.7.1. Coloana Tip: oţel inoxidabil Lungime: 2 m Diametru: 3 mm 5.2.7.2. Umplutura 2% ftalat de didecil/chromosorb, WAW 80 la 100 mesh. 5.2.7.3. Detector Ionizare în flacara. O setare adecvată a sensibilităţii electrometrului detectorului cu ionizare cu flacara este 8 x 10^-1 [] A. 5.2.7.4. Alimentari cu gaz Gaz purtător: azot presiune: 2,2 bar debit: 35 ml/min Gaz auxiliar: hidrogen presiune: 1,8 bar debit: 15 ml/min Alimentare-detector: conform celor specificate de producătorii instrumentului 5.2.7.5. Condiţii de temperatura Injector: 200°C Detector: 200°C Coloana: 90°C 5.2.7.6. Viteza de înregistrare a graficului 5 mm/min. 5.2.7.7. Cantitate injectata 3 æl Se realizează cinci injectari. Condiţiile cromatografiei sunt date informativ. Ele permit realizarea unei rezoluţii "R" egala sau mai buna decât 1,5, unde:
d'[r(2) - r(1)]
R = 2 ───────────────
W(1) + W(2)
fie: r(1) şi r(2) = timpii de retenţie (în minute) pentru cele doua picuri W(1) şi W(2) = latimile picurilor la jumătatea inaltimii (în milimetri) d' = viteza de înregistrare a graficului (în milimetrii per minut) Se recomanda ca procesul de cromatografiere sa se termine prin reglarea temperaturii de la 90 la 150°C cu o rata de 10°C pe minut pentru a elimina substanţele care sunt susceptibile a interfera cu măsurătorile ulterioare. 5.2.8. Calcul 5.2.8.1. Coeficientul de proportionalitate pentru acidul mercaptoacetic Acesta se calculează fata de octanoatul de metil pe baza unui amestec standard. Dacă "t" reprezintă acidul mercaptoacetic: fie: k(t) = factorul sau de răspuns m'(t) = masa sa (în miligrame) în amestec S'(t) = aria picului sau Dacă "c" reprezintă octanoatul de metil: fie: m'(c) = masa sa (în miligrame) în amestec S'(c) = aria picului sau atunci:
m'(t) S'(c)
k(t) = ─────── x ───────
m'(c) S'(t)
Acest coeficient variaza funcţie de aparatura folosită. 5.2.8.2. Concentraţia de acid mercaptoacetic prezent în proba Dacă "t" reprezintă acidul mercaptoacetic: fie: k(t) = factorul sau de răspuns S(t) = aria picului sau Dacă "c" reprezintă octanoatul de metil: fie: m(c) = masa sa (în miligrame) în amestec S(c) = aria picului sau M = masa (în miligrame) a porţiunii de testare iniţială atunci procentul % (m/m) de acid mercaptoacetic prezent în proba este:
m(c) k(t) x S(t)
──── x ─────────── x 100
M Sc
6. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de acid mercaptoacetic de 8% (m/m), diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,8% (m/m). ANEXA 20 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU HEXACLOROFEN A. IDENTIFICARE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta este metoda reglementată pentru identificare hexaclorofen din produsele cosmetice. 2. PRINCIPIU Hexaclorofenul din proba este extras cu acetat de etil şi identificat prin cromatografie în strat subtire (C.S.S.). 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 3.1. Acid sulfuric, soluţie 4 M 3.2. Celita AW. 3.3. Acetat de etil 3.4. Solvent de elutie: Benzen conţinând 1% (v/v) acid acetic glacial. 3.5. Agent de vizualizare I: Soluţie Rodamina B: se dizolva 100 mg Rodamina B într-un amestec de 150 ml dietileter, 70 ml etanol absolut şi 16 ml apa. 3.6. Agent de vizualizare II: Soluţie 2,6-dibromo-4-(cloroimino) ciclohexa-2,5-dienona: se dizolva 400 mg de 2,6-dibromo-4-(cloroimino) ciclohexa-2,5-dienona în 100 ml metanol (zilnic proaspăt preparat). Soluţie carbonat de sodiu: se dizolva 10 g carbonat de sodiu în 100 ml de apa demineralizata. 3.7. Soluţie etalon: Hexaclorofen, soluţie 0,05% (m/v) în acetat de etil. 4. APARATURA 4.1. Plăci pentru cromatografie în strat subtire Kiesel gel 254, 200 x 200 mm (sau echivalent) 4.2. Echipament uzual pentru cromatografia în strat subtire 4.3. Baie termostatata la 26°C pentru tancul cromatografie 5. PREPARAREA PROBEI PENTRU TESTARE 5.1. Se amesteca foarte bine 1 gram proba omogenizata cu 1 gram Celita AW (3.2) şi 1 ml acid sulfuric (3.1) 5.2. Se usucă la 100°C pentru 2 ore. 5.3. Se raceste şi se marunteste fin reziduul uscat. 5.4. Se extrage de doua ori cu câte 10 ml acetat de etil (3.3), se centrifugheaza după fiecare extracţie şi se combina straturile de acetat de etil. 5.5. Se evapora la 60°C. 5.6. Se dizolva reziduul în 2 ml acetat de etil (3.3). 6. PROCEDEU 6.1. Se pun 2 æl soluţie proba de testat (5.6) şi 2 (0.1 soluţie etalon (3.7) pe placa de cromatografie în strat subtire (4.1) 6.2. Se satureaza tancul (4.3) cu solvent de elutie (3.4). 6.3. Se pune placa CSS în tanc şi se elueaza pana la 150 mm. 6.4. Se scoate placa CSS şi se usucă într-un cuptor ventilat la o temperatura de cca. 105°C. 6.5. Vizualizare Spoturile de hexaclorofen de pe placa se vizualizeaza conform indicaţiilor 6.5.1 sau 6.5.2. 6.5.1. Se pulverizeaza uniform pe placa agent de vizualizare I (3.5). După 30 minute se examinează placa la lumina UV 254 nm. 6.5.2. Se pulverizeaza uniform pe placa soluţia de 2,6-dibromo-4-(cloroimino) ciclohexa-2,5-dienona, agent de vizualizare II (3.6). Ulterior se pulverizeaza placa cu soluţie de carbonat de sodiu (3.6). Se examinează placa la lumina zilei după 10 minute de uscare la temperatura camerei. 7. INTERPRETARE 7.1. Vizualizare agent I (3.5): Hexaclorofenul este indicat de un spot albastrui pe un fond fluorescent galben-portocaliu şi are o valoare Rf de aproximativ 0,5. 7.2. Vizualizare agent II (3.6) Hexaclorofenul este indicat de un spot azuriu spre turcoaz pe un fond alb şi are o valoare Rf de aproximativ 0,5. B. DETERMINARE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICAŢIE Aceasta este metoda reglementată pentru determinare hexaclorofen din produsele cosmetice. 2. DEFINIŢIE Conţinutul de hexaclorofen în proba determinat conform acestei metode este exprimat în procente masice de hexaclorofen. 3. PRINCIPIU Hexaclorofenul este determinat, după conversia la derivat mediat, prin cromografie de gaze cu detector cu captura de electroni. 4. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 4.1. Acetat de etil 4.2. N-metil-N-nitrozo-p-toluensulfonamida (diazald) 4.3. Dietileter 4.4. Metanol 4.5. Carbitol: 2-(2-etoxietoxi)etanol 4.6. Acid formic 4.7. Hidroxid de potasiu, soluţie apoasă 50% (m/m) (zilnic proaspăt preparata) 4.8. Hexan pentru spectroscopie 4.9. Bromclorofen (standard nr. 1) 4.10. 4,4',6,6'-tetracloro-2,2'-tiodifenol (standard nr. 2) 4.11. 2,4,4'-tricloro-2-hidroxi-difenileter (standard nr. 3) 4.12. Acetona 4.13. Acid sulfuric 4 M 4.14. Celita AW 4.15. Acid formic/acetat de etil, soluţie 10% (v/v) 4.16. Hexaclorofen 5. APARATURA 5.1. Sticlarie uzuală de laborator 5.2. Miniaparatura pentru prepararea diazometanului (Analyt. Chem. 1973, 45, 2302-2) 5.3. Cromatograf de gaze echipat cu un detector cu captura de electroni cu sursa 63 Ni 6. PROCEDEU 6.1. Preparare soluţie standard Standardul este ales astfel încât sa nu interfereze cu nici o substanta conţinută în excipient produsului de analizat. De obicei standardul nr. 1 este cel mai adecvat (4.9) 6.1.1. Într-un balon cotat de 100 ml se cantaresc cu precizie 50 mg standard nr. 1, 2 sau 3 (4.9, 4.10 sau 4.11) şi 50 mg de hexaclorofen (4.16). Se aduce la semn cu acetat de etil (4.1) (soluţie A). Se dilueaza 10 ml soluţie A cu acetat de etil (4.1) pana la 100 ml. (soluţie B) 6.1.2. Într-un balon cotat de 100 ml se cantaresc cu precizie 50 mg de standard nr. 1, 2 sau 3 (4.9, 4.10 sau 4.11). Se aduce la semn cu acetat de etil (4.1) (soluţie C). 6.2. Preparare proba. Se cântăreşte cu precizie 1 g proba omogenizata şi se amesteca foarte bine cu 1 ml acid sulfuric (4.13), 15 ml acetona (4.12) şi 8 g Celita AW (4.14). Se usucă amestecul la aer pe o baie de abur timp de 30 minute, apoi se usucă o ora şi jumătate într-un cuptor cu ventilaţie. Se raceste, se marunteste fin reziduul şi se transfera într-o coloana de sticla. Se elueaza cu acetat de etil (4.1) şi se colectează 100 ml. Se adauga 2 ml soluţie standard intern (soluţie C) (6.1.2). Obs: deoarece exista un domeniu larg de tipuri de produse în care hexaclorofenul poate fi prezent, este important ca mai întâi sa se verifice extragerea hexaclorofenului din proba prin acest procedeu înainte de înregistrarea rezultatelor. Dacă extragerile sunt mici, modificările, cum ar fi schimbarea solventului (benzen în loc de acetat de etil) etc., pot fi introduse cu acordul părţilor interesate. 6.3. Metilare proba Se racesc toţi reactivii şi aparatura între 0 şi 4°C timp de doua ore. In compartimentul exterior al aparaturii de diazometan se pun 1,2 ml soluţie obţinută la 6.2. şi 0,1 ml metanol (4.4.). Se pun circa 200 mg diazald (4.2) în rezervorul central, se adauga 1 ml carbitol (4.5) şi 1 ml dietileter (4.3) şi se dizolva. Se asambleaza aparatul, se imerseaza pe jumătate într-o baie la 0°C şi se introduc cu seringa cam 1 ml soluţie hidroxid de potasiu racita (4.7) în rezervorul central. Se asigura persistenta culorii galbene obţinută prin formarea diazometanului. Dacă culoarea galbena nu persista, se repeta metilarea cu alte 200 mg de diazald (4.2). Obs: persistenta coloratiei galbene indica un exces de diazometan, care este necesar pentru a asigura o metilare completa a probei. Aparatul se indeparteaza din baie după 15 minute apoi se lasa închis la temperatura ambianta timp de 12 ore. Se deschide aparatul, se tratează excesul de diazometan prin adăugarea catorva picaturi de soluţie acid formic în acetat de etil (4.15) 10% (v/v) şi se transfera soluţia organică într-un balon cotat de 25 ml. Se aduce la semn cu hexan (4-8). Se injecteaza 1,5 æl din aceasta soluţie în cromatograf. 6.4. Metilarea standardului Se racesc reactivii şi aparatura între 0 şi 4°C timp de doua ore. Se introduc în compartimentul extern al aparaturii de diazometan următoarele: 0,2 ml soluţie B (6.1.1) 1 ml acetat de etil (4.1) 0,1 ml metanol (4.4). Se continua metilarea conform descrierii de la 6.3. Se injecteaza în cromatograf 1,5 æl din soluţia rezultată. 7. CROMATOGRAFIERE DE GAZE Coloana trebuie sa realizeze o rezoluţie "R" egala sau mai buna decât 1,5, unde:
d'[r(2) - r(1)]
R = 2 ───────────────
W(1) + W(2)
r(2) şi r(1) = timpii de retenţie (în minute) W(1) + W(2) = lăţimea picurilor la jumătatea inaltimii (în milimetri) d' = viteza de înregistrare a graficului (în milimetrii per minut) Următoarele condiţii au fost găsite adecvate pentru cromatografia de gaze: Coloana: oţel inoxidabil Lungime: 1,7 m Diametru: 3 mm Suport: chromosorb: WAW analiza sitei: 80 la 100 mesh Faza stationara: 10% OV 17 Temperaturi: coloana: 280°C injector: 280°C detector: 280°C Gaz purtător: azot fără oxigen Presiune: 2,3 bar Debit: 30 ml/min. 8. CALCUL 8.1. Coeficient de proportionalitate al hexaclorofenului Acesta este calculat fata de standardele alese, în legătura cu amestecul standard. Fie: h = hexaclorofenul k(h) = coeficientul sau de proportionalitate m'(h) = masa sa (în grame) în amestec A'(h) = aria picului sau s = standardul ales m'(s) = masa sa (în grame) în amestec A'(s) = aria picului standardului atunci:
m'(h) A'(s)
k(h) = ───── x ─────
m'(s) A'(h)
8.2. Cantitatea de hexaclorofen în proba Fie: h = hexaclorofenul k(h) = coeficientul sau de proportionalitate A(h) = aria picului sau s = standardul ales m(s) = masa sa (în grame) în amestec A(s) = aria picului sau M = masa (în grame) de proba pentru testare luată atunci procentul % (m/m) de hexaclorofen din proba este:
m(s) x k(h) x A(h) x 100
────────────────────────
M x A(s)
9. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de hexaclorofen de 0,1% (m/m), diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceiaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,005% (m/m). ANEXA 21 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU TOSILCLORAMIDA DE SODIU (CLORAMINA -T) 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta este metoda reglementată pentru determinarea cantitativă prin cromatografie în strat subtire a tosilcloramidei de sodiu (cloramina-T) în produsele cosmetice. 2. DEFINIŢIE Conţinutul de cloramina-T din proba, determinat conform acestei metode, este exprimat ca procentaj masic (m/m). 3. PRINCIPIU Cloramina-T este hidrolizata complet la 4-toluensulfonamida prin fierbere cu acid clorhidric. Cantitatea de 4-toluensulfonamida formată este determinata foto-densiometric prin cromatografie în strat subtire. Cantitatea de 4-toluensulfonamida formată se determina foto-densiometric prin cromatografie în strat subtire. 4. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 4.1. Tosilcloramina de sodiu (cloramina-T) 4.2. Soluţie standard de 4-toluensulfonamida: 50 mg de 4-toluensulfonamida în 100 ml etanol (4.5) 4.3. Acid clorhidric, 37% (m/m), d(4)^2 [] = 1,18 g/ml. 4.4. Dietileter 4.5. Etanol, 96% (v/v) 4.6. Solvent de developare 4.6.1. 1-butanol/etanol (4.5)/apa (40:4:9; v/v/v), sau 4.6.2. cloroform/acetona (6:4; v/v). 4.7. Plăci pentru cromatografie în strat subtire gata pregătite, silicagel 60, fără indicator fluorescent. 4.8. Permanganat de potasiu 4.9. Acid clorhidric, 15% (m/m). 4.10. Reactiv pulverizat: 2-toluidina, soluţie în etanol 1% (m/v) (4.5) 5. APARATURA 5.1. Aparatura uzuală de laborator 5.2. Echipament uzual pentru cromatografie în strat subtire 5.3. Fotodensitometru. 6. PROCEDEU 6.1. Hidroliza Se cântăreşte cu precizie într-un balon cu fund rotund de 50 ml cca. 1 g de proba ("m"). Se adauga 5 ml apa şi 5 ml acid clorhidric (4.3.) şi se fierbe o ora folosind un condensator de reflux. Se transfera imediat suspensia fierbinte cu apa într-un balon gradat de 50 ml. Se lasa sa se raceasca şi se completează pana la semn cu apa. Se centrifugheaza la cel puţin 3000 rpm pentru 5 minute şi se trece lichidul supernatant printr-un filtru. 6.2. Extracţie 6.2.1. Se iau 30 ml filtrat şi se extrage de trei ori cu 15 ml dietileter (4.4). Dacă este necesar se usucă fazele eterice şi se colectează acestea într-un balon cotat de 50 ml. Se aduce la semn cu dietileter. (4.4). 6.2.2. Se iau 25 ml extract eteric uscat şi se evapora pana la uscare totală într-un curent de azot. Se redizolva reziduul cu 1 ml etanol (4.5). 6.3. Cromatografie în strat subtire 6.3.1. Se picura 20 æl reziduu etanolic (6.2) pe o placa de cromatografie în strat subtire (4.7). In acelaşi timp şi în acelaşi mod se picura 8, 12, 16 şi 20 æl de soluţie standard de 4-toluensulfonamida (4.2). 6.3.2. Apoi se lasa la developare cca. 150 mm în solvent de developare (4.6.1 sau 4.6.2). 6.3.3. După evaporarea completa a solventului de developare, se pune placa pentru doua sau trei minute într-o atmosfera de vapori de clor, care este produsă turnand 100 ml acid clorhidric (4.9) peste cca. 2 g permanganat de potasiu (4.8) într-un vas închis. Se indeparteaza excesul de clor prin încălzirea placii la 100°C timp de cinci minute. Apoi se pulverizeaza placa cu reactiv (4.10). 6.4. Măsurare După aproximativ o ora, se măsoară spoturile violete prin intermediul unui fotodensitometru la 525 nm. 6.5. Trasarea curbelor de etalonare Se traseaza valorile inaltimii picului maxim descoperite pentru cele 4 spoturi de 4-toluensulfonamida fata de cantităţile corespondente de 4-toluensulfonamida (adică 4, 6, 8, 10 æg 4-toluensulfonamida/spot) 7. NOTA Metoda poate fi controlată prin folosirea unei soluţie de 0,1 sau 0,2% (m/v) cloramina-T (4.1) tratata în acelaşi mod ca proba (6). 8. CALCUL Conţinutul de cloramina-T din proba, exprimat ca procentaj masic, se calculează astfel:
1,33 x a
% (m/m) tosilcloramida de sodiu = ────────
60 x m
unde: 1,33 = factor de conversie 4-toluensulfonamida - cloramina-T a = cantitatea (în æg) de 4-toluensulfonamida în proba citită de pe curbele de etalonare m = masa (în grame) a probei luate în analiza 9. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de cloramina-T de cca. 0,2 % (m/m) diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,03% (m/m). ANEXA 22 METODA DE DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU FLUORUL TOTAL DIN PRODUSELE PENTRU ÎNGRIJIREA DINŢILOR 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta este metoda reglementată pentru determinarea fluorului total în pastele de dinţi. Este adecvată pentru concentraţii care nu depăşesc 0,25%. 2. DEFINIŢIE Conţinutul de fluor din proba determinat conform acestei metode este exprimat ca procentaj masic. 3. PRINCIPIU Determinarea este realizată prin cromatografie de gaze. Fluorul din compuşii conţinând fluor este convertit la trietilfluorsilan (TEFS) prin reactie directa cu clortrietilxilan (TECS) în soluţie acida şi simultan extras cu xilen conţinând ciclohexan ca standard intern. 4. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 4.1. Fluorura de sodiu, uscata la 120°C la masa constanta. 4.2. Apa, dublu distilata, sau de calitate echivalenta. 4.3. Acid clorhidric, d(4)^2 [] = 1,19 g/ml 4.4. Ciclohexan (CH) 4.5. Xilen fără vârfuri în cromatograma anterioare vârfului solventului când se cromatografiaza în aceleaşi condiţii ca şi proba (6.1). Dacă este necesar se purifica prin distilare. 4.6. Clortrietilxilan (TECS Merck sau un echivalent). 4.7. Soluţii standard de fluor 4.7.1. Soluţie stoc, 0,250 mg F^-/ml. Se cantaresc cu precizie 138,1 mg fluorura de sodiu (4.1) şi se dizolva în apa (4.2). Se transfera soluţia cantitativ într-un balon cotat de 250 ml (5.5). Se dilueaza pana la semn cu apa (4.2) şi se amesteca. 4.7.2. Soluţie stoc diluata, 0,050 mg F^-/ml. Se transfera cu pipeta 20 ml din soluţia stoc (4.7.1) într-un balon cotat de 100 ml (5.5). Se dilueaza pana la semn cu apa (4.2) şi se amesteca. 4.8. Soluţie standard intern Se amesteca 1 ml ciclohexan (4.4) cu 5 ml xilen (4.5). 4.9. Clortrietilxilan/soluţie standard intern Se transfera, cu pipeta (5.7), 0,6 ml TECS (4.6) şi 0,12 ml soluţie standard intern (4.8) într-un balon cotat de 10 ml. Se dilueaza cu xilen (4.5) pana la semn şi se amesteca. Se prepara proaspăt zilnic. 4.10. Acid percloric, 70% (m/v) 4.11. Acid percloric, 20% (m/v) în apa (4.2) 5. APARATURA 5.1. Echipament standard de laborator 5.2. Cromatograf de gaze cu un detector cu ionizare în flacara. 5.3. Amestecător turbionar Vortex sau echivalent. 5.4. Buhler, vibrator, tip SMB(1) sau echivalent. 5.5. Baloane cotate, 100 şi 250 ml, din polipropilena. 5.6. Eprubete de centrifuga (sticla); 20 ml cu capac filetat teflonat, Sovirel tip 611-56 sau echivalent. Se curata eprubetele şi dopurile prin plasare în acid percloric (4.11) câteva ore, urmată de cinci clătiri ulterioare cu apa (4.2) şi în final uscare la 100°C. 5.7. Pipete, reglabile pentru distribuirea de volume între 50 şi 200 æl, cu vârfuri de plastic detasabile. 5.8. Aparatura de distilare, echipata cu coloana Schneider cu trei bule sau o coloana echivalenta Vigreux. 6. PROCEDEU 6.1. Analiza proba 6.1.1. Se selecteaza un tub de pasta de dinţi nedeschis anterior, se deschide şi se indeparteaza tot conţinutul. Se transfera într-un recipient de plastic, se amesteca temeinic şi se păstrează în condiţii care nu permit deteriorarea. 6.1.2. Se cantaresc cu precizie 150 mg ("m") de proba într-o eprubeta de centrifugare (5.6), se adauga 5 ml apa (4.2) şi se omogenizeaza (5.3). 6.1.3. Se adauga 1 ml xilen (4.5). 6.1.4. Se adauga cu picatura 5 ml acid clorhidric (4.3) şi se omogenizeaza (5.3). 6.1.5. Se adauga, cu pipeta, 0,5 ml clorotrietilsilan/soluţie standard interna (4.9) într-o eprubeta de centrifuga (5.6). 6.1.6. Se închide eprubeta cu un dop filetat (5.6) şi se amesteca temeinic timp de 45 minute pe un vibrator (5.4.) setat la 150 miscari per minut. 6.1.7. Se centrifugheaza 10 minute la o asemenea viteza încât sa se producă o separare neta a fazelor, se deschide eprubeta, se scoate stratul organic şi se injecteaza 3 æl din faza de organică în coloana cromatografului de gaze (5.2). Observatie: Durează cca. 20 de minute pentru ca toţi componenţii sa fie eluati. 6.1.8. Se repeta injectarea, se calculează raportul suprafeţei de pick mediu (A(TEFS)/A(CH)) şi se citeşte cantitatea corespunzătoare de fluor (în miligrame ("ml") de pe curba de etalonare (6.3) 6.1.9. Se calculează conţinutul de fluor total din proba (în procente masice de fluor) după cum este indicat la paragraful 7. 6.2. Condiţii de cromatografiere 6.2.1. Coloana: oţel inoxidabil Lungime: 1,8 m Diametru: 3 mm Suport: Gaschrom 80 pana la 100 mesh. Faza stationara: ulei siliconic DC 200 sau echivalent, 20%. Se condiţionează coloana peste noapte la 100°C (debit de gaz purtător la 25 ml azot per minut) şi se repeta în fiecare noapte. După fiecare 4 sau 5 injectari se reconditioneaza coloana prin încălzire pentru 30 minute la 100°C. Temperaturi: coloana: 70°C injector: 150°C detector: 250°C Debit de gaz purtător: 35 ml azot per minut. 6.3. Curba de etalonare 6.3.1. Se pun cu pipeta în şase eprubete de centrifuga (5.6) 0, 1, 2, 3, 4 şi 5 ml soluţie standard de fluor diluata (4.7.2). Se aduce la un volum de 5 ml cu apa (4.2). 6.3.2. Se procedează conform descrierii de la 6.1.3 pana la 6.1.6 inclusiv. 6.3.3. Se injecteaza 3 æl de faza organică în coloana cromatografului de gaze (5.2.) 6.3.4. Se repeta injectarea şi se calculează raportul vârfului mediu (A(TEFS)/A(CH)). 6.3.5. Se traseaza curba de etalonare coreland masa de fluor (în miligrame) în soluţiile standard (6.3.1) şi raportul suprafeţei de vârf A(TEFS)/A(CH) măsurat în condiţiile 6.3.4. Se unesc punctele graficului cu linia dreapta interpolata cel mai bine calculată prin analiza de regresie. 7. CALCUL Concentraţia conţinutului de fluor total din proba (în procente masice de fluor) (% (m/m) F) este data de:
m(1)
% F = ──── x 100% m
m
unde: m = proba pentru testare (în miligrame) (6.1.2) m(1) = cantitatea de F (în miligrame) citită de pe curba de etalonare (6.1.8) 8. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de fluor de cca. 0,15% (m/m), diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească în valoare absolută de 0,012% (m/m). ANEXA 23 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU COMPUŞII ORGANO-MERCURICI SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Metoda descrisă mai jos este reglementată pentru a fi utilizata la identificarea şi determinarea derivatilor organomercurici introdusi cu rol de conservanţi în produsele cosmetice pentru ochi. Este aplicabilă tiomersalului (denumire INN) (2-(etilmercur)benzoat de sodiu) şi fenilmercurului şi sarurilor sale. A. IDENTIFICARE 1. PRINCIPIU Compuşii organomercurici sunt combinati cu 1,5-difenil-3-tiocarbazona. După extracţia ditizonatului cu tetraclorura de carbon, silicagel, se realizează cromatografia în strat subtire. Spoturile de ditizonati apar colorate oranj. 2. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 2.1. Acid sulfuric, 25% (v/v) 2.2. 1,5-difenil-3- tiocarbazona (ditizona): 0,8 mg în 100 ml tetraclorura de carbon (2.4) 2.3. Azot 2.4. Tetraclorura de carbon 2.5. Solvent de developare: hexan/acetona, 90:10 (v/v) 2.6. Soluţie standard, 0,001% în apa, de: 2-(etilmercur)benzoat de sodiu clorura de etilmercur sau clorura de metilmercur nitrat de fenilmercur sau acetat de fenilmercur diclorura de mercur sau diacetat de mercur 2.7. Plăcute cu silicagel gata preparate (de ex. Merck 5721 sau echivalent) 2.8. Clorura de sodiu 3. APARATURA 3.1. Echipament normal de laborator 3.2. Aparatura normală pentru cromatografie în strat subtire (CSS) 3.3. Filtru separator de faze 4. PROCEDEU 4.1. Extracţie 4.1.1. Se dilueaza 1 g proba într-o eprubeta de centrifuga prin titrare cu 20 ml apa distilata. Se obţine dispersia maxima şi se incalzeste la 60°C pe baie de apa. Se adauga 4 g clorura de sodiu (2.8). Se agita. Se lasa sa se raceasca. 4.1.2. Se centrifugheaza cel puţin 20 minute la 4500 rot/minut pentru a separa cea mai mare parte a solidului de lichid. Se filtreaza printr-o palnie de separare şi se adauga 0,25 ml soluţie de acid sulfuric (2.1). 4.1.3. Se extrage de mai multe ori cu 2 sau 3 ml soluţie de ditizona (2.2) pana când ultima faza organică rămâne verde. 4.1.4. Se filtreaza secvential fiecare faza organică printr-un filtru separator de faze (3.3). 4.1.5. Se evapora pana la uscare totală într-un curent de azot (2.3). 4.1.6. Se dizolva cu 0,5 ml de tetraclorura de carbon (2.4.). Se foloseşte aceasta soluţie imediat, conform 4.2.1. 4.2. Separare şi identificare 4.2.1. Se pun imediat 50 æj soluţie de tetraclorura de carbon obţinută la 4.1.6 pe o placa cu silicagel (2.7). Se tratează simultan 10 ml soluţie standard (2.6) ca la 4.1. şi se pun 50 æl din soluţia obţinută la 4.1.6. pe aceeaşi placa. 4.2.2. Se pune placa în solvent (2.5) şi se lasa pana acesta avansează 150 mm. Compuşii organomercurici apar ca spoturi colorate a căror culoare este stabilă, dacă placa este acoperită cu o placa de sticla imediat după evaporarea solventului. Ca exemplu, s-au obţinut următoarele valori Rf:
───────────────────────────────────────────────────────
Rf Culoare
───────────────────────────────────────────────────────
Tiomersal 0,33 oranj
Clorura de etilmercur 0,29 oranj
Clorura de metilmercur 0,29 oranj
Saruri fenilmercurice 0,21 oranj
Saruri mercurice (II) 0,10 oranj
Diacetat de mercur 0,10 oranj
1,5-difenil-3-tiocarbazond 0,09 roz
───────────────────────────────────────────────────────
B. DETERMINARE 1. DEFINIŢIE Conţinutul de compuşi organomercurici determinat prin aceasta metoda este exprimat în procente de masa (m/m) ca mercur în proba. 2. PRINCIPIU Metoda consta în măsurarea cantităţii totale de mercur prezent. Este de aceea necesar a ne asigura ca nu este prezent mercur într-o stare anorganica şi sa fie identificat derivatul organomercuric conţinut în proba. După mineralizare, mercurul eliberat este măsurat prin absorbţie atomică fără flacara. 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 3.1. Acid azotic concentrat, d(4)^2 [] = 1,41 g/ml 3.2. Acid sulfuric concentrat d(4)^2 [] = 1,84 g/ml. 3.3. Apa redistilata 3.4. Permanganat de potasiu, soluţie 7% (m/v) 3.5. Clorura de hidroxilamoniu, soluţie 1,5% (m/v) 3.6. Peroxodisulfat dipotasic, soluţie 5% (m/v) 3.7. Diclorura de staniu, soluţie 10% (m/v) 3.8. Acid clorhidric concentrat, d(4)^2 [] = 1,18 g/ml. 3.9. Diclorura de paladiu impregnata pe vata de sticla, 1% (m/m). 4. APARATURA 4.1. Echipament uzual de laborator 4.2. Aparatura pentru determinarea mercurului prin absorbţie atomică fără flacara (tehnica vaporilor reci) incluzând sticlaria necesară. Lungimea de cale a cuvei cel puţin 100 mm. 5. PROCEDEU Se iau toate măsurile normale de protecţie pentru analiza urmelor de mercur. 5.1. Separare 5.1.1. Se cantaresc cu precizie 150 mg proba ("m"). Se adauga 10 ml acid azotic (3.1.) şi se lasa pentru 3 ore într-un flacon etanş pus într-o baie de apa la 55°C, agitandu-l la intervale regulate, în acelaşi timp, se realizează un test orb pe reactivi. 5.1.2. După răcire, se adauga 10 ml acid sulfuric (3.2.) şi se lasa din nou în baia de apa la 55°C timp de 30 minute 5.1.3. Se pune flaconul într-o baie de gheaţa şi se adauga cu grija 20 ml apa (3.3). 5.1.4. Se adauga o porţiune de 2 ml soluţie permanganat de potasiu 7% (3.4) pana când soluţia rămâne colorata. Se pune din nou în baia de apa la 55°C pentru încă 15 minute. 5.1.5. Se adauga 4 ml soluţie peroxodisulfat de dipotasiu (3.6). Se continua încălzirea în baie de apa la 55°C pentru 30 minute 5.1.6. Se lasa la racit şi se transfera conţinutul flaconului într-un balon cotat de 100 ml. Se clateste vasul cu 5 ml clorura de hidroxilamoniu (3.5) şi apoi se clateste de patru ori cu 10 ml apa (3.3). Soluţia trebuie sa fie complet decolorata. Se aduce la semn cu apa (3.3). 5.2. Determinare 5.2.1. Se pun 10 ml soluţie test (5.1.6) într-un vas de sticla pentru determinarea mercurului în vapori reci (4.2). Se dilueaza cu 100 ml apa (3.3) şi consecutiv cu 5 ml acid sulfuric (3.2) şi 5 ml soluţie diclorura de staniu (3.7). Se amesteca după fiecare adăugare. Se aşteaptă 30 de secunde pentru reducerea tuturor ionilor de mercur la stare metalică şi se face o citire ("n"). 5.2.2. Se pune vata de sticla impregnata cu diclorura de paladiu (3.9) între vasul de reducere a mercurului şi cuva de curgere a instrumentului (4.2). Se repeta 5.2.1. şi se înregistrează citirea. Dacă citirea nu este zero, mineralizarea nu a fost completa şi analiza trebuie repetată. 6. CALCUL Fie: m = masa (în miligrame) a probei pentru testare n = cantitatea de mercur (în æg) citită pe instrument Cantitatea de mercur, exprimată ca mercur, în procente de masa, se calculează cu formula: % mercur = n/m 7. NOTE 7.1. Pentru îmbunătăţirea mineralizarii poate fi necesar sa se înceapă prin diluarea probei. 7.2. Dacă absorbtia mercurului pe substrat este suspectabila, trebuie făcuta o determinare cantitativă prin metoda adaosurilor standard. 8. REPETABILITATE (ISO 5725) In cazul unei concentraţii de mercur de 0,007%, diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceesi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,00035% ANEXA 24 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU SULFURI ALCALINE SI ALCALINO-PAMANTOASE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta este metoda reglementată pentru determinarea sulfurilor prezente în produsele cosmetice. Prezenta tiolilor sau a altor agenţi reducatori (inclusiv sulfitii) nu interfereaza. 2. DEFINIŢIE Concentraţia sulfurilor determinata prin aceasta metoda se exprima ca procente masice de sulf. 3. PRINCIPIU După acidifierea mediului, hidrogenul sulfurat este antrenat într-un curent de azot şi apoi fixat sub forma de sulfura de cadmiu. Aceasta se filtreaza şi se clateste şi apoi este determinata iodometric. 4. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 4.1. Acid clorhidric concentrat, d(4)^2 [] = 1,19 g/ml. 4.2. Tiosulfat de sodiu, soluţie standard 0,1 M 4.3. Iod, soluţie standard 0,05 M 4.4. Sulfura disodica 4.5. Diacetat de cadmiu 4.6. Amoniac concentrat, d(4)^2 [] = 0,90 g/ml. 4.7. Soluţia amoniacala de diacetat de cadmiu: se dizolva 10 g diacetat de cadmiu (4.5) în cca. 50 ml apa. Se adauga amoniac (4.6) pana când precipitatul se redizolva (de ex. aproximativ 20 ml). Se aduce la 100 ml cu apa. 4.8. Azot 4.9. Soluţie de amoniac M 5. APARATURA 5.1. Echipament uzual de laborator 5.2. Balon cu fund rotund şi trei gaturi rodate standard de 100 ml 5.3. Doua flacoane conice de 150 ml cu gat rodat, echipate cu un dispozitiv alcătuit dintr-o tub plonjor şi o ţeava de ieşire laterala pentru eliminarea gazelor antrenate. 5.4. Palnie cu tija lungă 6. PROCEDEU 6.1. Antrenarea sulfurilor 6.1.1. Se ia o proba pentru testare care nu a fost deschisă anterior. Se cântăreşte cu precizie în balonul cu fund rotund (5.2) o cantitate ("m") (exprimată în grame) de produs corespunzand la nu mai mult de 30 mg ioni sulfura (5.2). Se adauga 60 ml apa şi 2 picaturi lichid antispumant. 6.1.2. Se transfera 50 ml soluţie (4.7) în fiecare dintre cele doua flacoane conice (5.3.) 6.1.3. Se fixează palnia picuratoare, tubul plonjor şi ţeava de ieşire pe balonul cu fund rotund (5.2). Se conecteaza ţeava de ieşire la flacoanele conice (5.3) montate în serie prin intermediul unor ţevi de PVC. NB: Aparatul de antrenare trebuie sa fie treacă de următorul test de etanşeitate: simuland condiţiile de testare, se înlocuieşte produsul care urmează sa fie determinat în 10 ml soluţie de sulfura (preparata la 4.4) conţinând "X mg" de sulfura (determinata iodometric). Fie "Y" numărul de miligrame de sulfura găsit la sfârşitul acestei operaţii. Diferenţa dintre cantitatea "X" şi cantitatea "Y" nu trebuie sa depăşească 3%. 6.1.4. Se trece curent de azot (4.8) prin interior timp de 15 minute, cu un debit de doua bule pe secunda, în vederea eliminării aerului conţinut în balonul cu fund rotund (5.2.) 6.1.5. Se incalzeste balonul cu fund rotund la 85 § 5°C. 6.1.6. Se opreşte curentul de azot (4.8) şi se adauga 40 ml de acid clorhidric (4.1) picatura cu picatura. 6.1.7. Se porneşte din nou curentul de azot (4.8) atunci când aproape tot acidul a fost transferat, lăsând un pat de lichid minim pentru a preveni scaparile de hidrogen sulfurat. 6.1.8. Se opreşte încălzirea după 30 minute. Se lasa flaconul (5.2) sa se raceasca şi se continua trecerea curentului de azot (4.8) prin interior pentru cel puţin o ora şi jumătate. 6.2. Titrare 6.2.1. Se filtreaza sulfura de cadmiu printr-o palnie cu tija lungă (5.4). 6.2.2. Se clatesc flacoanele conice (5.3) mai întâi cu soluţie amoniacala (4.9) şi se toarna în filtru. Apoi se clateste cu apa distilata şi se foloseşte apa pentru a spala precipitatul reţinut de filtru. 6.2.3. Se completează apa de spalare a precipitatului cu 100 ml apa. 6.2.4. Se pune hârtie de filtru în primul flacon conic care conţine precipitatul. Se adauga 25 ml ["n(1)"] soluţie de iod (4.3), cca. 20 ml acid clorhidric (4.1) şi 50 ml apa distilata. 6.2.5. Se determina excesul de iod folosind soluţie de tiosulfat de sodiu ("n'") (4.2). 7. CALCUL Conţinutul de sulfura al probei, exprimat ca sulf, în procente masice, se calculează cu următoarea formula:
32[n(1)x(1) - n(2)x(2)]
% sulfura = ────────────────────────
20m
unde: n(1) = numărul (în mililitrii) de soluţie standard de iod (4.3) folosit x(1) = molaritatea acestei soluţii n(2) = numărul (în mililitrii) de soluţie standard de tiosulfat de sodiu (4.2) x(2) = molaritatea acestei soluţii m = masa (în grame) a probei pentru testare 8. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de sulfura de cca. 2% (m/m), diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,2% (m/m). ANEXA 25 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU alfa-MONO GLICERIL 4-AMINOBENZOAT A. IDENTIFICARE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta metoda reglementează identificarea alfa - mono (gliceril 4-aminobenzoatului şi identificarea etil 4-aminobenzoatul (benzocaina:INN) ce poate fi prezent ca impuritate. 2. PRINCIPIU Aceasta identificare este făcuta prin cromotografie în strat subtire pe silicagel cu un indicator de fluorescenta şi detectia grupului de amine primare libere prin formarea de unui colorant diazo pe placa. 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 3.1. Amestec solvent: ciclohexan/2-propanol/diclormetan stabilizat 48/64/9 (v/v/v). 3.2. Solvent de developare: gazolina (40-60)/benzen/acetona/soluţie hidroxid de amoniu [NH(2) minim 25%]:35/35/35/1 (v/v/v/v). 3.3. Soluţie de developare: (a) azotit de sodiu: 1 g în 100 ml acid clorhidric 1 M (preparat imediat înainte de folosire). (b) 2-naftol: 0,2 g în 100 ml de hidroxid de potasiu 1 M 3.4. Soluţii standard: alfa-monogliceril 4-aminobenzoat: 0,05 g în 100 ml solvent amestecat 3.1 etil 4-aminobenzoat: 0,05 g în 100 ml solvent amestecat 3.1 3.5. Plăci cu silicagel 60 F254, 0,25 mm grosime, 200 mm x 200 mm 4. APARATURA 4.1. Aparatura uzuală pentru cromatografie în strat subtire 4.2. Vibrator ultrasonic. 4.3. Filtru Millipore FH 0,5 æm ori echivalent 5. PROCEDEU 5.1. Prepararea probei Se cantaresc 1,5 g produs de analizat într-un balon cotat cu dop de 10 ml. Se aduce la semn cu solvent (3.1). Se închide şi se lasa pentru o ora la temperatura camerei într-un vibrator ultrasonic (4.2). Se filtreaza printr-un filtru Millipore (4,3), şi se foloseşte filtratul pentru cromotagrafiere. 5.2. Cromatografiere în strat subtire Se pipeteaza pe placa (3.5) câte 10 æl soluţie proba (5.1) şi din fiecare soluţie standard (3.4). Se developeaza cromatograma pana la o înălţime de 150 mm într-un tanc saturat anterior cu solvent 3.2. Se lasa placa sa se usuce la temperatura ambianta. 5.3. Developare 5.3.1. Se observa placa în lumina UV la 254 nm. 5.3.2. Se pulverizeaza placa complet uscata cu soluţie 3.3 (a). Se lasa sa se usuce la temperatura camerei pentru 1 minut şi imediat se pulverizeaza cu soluţie 3.3. Se usucă placa într-o etuva la 60°C. Spoturile ce apar au o culoare oranj. Alfa-monogliceril 4-aminobenzoat: Rf 0,07; etil 4-aminobenzoat: Rf 0,5. B. DETERMINARE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta metoda reglementează determinarea alfa monogliceril-(4-aminobenzoatul)ului. Se determina de asemenea etil-4-aminobenzoatul. Nu se poate determina mai mult de 5% (m/m) alfa-mono-gliceril 4-aminobenzoat şi mai mult de 1% (m/m) etil- 4-aminobenzoat. 2. DEFINIŢIE Conţinutul de alfa-mono-gliceril 4-aminobenzoat şi de etil- 4-aminobenzoat măsurat prin aceasta metoda este exprimat în procente masice (% m/m) de produs. 3. PRINCIPIU Produsul de analizat este suspendat în metanol şi după un tratament adecvat al probei este determinat prin cromatografie de lichide de înalta performanta (HPLC). 4. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica şi trebuie sa fie adecvati pentru HPLC. 4.1. Metanol 4.2. Ortofosfat diacid de potasiu [KH(2)PO(4)] 4.3. Diacetat de zinc Zn[CH(3)COO](2) ● 2H(2)O 4.4. Acid acetic (d(4)^2 [] = 1,05) 4.5. Hexacianoferat de tetrapotasiu (K(4)[Fe(CN)(6)] ● 3H(2)O) 4.6. Etil 4-hidroxibenzoat 4.7. Alfa monogliceril 4-aminobenzoat 4.8. Etil 4-aminobenzoat 4.9. Soluţie tampon de fosfat (0,02 M): se dizolva 2,72 g ortofosfat diacid de potasiu (4.2) într-un litru de apa 4.10. Eluent: soluţie tampon de fosfat (4,9)/metanol (4.1) 61/39 (v/v) Compoziţia fazei mobile poate fi schimbată în scopul de a obţine un factor de resolutie R >= 1,5.
R(2) - R(1)
R = 2d' --------------
W(1) + W(2)
unde: R(1) şi R(2) = timpii de retenţie, în minute, ai picurilor W(1) şi W(2) = lăţimea picurilor la jumătatea inaltimii, în milimetrii d' = viteza de înregistrare a graficului, în milimetri per minut 4.11. Soluţie stoc de alfamonogliceril 4-aminobenzoat: într-un balon cotat de 100 ml se cantaresc cu precizie 40 mg alfamonogliceril 4-aminobenzoat. Se dizolva în 40 ml metanol (4.1). Se aduce la semn cu soluţie tampon (4.9) şi se amesteca. 4.12. Soluţie stoc de etil 4-aminobenzoat: într-un balon cotat de 100 ml se cantaresc cu precizie 40 mg etil 4-aminobenzoat. Se dizolva în 40 ml metanol (4.1). Se aduce la semn cu soluţie tampon (4.9) şi se amesteca. 4.13. Soluţie standard intern: într-un balon cotat de 100 ml se cantaresc cu precizie 5 mg etil 4-hidroxibenzoat. Se dizolva în 40 ml metanol (4.1). Se aduce la semn cu soluţie tampon (4.9) şi se amesteca. 4.14. Soluţii standard: se prepara patru soluţii standard prin dizolvarea în 100 ml eluent (4.10) conform tabelului de mai jos:
───┬───────────────────┬───────────────────┬─────────────────────
│ Alfa monogliceril │ │
│ 4-aminobenzoat │Etil 4-aminobenzoat│Etil 4-hidroxibenzoat
├─────────┬─────────┼─────────┬─────────┼─────────┬───────────
│æg/ml(*) │ml (4.11)│æg/ml(*) │ml (4.12)│æg/ml(*) │ ml (4.13)
───┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼───────────
I│ 8 │ 2 │ 8 │ 2 │ 50 │ 10
II│ 16 │ 4 │ 12 │ 3 │ 50 │ 10
III│ 24 │ 6 │ 16 │ 4 │ 50 │ 10
IV│ 40 │ 10 │ 20 │ 5 │ 50 │ 10
───┴─────────┴─────────┴─────────┴─────────┴─────────┴───────────
Aceste valori sunt date ca o indicaţie şi corespund la mase
exacte din 4.11, 4.12 şi 4.13.
NB: aceste soluţii pot fi preparate în moduri diferite.
─────────────────────────────────────────────────────────────────
4.15. Soluţie Carrez I: se dizolva 26,5 g de hexacianoferat de tetrapotasiu (4.5) în apa şi se aduce la volum de 250 ml. 4.16. Soluţie Carrez II: se dizolva 54,9 g de diacetat de zinc (4.3) şi 7,5 ml acid acetic (4.4) în apa şi se aduce la volum de 250 ml. 4.17. Merck Lichrosorb RP-18, sau echivalent, cu dimensiunea medie a particulelor 5 æm. 5. APARATURA 5.1. Echipament uzual de laborator. 5.2. Echipament pentru cromatografia de înalta performanta cu detector UV cu lungime de unda variabila şi camera termostatata setata la 45°C. 5.3. Coloana de oţel inoxidabil: lungime 250 mm, diametru interior 4,6 mm; umplutura Lichrosorb RP-18 (4.17). 5.4. Baie ultrasonica. 6. PROCEDEU 6.1. Preparare proba 6.1.1. Se cântăreşte cu precizie 1 g de proba într-un pahar de 100 ml şi se adauga 10 ml metanol (4.1). 6.1.2. Se pune paharul în baia ultrasonica (5.4) timp 20 de minute pentru a se obţine o suspensie. Se transfera cantitativ suspensia astfel obţinută într-un balon cotat de 100 ml cu nu mai mult de 75 ml de eluent (4.10). Se adauga succesiv 1 ml soluţie Carrez I (4.15) şi 1 ml soluţie Carrez II (4.16) şi se amesteca după fiecare adăugare. Se aduce la semn cu eluent (4.10), se reamesteca şi se filtreaza printr-o hârtie de filtru cutata. 6.1.3. Se pipeteaza 3,0 ml din filtratul obţinut la 6.1.2. şi 5,0 ml soluţie standard intern (4.13) într-un balon cotat de 50 ml. Se aduce la semn cu eluant (4.10) de şi se amesteca. Se foloseşte soluţia astfel obţinută pentru realizarea analizei cromatografice descrisă la 6.2. 6.2. Cromatografiere 6.2.1. Se regleaza debitul fazei mobile (4.10) la 1,2 ml/min şi se seteaza temperatura coloanei la 45°C. 6.2.2. Se seteaza detectorul (5.2) la 274 nm. 6.2.3. Cu o microseringa se injecteaza cel puţin de doua ori 20 æl de soluţie (6.1.3) în cromatograf şi se măsoară suprafaţa picului. 6.3. Curba de etalonare 6.3.1. Se injecteaza 20 æl din fiecare dintre soluţiile standard (4.1.4) şi se măsoară suprafaţa picului. 6.3.2. Pentru fiecare concentraţie se calculează raportul dintre suprafeţele vârfurilor pentru alfamonogliceril 4-aminobenzoat şi suprafeţele vârfurilor pentru standardul intern. Se traseaza acest raport pe abscisa iar pe ordonată raportul maselor corespunzătoare. 6.3.3. Se procedează în acelaşi mod pentru etil 4-hidroxibenzoat. 7. CALCUL 7.1. Din curba de etalonare obţinută la 6.3. se citesc raporturile de mase (RP1, RP2), corespunzand cu raporturile dintre suprafeţele picurilor calculate la 6.2.3, unde: RP1 = masa alfamonogliceril 4-aminobenzoat/masa etil 4-hidroxibenzoat RP2 = masa etil 4-aminobenzoat/masa etil 4-hidroxibenzoat 7.2. Din raportul de mase obţinute în acest mod se calculează conţinutul de alfamonogliceril 4-aminobenzoat şi respectiv etil 4-aminobenzoat, ca procente masice (% m/m) cu ajutorul formulelor:
q
R(P) % (m/m) alfa - monogliceril 4 - aminobenzoat = RP1 x ────
6p
q
R % (m/m) etil 4 - aminobenzoat = RP2 x ────
6p
q = cantitatea de etil 4-aminobenzoat (standard intern) cantarita, în miligrame, în 4.12 p = cantitatea de proba, în grame, cantarita în 6.1.1 8. REPETABILITATE (ISO 5725) 8.1. Pentru un conţinut de 5% (m/m) alfamonogliceril 4-aminobenzoat, diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească 0,25%. Pentru un conţinut de 1% (m/m) etil 4-aminobenzoat, diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească 0,10%. 9. NOTE 9.1. Înainte de efectuarea unei analize, se verifica dacă proba conţine substanţe care ar fi pasibile sa se suprapuna pe cromatograma peste picul standardului intern (etil 4-aminobenzoat). 9.2. Pentru a verifica absenta oricărei interferente, se repeta determinarea prin schimbarea proportiei de metanol în faza mobila cu 10% relativ. ANEXA 26 METODA DE DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU CLORBUTANOL 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta este metoda reglementată pentru determinarea clorbutanolului (denumire conform INN) la o concentraţie maxima de 0,5% (m/m) în orice produs cosmetic, cu excepţia aerosolilor. 2. DEFINIŢIE Conţinutul de clorbutanol măsurat prin aceasta metoda este exprimat în procente masice % (m/m) de produs. 3. PRINCIPIU După un tratament adecvat al produsului de analizat determinarea este realizată prin cromatografie de gaze folosind 2,2,2-tricloretanol ca standard intern. 4. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 4.1. Clorbutanol (1,1,1-triclor-2-metilpropan-2-ol) 4.2. 2,2,2-tricloretanol 4.3. Etanol absolut 4.4. Soluţie standard de clorbutanol: 0,025 g în 100 ml etanol (4.3) (m/v) 4.5. Soluţie standard de 2,2,2-tricloretanol: 4 mg în 100 ml etanol (4.3) (m/v) 5. APARATURA 5.1. Echipament uzual de laborator. 5.2. Cromatograf de gaze cu detector cu electroni, Ni 63. 6. PROCEDEU 6.1. Preparare proba Se cântăreşte cu precizie între 0,1 şi 0,3 g ("p"g) de proba. Se pune într-un balon cotat de 100 ml. Se dizolva în etanol (4.3), se adauga 1 ml soluţie standard intern (4.5) şi se aduce la semn cu etanol (4.3). 6.2. Condiţii pentru cromatografia de gaze 6.2.1. Condiţiile de operare trebuie sa realizeze un factor de rezoluţie R >= 1,5:
R(2) - R(1)
R = 2d' ───────────
W(1) + W(2)
unde: R(2) şi R(1) = timpii de retenţie, în minute, ai picurilor W(1) şi W(2) = lăţimea picurilor la jumătatea inaltimii, în milimetrii d' = viteza de înregistrare a graficului, în milimetrii per minut 6.2.2. Ca exemple, următoarele condiţii de operare furnizează rezoluţia necesară:
┌────────────────────┬───────────────────────────────┬────────────────────────┐
│ Coloana │ I │ II │
├────────────────────┼───────────────────────────────┼────────────────────────┤
│Material │ Sticla │ Oţel inoxidabil │
│Lungime │ 1,80 m │ 3m │
│Diametru │ 3 mm │ 3 mm │
│Faza stationara │ 10% Carbolax 20 M TPA pe │ 5% OV 17 pe Chromosorb │
│ │ Gaschrom Q 80-100 mesh │ WAW DMCS 80-100 mesh │
│Condiţionare │ 2 la 3 zile la 90 °C │ │
│Temperaturi: │ │ │
│ - injector │ 200°C │ 150°C │
│ - coloana │ 150°C │ 100°C │
│ - detector │ 200°C │ 150°C │
│Gaz purtător │ Azot │ Argon/metan (95/5 v/v) │
│Debit │ 35 ml/min │ 35 ml/min │
└────────────────────┴───────────────────────────────┴────────────────────────┘
6.3. Curba standard Folosind 5 baloane cotate de 100 ml, se adauga 1 ml soluţie standard (4.5) şi respectiv 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 şi 0,6 ml soluţie 4.4, se aduce la semn cu etanol (4.3) şi se amesteca. Se injecteaza 1 æl din fiecare din aceste soluţii în cromatograf în conformitate cu condiţiile de operare descrise în 6.2.2. şi se construieşte o curba de etalonare prin trasarea pe abscisa a raportului dintre masa de clorbutanol şi cea de 2,2,2-tricloretanol şi pe ordonată raportul suprafeţelor picurilor corespondente. 6.4. Se injecteaza 1 æl soluţie obţinută la 6.1. şi se procedează în conformitate cu condiţiile descrise la 6.2.2. 7. CALCUL 7.3. Se calculează de pe curba standard (6.3) cantitatea "a" exprimată ca æg de clorbutanol, în soluţia 6.1 7.4. Conţinutul de clorbutanol în proba este calculat folosind următoarea formula:
a x 10^2 a
% clorbutanol (m/m) = ─────── = ─────────
p x 10^6 p x 10^4
8. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de clorbutanol de 0,5% (m/m) diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sp depăşească 0,01%. Nota ---- Dacă rezultatul este egal cu sau depăşeşte concentraţia maxim admisă este necesară verificarea absentei interferentelor. ANEXA 27 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU CHININA IN PRODUSELE PENTRU ÎNGRIJIREA PARULUI A. IDENTIFICARE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta este metoda reglementată pentru identificarea şi determinarea cantitativă a chininei în sampoane şi lotiunile pentru par. 2. PRINCIPIU Identificarea este realizată prin cromatografie în strat subtire pe silicagel. Detectia chininei este realizată prin fluorescenta albastra a chininei în condiţii acide la 360 nm. Pentru confirmare ulterioara, fluorescenta poate fi eliminata prin vapori de brom, şi vaporii de amoniac vor determina apariţia unei fluorescente galbui. 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 3.1. Plăci cu silicagel, fără indicatori fluorescenti, 0,25 mm grosime, 200 mm x 200 mm. 3.2. Solvent de developare: toluen/dietileter/diclormetan/dietilamina 20/20/20/8 (v/v/v/v) 3.3. Metanol 3.4. Acid sulfuric (96%; d(4)^2 [] = 1,84) 3.5. Dietileter 3.6. Agent de developare: se adauga cu grija 5 de acid sulfuric (3.4) la 95 ml dietileter (3.5) într-un recipient racit. 3.7. Brom 3.8. Soluţie hidroxid de amoniu (28%; d(4)^2 [] = 0,90) 3.9. Chinina, anhidră 3.10. Soluţie standard: se cantaresc cu precizie 100,0 mg chinina anhidră (3.9) într-un balon cotat şi se dizolva în 100 mg metanol (3.3). 4. APARATURA 4.1. Echipament uzual pentru cromotografie în strat subtire. 4.2. Baie ultrasonica. 4.3. Filtru Millipore, FH 0,5 æm sau echivalent cu echipament de filtrare adecvat. 5. PROCEDEU 5.1. Preparare proba Într-un balon cotat de 100 ml se cântăreşte cu precizie o cantitate de proba ce poate conţine cca. 100 mg chinina, se dizolva şi se aduce la semn cu metanol. Se astupa balonul şi se lasa pentru o ora la temperatura camerei într-un vibrator ultrasonic. Se filtreaza şi se foloseşte filtratul pentru cromatografie. 5.2. Cromatografiere în strat subtire Se pipeteaza 1,0 æl soluţie standard (3.10) şi 1,0 æl soluţie proba (5.1) pe placa cu silicagel (3.1). Se developeaza cromatograma pe o distanta de 150 mm folosind solvent 3.2 într-un tanc saturat anterior cu solvent (3.2). 5.3. Developare 5.3.1. Se usucă placa la temperatura camerei 5.3.2. Se pulverizeaza cu reactivul 3.6. 5.3.3. Se lasa placa la uscat pentru o ora la temperatura camerei. 5.3.4. Se observa în lumina unei lampi UV reglata la o lungime de unda de 360 nm. Chinina apare ca un spot fluorescent albastru intens. Ca exemplu tabelul de mai jos indica valorile Rf ale principalilor alcaloizi derivaţi din chinina când se developeaza cu solvent 3.2.
────────────────────────────────────
Alcaloid Rf
────────────────────────────────────
Chinina 0,20
Chinidina 0,29
Cinconina 0,33
Cinconidina 0,27
Hidrochinidina 0,17
────────────────────────────────────
5.3.5. Pentru confirmarea ulterioara a prezentei chininei, placa este expusă pentru cca. o ora la vapori de brom (3.7). Fluorescenta dispare. Când aceeaşi placa este expusă la vapori de amoniac (3.8), spoturile reapar cu o culoare maro, şi când placa este examinata din nou sub lumina UV la 360 nm se poate observa o fluorescenta galbuie. B. DETERMINARE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta este metoda reglementată pentru determinarea chininei. Poate fi utilizata pentru a determina concentraţia maxima admisă de 0,5% (m/m) în sampoane şi 0,2% în lotiunile pentru par. 2. DEFINIŢIE Conţinutul de chinina determinat prin aceasta metoda este exprimat în procente masice (% m/m) de produs. 3. PRINCIPIU După un tratament adecvat al produsului de analizat, determinarea este realizată prin cromatografie de lichide de înalta performanta (HPLC) 4. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica şi adecvati HPLC. 4.1. Acetonitril 4.2. Fosfat diacid de potasiu [KH(2)PO(5)] 4.3. Acid ortofosforic (85%; d(4)^2 [] = 1,7) 4.4. Bromura de tetrametilamoniu 4.5. Chinina, anhidră 4.6. Metanol 4.7. Soluţie acid ortofosforic (0,1 M): se cantaresc 11,53 g acid ortofosforic (4.3) şi se dizolva în 1.000 ml apa într-un balon cotat. 4.8. Soluţie fosfat diacid de potasiu (0,1 M): se cantaresc 13,6 g fosfat diacid de potasiu (4.2) şi se dizolva în 1.000 ml apa într-un balon cotat. 4.9. Soluţie bromura de tetrametilamoniu: se dizolva 15,40 g bromura de tetrametilamoniu în 1.000 ml apa într-un balon cotat. 4.10. Eluent: acid ortofosforic (4.7)/fosfat diacid de potasiu (4.8)/bromura de tetrametilamoniu (4.9)/apa/acetonitril (4.1) 10/50/100/340/90 (v/v/v/v/v) Compoziţia acestei faze mobile poate fi schimbată în scopul de a obţine un factor de rezoluţie R >= 1,5
R(2) - R(1)
R = 2d' ───────────
W(1) + W(2)
unde: R(1) şi R(2) = timpii de retenţie, în minute, ai picurilor W(1) şi W(2) = lăţimea picului la jumătate inaltimii, în milimetrii d' = viteza de înregistrare a graficului, în milimetrii per minut 4.11. Silice tratata cu octadecilsilan (10 æm) 4.12. Soluţii standard: într-un set de baloane cotate de 100 ml se cantaresc cu precizie cca. 5,0, 10,0, 15,0 şi respectiv 20,0 mg chinina anhidrida (4.5). Se aduce la semn cu metanol (4.6) şi se agita conţinutul baloanelor pana la dizolvarea chininei. Se filtreaza fiecare proba printr-un filtru de 0,5 æm. 5. APARATURA 5.1. Echipament uzual de laborator. 5.2. Baie ultrasonica. 5.3. Echipament pentru cromatografie de lichid de înalta performanta, cu detector cu lungime de unda variabila. 5.4. Coloana: lungime 250 mm; diametru interior 4,6 mm; umplutura silice (4.11). 5.5. Filtru Millipore FH 0,5 æm, sau echivalent, cu aparatura de filtrare adecvată. 6. PROCEDEU 6.1. Preparare proba Într-un balon cotat de 100 ml se cântăreşte cu precizie o cantitate suficienta de produs pentru a conţine 10,0 mg chinina anhidră, se adauga 20 ml metanol (4.6) şi se pune balonul într-o baie ultrasonica (5.2) pentru 20 minute. Se aduce la semn cu metanol (4.6). Se amesteca soluţia şi apoi se filtreaza o porţiune (5.5). 6.2. Cromatografiere Debit: 1,0 ml/min. Lungime de unda pentru detector (5.3): 332 nm. Volum de injectare: 10 æl din soluţia filtrata (6.1) Măsurare: suprafaţa picului. 6.3. Curba de etalonare Se injecteaza de cel puţin 3 ori 10,0 æl din fiecare soluţie de referinţa (4.12), se măsoară suprafaţa picurilor şi se calculează suprafaţa medie pentru fiecare concentraţie. Se realizează curba de etalonare şi se verifica ca aceasta sa fie rectilinie. 7. CALCUL 7.1. Din curba de etalonare (6.3) se determina cantitatea în æg de chinina anhidră prezenta în volumul injectat (6.2) 7.2. Concentraţia de chinina anhidră în proba, ca procentaj masic (% m/m), este obţinută utilizând formula următoare:
B
% (m/m) chinina anhidră = ───
A
unde: B = este cantitatea, în micrograme, de chinina anhidră determinata în cei 10 æl de soluţie filtrata (6.1) A = este masa probei, în grame (6.1) 8. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de chinina anhidră de 0,5% (m/m), diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească 0,02%. Pentru un conţinut de chinina anhidră de 0,2% (m/m), diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească 0,01%. ANEXA 28 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU SULFITI ANORGANICI SI SULFITI ACIZI SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Metoda reglementează identificarea şi determinarea a sulfitilor anorganici şi sulfitilor acizi în produsele cosmetice. Este aplicabilă numai produselor care au o faza apoasă sau alcoolică şi pentru concentraţii de pana la 0,2% dioxid de sulf. A. IDENTIFICARE 1. PRINCIPIU Proba se incalzeste în acid clorhidric şi dioxidul de sulf care se eliberează este identificat prin mirosul sau sau prin efectul sau asupra hârtiei indicatoare. 2. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 2.1. Acid clorhidric (4M). 2.2. Hârtie iod-amidonata (iodat de potasiu) ori echivalent. 3. APARATURA 3.1. Echipament uzual de laborator. 3.2. Flacon (25 ml) echipat cu un condensator de reflux scurt. 4. PROCEDEU 4.1. Se pun cca. 2,5 g proba în flacon (3.2) cu 10 ml de acid clorhidric (2.1) 4.2. Se amesteca şi se incalzeste pana la fierbere. 4.3. Se testeaza emisia de dioxid de sulf prin miros sau cu hârtie indicatoare (2.2). B. DETERMINARE 1. DEFINIŢIE Conţinutul de sulfit sau sulfit acid în proba determinat conform acestei metode este exprimat în procente masice de dioxid de sulf. 2. PRINCIPIU După acidifierea probei, dioxidul de sulf eliberat este distilat într-o soluţie de apa oxigenata. Acidul sulfuric format este titrat cu o soluţie de hidroxid de sodiu standardizata. 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 3.1. Apa oxigenata 0,2% (m/v). Se prepara zilnic. 3.2. Acid ortofosforic [d(4)]^(2 5) = 1,75 3.3. Metanol 3.4. Soluţie standardizata de hidroxid de sodiu (0,01M) 3.5. Azot 3.6. Indicator: amestec 1:1 (v/v) de roşu de metil (0,03% m/v în etanol) şi albastru de metilen (0,05% m/v în etanol). Se filtreaza soluţia. 4. APARATURA 4.1. Echipament uzual de laborator 4.2. Aparatura de distilare (vezi figura). 5. PROCEDEU 5.1. In balonul de distilare A (vezi figura) se cantaresc cu precizie cca. 2,5 g proba. 5.2. Se adauga 60 ml apa şi 50 ml metanol (3.3) şi se amesteca. 5.3. Se pun 10 ml apa oxigenata (3.1), 60 ml apa şi câteva picaturi de indicator (3.6) în colectorul de distilare D (vezi figura). Se adauga câteva picaturi de hidroxid de sodiu (3.4) pana la virarea în verde a indicatorului. 5.4. Se repeta 5.3. pentru flaconul de spalare E (vezi figura) 5.5. Se asambleaza aparatura şi se regleaza debitul de azot (3.5) la circa 60 bule per minut. 5.6. Se pun 15 ml acid ortofosforic (3.2) din palnie în balonul de distilare A. 5.7. Se incalzeste rapid pana la fierbere şi apoi se fierbe uşor la foc mic pe o perioada totală de 30 minute; 5.8. Se detaşează colectorul de distilare D. Se clateste tubul şi apoi se titreaza soluţie de hidroxid de sodiu (3.4) pana la virarea în verde a indicatorului (3.6) 6. CALCUL Se calculează conţinutul de sulfit sau sulfit acid, în procente masice, cu formula:
3,2 MV
% m/m dioxid de sulf = ──────
m
unde: M = concentraţie molara a soluţiei de hidroxid de sodiu V = volum de hidroxid de sodiu (3.4) necesar pentru titrare (5.8), în mililitri m = masa probei (5.1), în grame. 7. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de 0,2% m/m dioxid de sulf diferenţa dintre doua determinări efectuate în paralel pe aceiaşi proba nu trebuie sa fie mai mare de 0,006%. Aparatura de distilare a dioxidului de sulf în conformitate cu Tanner Toate dimensiunile sunt în mm. ANEXA 29 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU CLORATI AI METALELOR ALCALINE SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Metoda reglementează identificarea şi determinarea cloratilor metalelor alcaline în pastele de dinţi şi alte produse cosmetice. A. IDENTIFICARE 1. PRINCIPIU Cloratii sunt separati de alţi halogenati prin cromatografie în strat subtire şi identificati prin oxidarea iodurii cu formare de iod. 2. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 2.1. Soluţii de referinţa: soluţii apoase de clorat, bromat şi iodat de potasiu (0,2% m/v) proaspăt preparate. 2.2. Solvent de developare: soluţie amoniacala (28% m/v)/acetona/butanol (60/130/30 v/v/v) 2.3. Iodura de potasiu, soluţie apoasă (5% m/v) 2.4. Soluţie de amidon (1 la 5% m/v) 2.5. Acid clorhidric (1M) 2.6. Plăci pentru cromatografie în strat subtire cu celuloza, gata preparate (0,25 mm) 3. APARATURA Echipament normal pentru cromatografia în strat subtire. 4. PROCEDEU 4.1. Se extrage circa 1 g de proba cu apa, se filtreaza şi dilueaza la cca. 25 ml. 4.2. Se pipeteaza 2 æl de soluţie (4.1) pe placa (2.6) împreună cu 2 æl porţiuni din fiecare din cele trei soluţii de referinţa (2.1). 4.3. Se pune placa într-un tanc şi se developeaza prin cromatografie ascendenta circa trei sferturi din lungimea plăci (2.6) cu solvent 2.2. 4.4. Se scoate din tanc şi se lasa sa se evapore solventul (NB: aceasta poate dura pana la 2 ore) 4.5. Se pulverizeaza placa cu iodura de potasiu (2.3) şi se lasa la uscat pentru cca. 5 minute 4.6. Se pulverizeaza placa cu soluţie de amidon (2.4) şi se lasa la uscat pentru cca. 5 minute 4.7. Se pulverizeaza placa cu acid clorhidric (2.5) 5. EVALUARE Dacă cloratul este prezent, un spot albastru (posibil un spot maro) va aparea după o jumătate de ora cu o valoare Rf de aproximativ 0,7 pana la 0,8.
───────────────────────────────────
Halogenati Rf
───────────────────────────────────
Iodat 0 - 0,2
Bromat 0,5 - 0,6
Clorat 0,7 - 0,8
───────────────────────────────────
Trebuie remarcat faptul ca bromatii şi iodatii dau reactie imediata. Trebuie avut grija a nu se confunda spoturile de la bromati şi clorati. B. DETERMINARE 1. DEFINIŢIE Conţinutul de clorat din proba determinat conform acestei metode este exprimat în procente masice de clorat. 2. PRINCIPIU Cloratul este redus de pulberea de zinc în condiţii acide. Clorura formată este masurata prin titrare potentiometrica folosind o soluţie de nitrat de argint. O determinare similară înainte reducerii permite determinarea posibilei prezente a halogenurilor. 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 3.1. Acid acetic, 80% (m/m) 3.2. Pulbere de zinc 3.3. Soluţie standard de azotat de argint (0,1M) 4. APARATURA 4.1. Echipament uzual de laborator 4.2. Potentiometru echipat cu electrod indicator de argint. 5. PROCEDEU 5.1. Preparare proba Într-o eprubeta pentru centrifuga se cântăreşte cu precizie o cantitate "m" de aproximativ 2 g. Se adauga cca. 15 ml acid acetic (3.1) şi se amesteca cu grija. Se aşteaptă 30 minute şi se centrifugheaza 15 minute la 2000 rot/min. Se transfera soluţia supernatanta într-un balon cotat de 50 ml. Se repeta centrifugarea de doua ori prin adăugarea a 15 ml acid acetic (3.1) la reziduu. Se colectează soluţia conţinând clorat în acelaşi balon cotat. Se aduce la semn cu acid acetic (3.1). 5.2. Reducere clorat Se iau 20 ml soluţie 5.1. şi se adauga 0,6 g pulbere de zinc (3.2). Se aduce la fierbere într-un balon echipat cu un tub condensator. După 30 minute de fierbere, se raceste şi se filtreaza. Se clateste balonul cu apa. Se filtreaza şi se reuneste filtratul cu apele de clatire. 5.3. Determinare clorura Se titreaza 20 ml soluţie 5.2. cu azotat de argint (3.3.) prin folosirea potentiometrului (4.2). Se titreaza în acelaşi mod 20 ml soluţie 5.1. cu azotat de argint (5.3) NB: Dacă produsul conţine derivaţi de brom sau iod care pot elibera bromuri sau ioduri după reducere, curba de titrare va avea mai multe puncte de inflexiune, în acest caz volumul soluţiei titrate (3.3) corespunzand clorurii este diferenţa dintre ultimul şi penultimul punct de inflexiune. 6. CALCUL Conţinutul de clorat al probei (% m/m) este calculat cu formula:
_ 20,9 [V - V'] M
Clorat [ClO(3)] % m/m = ───────────────────
m
unde: V = volumul în mililitrii, de soluţie de azotat de argint (3.3) folosit la titrarea soluţiei 5.2 V' = volum în mililitrii, de soluţie de azotat de argint (3.3) folosit la titrarea a 20 ml de soluţie 5.1 M = molalitatea soluţiei standard de azotat de argint (3.3) m = masa probei, în grame. 7. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de clorat de 3 pana la 5% m/m, diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească 0,07% m/m. ANEXA 30 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU IODAT DE SODIU SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Metoda reglementează procedeul de identificare şi determinare a compoziţiei chimice a produselor cosmetice conţinând iodat de sodiu. A. IDENTIFICARE 1. PRINCIPIU Iodatul de sodiu este separat de alţi halogenati prin cromatografie în strat subtire şi identificat prin oxidarea iodurii cu formare de iod. 2. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 2.1. Soluţii de referinţa: soluţii apoase de clorat, bromat şi iodat de potasiu (0,1% m/v) proaspăt preparate. 2.2. Solvent de developare: soluţie amoniacala 28% (m/v)/acetona/butanol (60/130/30 v/v/v) 2.3. Soluţie apoasă de iodura de potasiu (5% m/v) 2.4. Soluţie de amidon (pana la 5% m/v) 2.5. Acid clorhidric (1M) 3. APARATURA 3.1. Plăci pentru cromatografie în strat subtire cu celuloza (0,25 mm) gata preparate. 3.2. Echipament normal pentru crtomatografie în strat subtire. 4. PROCEDEU 4.1. Se extrage cca. 1 g de proba cu apa, se filtreaza şi se dilueaza la cca. 10 ml. 4.2. Se pipeteaza 2 æl din aceasta soluţiei pe linia de baza a placii (3.1) împreună cu 2 æl porţiuni din fiecare dintre cele trei soluţii de referinţa. 4.3. Se pune placa într-un tanc şi se developeaza prin cromatografie ascendenta circa trei sferturi din lungimea placii (2.6) cu solvent (2.2). 4.4. Se indeparteaza placa din tanc şi se lasa sa se evapore solventul la temperatura ambianta (MB: aceasta poate dura pana la doua ore) 4.5. Se pulverizeaza placa cu iodura de potasiu (2.3) şi se lasa sa se usuce cca. de 5 minute. 4.6. Se pulverizeaza placa cu soluţie de amidon (2.4) şi se lasa sa se usuce cca. de 5 minute 4.7. In final se pulverizeaza cu acid clorhidric (2.5) 5. EVALUARE Dacă iodatul este prezent un spot albastru (culoarea poate fi maro sau poate deveni maro dacă sta) va aparea imediat cu o valoare Rf de aproximativ 0 pana la 0,2. Trebuie remarcat ca bromatii dau reactii imediate la valori Rf de aproximativ 0,5 pana la 0,6 iar cloratii, după cca. 30 minute, la valori Rf de 0,7 respectiv 0,8. B. DETERMINARE 1. DEFINIŢIE Conţinutul de iodat de sodiu determinat conform acestei metode este exprimat ca procent masic de iodat de sodiu. 2. PRINCIPIU Iodatul de sodiu se dizolva în apa şi este determinat prin intermediul cromatografiei de lichid de înalta performanta, folosind o coloana C18 cu faza inversa şi o coloana cu schimbator de anioni inseriate. 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica şi în special adecvati cromatografiei de lichide de înalta performanta (HPLC). 3.1. Acid clorhidric (4M) 3.2. Sulfit de sodiu apos, 5% m/v 3.3. Soluţie stoc iodat de sodiu: se prepara o soluţie stoc conţinând 50 mg iodat de sodiu per 100 ml apa. 3.4. Ortofosfat diacid de potasiu 3.5. Ortofosfat acid de disodiu æ 2H(2)O 3.6. Faza mobila HPLC: se dizolva 3,88 g ortofosfat diacid de potasiu (3.4) şi 1,19 g ortofosfat acid de disodiu æ 2H(2)O (3.5) într-un litru de apa. pH-ul soluţiei rezultate este 6,2. 3.7. Hârtie indicatoare universala, pH 1-11. 4. APARATURA 4.1. Aparatura de laborator obişnuită. 4.2. Hârtie de filtru circulara, diametru 110 mm, Schleicher şi Schull Nr. 575, sau echivalent. 4.3. Cromatograf de lichid de înalta performanta cu detector cu lungime de unda variabila. 4.4. Coloane: lungime 120 mm; diametru interior: 4,6 mm; număr: doua conectate în serie; prima coloana - Necleosil(R) 5 C18 sau echivalent; a doua coloana - Vydac (TM) - 301-SB sau echivalent 5. PROCEDEU 5.1. Preparare proba 5.1.1. Probe fluide (sampoane) Se cântăreşte cu precizie o proba pentru testare de aproximativ 1,0 g proba într-un cilindru gradat cu dop de sticla sau un balon cotat. Se aduce la semn cu apa şi se amesteca. Dacă este necesar, se filtreaza soluţia. Se determina iodatul din soluţie prin intermediul HPLC conform descrierii din secţiune 5.2. 5.1.2. Probe solide (sapunuri) Se ia o cota parte din proba şi se cântăreşte cu precizie o proba pentru testare de cca. 1,0 g într-un cilindru gradat cu dop de sticla. Se umple pana la 50 ml cu apa şi se agita puternic timp de un minut. Se centrifugheaza şi se filtreaza prin hârtie de filtru (4.1) sau se lasa amestecul sa stea pentru cel puţin o noapte. 5.2. Cromatografiere Debit: 1 ml/min. Lungime de unda a detectorului (4.2): 210 nm Volum de injectare: 10 æl Măsurare: suprafaţa picului 5.3. Etalonare In baloane cotate de 50 ml se pipeteaza cu pipeta 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, şi 20,0 ml soluţie stoc de iodat de sodiu (3,3). Se aduce la semn cu apa şi se amesteca. Soluţiile astfel obţinute conţin 0,01, 0,02, 0,05, 0,10, şi respectiv 0,20 mg iodat de sodiu per mililitru. Se injecteaza o porţiune de 10 æl din fiecare soluţie standard de iodat în cromatograful de lichide (4.2) şi se obţine o cromatograma. Se determina suprafaţa picului pentru iodat şi se traseaza o curba prin relationarea suprafatei picului cu concentraţia de iodat de sodiu. 6. CALCUL Se calculează conţinutul de iodat de sodiu, în procente masice (% m/m), folosind formula:
Vc
% (m/m) iodat de sodiu = ────
10 m
unde: m = este masa, în grame, a probei de testare (5.1) V = este volumul total a soluţiei proba, în mililitrii, obţinută conform descrierii de la 5.1 c = este este concentraţia, în miligrame per milimetru iodat de sodiu, obţinută din curba de etalonare (5.3). 7. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de iodat de sodiu de 0,1% (m/m) diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească 0,002%. 8. CONFIRMARE 8.1. Principiu _ Într-o soluţie acidifiata a unui produs cosmetic, iodatul [IO(3)] este redus _la iod (I ) cu sulfit şi soluţia rezultată se investigheaza prin intermediulHPLC. Dacă un pic având un timp de retenţie corespunzător timpului de retenţieal iodatului dispare după tratament cu sulfit, picul original poate fi cel maiprobabil atribuit iodatului. 8.2. Procedeu Într-un balon cotat se pipeteaza o porţiune de 5 ml din soluţia proba obţinută conform descrierii de la punctul 5.1. Se ajustează pH-ul soluţiei la valoarea 3 ori mai mica cu acid clorhidric (3.1); hârtie indicatoare universala (3.7). Se adauga 3 picaturi de soluţie de sulfit de sodiu (3.2) şi se amesteca. Se injecteaza o porţiune de 10 æl de soluţie în cromatograful de lichid (4.2) Se compara aceasta cromatograma cu cromatograma obţinută conform descrierii de la punctul 5 pentru aceeaşi proba. ANEXA 31 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU AZOTATUL DE ARGINT IN PRODUSELE COSMETICE A. IDENTIFICARE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE. Aceasta metoda reglementează identificarea azotatului de argint, ca argint, în produsele cosmetice apoase. 2. PRINCIPIU Argintul este identificat prin precipitatul alb caracteristic format cu ionii de clorura. 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 3.1. Soluţie acid clorhidric, 2M 3.1.1. Soluţie amoniacala: se dilueaza soluţia concentrata de hidroxid de amoniu (d(2 5) = 0,88 g/ml) cu o cantitate egala de apa şi se amesteca. 3.2. Soluţie acid azotic, 2M 4. APARATURA 4.1. Echipament uzual de laborator 4.2. Centrifuga 5. PROCEDEU 5.1. Într-o eprubeta pentru centrifuga se adauga, la aproximativ 1 g de proba, soluţie de acid clorhidric 2M (3.1), cu picatura, pana la precipitarea completa; se amesteca şi se centrifugheaza. 5.2. Se elimina lichidul supernatant şi se spala precipitatul o singura data cu cinci picaturi de apa rece. Se arunca apele de spalare. 5.3. Se adauga în eprubeta pentru centrifuga o cantitate de apa egala cu cantitatea de precipitat. Se incalzeste pana la fierbere şi se agita. 5.4. Se centrifugheaza fierbinte; se elimina lichidul supernatant. 5.5. Precipitatului i se adauga câteva picaturi de soluţie amoniacala (3.2); se amesteca şi centrifugheaza. 5.6. Pe o lamela de sticla la o picatura de lichid supernatant se adauga câteva picaturi de soluţie acid azotic 2M (3.3). 5.7. Un precipitat alb indica prezenta argintului. B. DETERMINARE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta este metoda reglementată pentru determinarea azotatului de argint ca argint în produsele cosmetice folosite pentru vopsirea genelor şi sprancenelor. 2. PRINCIPIU Argintul este determinat în produs prin spectrometrie de absorbţie atomică. 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa aibă puritate analitica. 3.1. Soluţie acid azotic, 0,02 M. 3.2. Soluţii standard de argint 3.2.1. Soluţie standard de argint stoc, 1000 æg/ml în soluţie acid azotic 0,5 M ("Spectrosol" sau echivalent) 3.2.2. Soluţie standard de argint, 100 æg/ml; se pipeteaza cu 10 ml soluţie standard de argint stoc (3.2.1) într-un balon cotat de 100 ml. Se aduce la semn cu soluţie acid azotic 0,02M (3.1) şi se omogenizeaza. Aceasta soluţie standard trebuie proaspăt preparata şi depozitată într-un flacon de sticla de culoare închisă. 4. APARATURA 4.1. Echipament uzual de laborator. 4.2. Spectrofotometru de absorbţie atomică echipat cu lampa cu catod tubular de argint. 5. PROCEDEU 5.1. Preparare proba Se cântăreşte cu precizie 0,1 g ("m" grame) de proba omogenă de produs. Se transfera cantitativ într-un balon cotat de 1 litru şi se aduce la semn cu soluţie acid azotic 0,02M (3.1) şi se omogenizeaza. 5.2. Condiţii pentru spectrometria de absorbţie atomică Flacara: aer - acetilena. Lungime de unda: 338,3 nm. Corecţie fond: da Stare combustibil: sarac; pentru absorbanta maxima, va fi necesară optimizarea inaltimii arzatorului şi a starilor combustibilului. 5.3. Etalonare 5.3.1. Într-o serie de baloane cotate de 100 ml se pipeteaza 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 şi 5,0 ml de soluţie standard de argint (3.2.2). Se aduce la semn cu soluţie acid azotic 0,02M (3.1) şi se omogenizeaza. Aceste soluţii conţin 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 şi respectiv 5,0 æg argint per mililitru. 5.3.2. Se măsoară absorbanta soluţiei de acid azotic 0,02M şi se foloseşte valoarea obţinută drept concentraţie de argint zero pentru curba de etalonare. Se măsoară absorbanta fiecărui standard de etalonare argint (5.3.1). Se traseaza o curba de etalonare prin punerea în relatie a valorilor absorbantei cu concentraţia de argint. 5.4. Determinare Se măsoară absorbanta soluţiei proba (5.1). De pe curba de etalonare se citeşte concentraţia de argint corespunzătoare valorii absorbantei obţinute pentru soluţia proba (calibrare). 6. CALCUL Se calculează conţinutul de azotat de argint al probei, în procente masice (% m/m), folosind următoarea formula:
1,5748 x c
% (m/m) azotat de argint = ──────────
10 x m
m = masa în grame a probei în analiza (5.1) c = concentraţia de argint în soluţia proba (5.1), în micrograme per mililitru, obţinută de pe curba de etalonare. 7. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de azotat de argint de 4% (m/m) diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel din aceiaşi proba nu trebuie sa depăşească 0,05% (m/m). ANEXA 32 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU BISULFURA DE SELENIU DIN PRODUSELE PENTRU ÎNGRIJIREA PARULUI A. IDENTIFICARE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta este metoda reglementată pentru identificarea bisulfurii de seleniu ca seleniu în sampoanele antimatreata. 2. PRINCIPIU Seleniul este identificat prin culoarea caracteristica galben spre oranj produsă la reactia cu uree şi iodura de potasiu. 3. REACTIVI Toţi reactantii trebuie sa aibă puritate analitica. 3.1. Acid azotic, concentrat (d(2 5) = 1,42 g/ml). 3.2. Uree 3.3. Soluţie iodura de potasiu, 10% (m/v): se dizolva 10 g iodura de potasiu în 100 ml apa. 4. APARATURA 4.1. Echipament uzual de laborator. 4.2. Tub de mineralizare, capacitate 100 ml. 4.3. Autoclava cu bloc-încălzit. 4.4. Hârtie de filtru (Whatman No 42 sau echivalent) sau filtru cu membrana 0,45 pm. 5. PROCEDEU 5.1. Într-un tub de mineralizare (4.2), peste cca. 1 g de sampon se adauga 2,5 ml de acid azotic concentrat (3.1) şi se lasa la 150°C timp de 30 minute într-o autoclava cu bloc-încălzit (4.3). 5.2. Se dilueaza proba astfel pregatita, cu apa pana la 25 ml, şi se filtreaza prin hârtie de filtru sau filtru cu membrana 0,45 æm (4.4). 5.3. La 2,5 ml de filtrat se adauga 5 ml apa, 2,5 g uree (3.2) şi se fierbe. Se raceste şi adauga 1 ml de soluţie iodura de potasiu (3.3). 5.4. O culoare galben spre oranj care se închide rapid în timp indica prezenta seleniului. B. DETERMINARE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta este metoda reglementată pentru determinarea disulfurii de seleniu ca seleniu în sampoanele antimatreata conţinând pana la 4,5% (m/m) disulfura de seleniu. 2. PRINCIPIU Proba este tratata cu acid azotic şi seleniul din extrasul rezultat se determina cu ajutorul spectrometriei de absorbţie atomică. 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa aibă puritate analitica 3.1. Acid azotic, concentrat (d(2 5) = 1,42 g/ml). 3.2. Soluţie acid azotic, 5% (v/v): într-un pahar se adauga 50 ml acid azotic concentrat (3.1) la 500 ml apa, amestecand continuu. Se transfera aceasta soluţie într-un balon cotat de 1 litru şi se aduce la semn cu apa. 3.3. Soluţie standard de seleniu stoc, 1.000 æg/ml în soluţie de acid azotic 0,5 M ("Spectrosol" sau echivalent). 4. APARATURA 4.1. Echipament uzual de laborator 4.2. Tub de mineralizare (dezagregare), capacitate 100 ml. 4.3. Autoclava cu bloc-încălzit. 4.4. Hârtie de filtru (Whatman No. 42 sau echivalent) sau filtru cu membrana 0,45 æm. 4.5. Spectofotometru de absorbţie atomică echipat cu lampa cu catod tubular de seleniu. 5. PROCEDEU 5.1. Preparare proba 5.1.1. Se cântăreşte cu precizie cca. 0,2 g ("m" grame) de proba omogenă de sampon într-un tub de mineralizare (4.2). 5.1.2. Se adauga 5 ml de acid azotic concentrat (3.1) şi se lasa la 150°C timp de o ora într-o autoclava cu bloc-încălzit (4.3). 5.1.3. Se lasa soluţia sa se raceasca şi se dilueaza pana la 100 ml cu apa. Se filtreaza prin hârtie de filtru sau prin filtru cu membrana 0,45 æm (4.4) şi se retine soluţia filtrata pentru determinare. 5.2. Condiţii pentru spectrometria de absorbţie atomică Flacara: aer - acetilena. Lungime de unda: 196,0 nm. Corecţie fond: da Stare combustibil: sarac; pentru absorbanta maxima, va fi necesară optimizarea inaltimii arzatorului şi a starilor combustibilului. 5.3. Etalonare 5.3.1. Într-o serie de baloane cotate de 100 ml se pipeteaza 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 şi 5,0 ml de soluţie standard de seleniu stoc (3.3). Se aduce la semn cu soluţie acid azotic 5% (v/v) (3.3) şi se amesteca. Aceste soluţii conţin 10, 20, 30, 40 şi respectiv 50 æg seleniu per mililitru. 5.3.2. Se măsoară absorbanta unei soluţii de acid azotic 5% (v/v) (3.2) şi se foloseşte valoarea obţinută drept concentraţie de seleniu zero, pentru curba de etalonare. Se măsoară absorbanta pentru fiecare standard de etalonare seleniu (5.3.1). Se traseaza curba de etalonare prin punerea în relatie a valorilor absorbantei cu concentraţia seleniului. 5.4. Determinare Se măsoară absorbanta soluţiei proba (5.1.3). De pe curba de etalonare se citeşte concentraţia de seleniu corespunzătoare valorii absorbantei obţinute pentru soluţia proba. 6. CALCUL Se calculează conţinutul de disulfura de seleniu din proba, în procente masice (% m/m), folosind formula:
1,812 x c
% (m/m) bisulfura de seleniu = ─────────
100 x m
m = masa în grame a probei în analiza (5.1.1) c = concentraţia seleniului în soluţia proba (5.1.3), în micrograme per mililitru, obţinută de pe curba de etalonare. 7. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de disulfura de seleniu de 1 % (m/m) diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească 0,05% (m/m). ANEXA 33 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU BARIUL SOLUBIL SI PENTRU STRONTIUL SOLUBIL DIN BAZELE NUANTATOARE (DIN PIGMENTI SUB FORMA DE SARURI SAU LACURI) A. DETERMINAREA BARIULUI SOLUBIL 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta metoda reglementează procedeul pentru extragerea şi determinarea bariului solubil din pigmenti în forma de saruri sau lacuri. 2. PRINCIPIU Pigmentul este extras cu soluţie de acid clorhidric 0,07M în condiţii definite şi cantitatea de bariu din extractant se determina prin spectrometrie de absorbţie atomică. 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 3.1. Etanol, absolut 3.2. Soluţie acid clorhidric, 0,07M. 3.3. Soluţie acid clorhidric, 0,5M. 3.4. Soluţie clorura de potasiu, 8% (m/m): se dizolva 16 g clorura de potasiu în 200 ml soluţie acid clorhidric 0,07M (3.2). 3.5. Soluţii standard de bariu 3.5.1. Soluţie standard de bariu stoc, 1000 æg/ml în soluţie acid azotic 0,5M ("Spectrosol" sau echivalent) 3.5.2. Soluţie standard de bariu, 200 æg/ml: se pipeteaza 20 ml soluţie standard de bariu stoc (3.5.1) într-un balon cotat de 100 ml. Se aduce la semn cu soluţie acid clorhidric 0,07M (3.2) şi se amesteca. 4. APARATURA 4.1. Echipament uzual de laborator 4.2. pH-metru cu precizie de § 0,02 unităţi 4.3. Vibrator de flacon acţionat din incheietura mainii. 4.4. Filtru cu membrana cu dimensiunea porilor de 0,45 æm. 4.5. Spectrofotometru de absorbţie atomică cu lampa cu catod tubular de bariu. 5. PROCEDEU 5.1. Preparare proba 5.1.1. Într-un flacon conic se cântăreşte cu precizie cca. 0,5 g pigment ("m" grame). Nu se va folosi un flacon cu o capacitate mai mica de 150 ml pentru a se asigura un volum suficient pentru agitarea eficienta a acestuia. 5.1.2. Se adauga cu pipeta 1,0 ml etanol (3.1) şi se roteste flaconul pentru a asigura umezirea completa a pigmentului. Se adauga dintr-o biureta cantitatea exactă de soluţie acid clorhidric 0,07M (3.2) necesară pentru a rezulta un raport volum de acid la cantitate de pigment de exact 50 mililitrii per gram. Fie V ml volumul total de extractant inclusiv etanolul. Se agita vasul timp de cinci secunde pentru a asigura o omogenizare completa a conţinutului. 5.1.3. Folosind un pH-metru (4.2) se măsoară pH-ul suspensiei rezultate si, dacă este peste 1,5, se adauga cu picatura soluţie acid clorhidric 0,5M (3.3) pana la o valoarea cuprinsă între 1,4 - 1,5. 5.1.4. Se astupa flaconul şi se agita imediat timp de 60 minute folosind vibratorul (4.3). Vibratorul trebuie sa fie operat la o viteza suficient de mare pentru a produce o spuma. Se filtreaza prin filtru cu membrana de 0,45 æm (4.4) şi se colectează filtratul. Nu se centrifugheaza extractul înainte de filtrare. Se pipeteaza 5,0 ml de filtrat într-un balon cotat de 50 ml; se aduce la semn cu soluţie de acid clorhidric 0,07M (3.2) şi se omogenizeaza. Aceasta soluţie se foloseşte de asemenea pentru determinarea strontiului (capitolul B). 5.1.5. Într-un balon cotat de 100 ml se pipeteaza 5 ml soluţie clorura de potasiu (3.4) şi o porţiune (W(Ba) ml) de filtrat diluat (5.1.4) pentru a rezulta o concentraţie necesară între 3 şi 10 æg bariu per mililitru (o porţiune de 10 ml ar fi un punct de început satisfăcător). Se aduce la semn cu soluţie acid clorhidric 0,07M (3.2) şi se omogenizeaza. 5.1.6. Se determina concentraţia în bariu a soluţiei (5.1.5) prin spectrometrie de absorbţie atomică, în aceeaşi zi. 5.2. Condiţii pentru spectrometria de absorbţie atomică Flacara: oxid azotos/acetilena. Lungime de unda: 553,5 nm. Corecţie de fond: nu. Stare combustibil: sarac; pentru absorbanta maxima va fi necesară optimizarea inaltimii arzatorului şi a starilor combustibilului. 5.3. Etalonare 5.3.1. Într-o serie de baloane cotate de 100 ml se pipeteaza 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 şi 5,0 ml soluţie standard de bariu (3.5.2). In fiecare balon se pipeteaza 5 ml soluţie clorura de potasiu (3.4); se aduce la semn cu soluţie acid clorhidric 0,07M (3.2) şi se omogenizeaza. Aceste soluţii conţin 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 şi respectiv 10,0 æg bariu per mililitru. Similar se prepara o soluţie oarba omitand soluţia standard de bariu. 5.3.2. Se măsoară absorbanta soluţiei oarbe (5.3.1) şi se foloseşte valoarea obţinută drept concentraţie de bariu zero pentru curba de etalonare. Se măsoară absorbanta fiecărui standard de etalonare bariu (5.3.1). Se traseaza curba de etalonare prin punerea în relatie a valorilor absorbantei cu concentraţia de bariu. 5.4. Determinare Se măsoară absorbanta soluţiei proba (5.1.5). De pe curba de etalonare se citeşte concentraţia bariului corespunzand valorii absorbantei obţinute pentru soluţia proba. 6. CALCUL Conţinutul de bariu solubil (% m/m) al pigmentului este dat de formula:
C x V
% (m/m) bariu solubil = ───────────
10W(Ba) x m
m = masa în grame a probei luate în analiza (5.1.1) c = concentraţia de bariu în soluţia proba (5.1.5), în micrograme per mililitru, obţinută de pe curba de etalonare. V = volumul total de extractant în mililitrii (5.1.2) W(Ba) = volumul de extract, în mililitrii, considerat la 5.1.5. 7. REPETABILITATE Pentru un conţinut de bariu solubil de 2% (m/m), cea mai bine estimată repetabilitate (ISO 5725) pentru aceasta metoda este de 0,3%. 8. OBSERVAŢII 8.1.1. In anumite condiţii absorbanta bariului poate fi crescută de prezenta calciului. Aceasta poate fi contracarata prin adăugarea ionului de magneziu la o concentraţie de 5g per litru ("Magnesium as modifier for determination of barium by flame atomic emission spectrometry" Jerrow, M. et al, Analytical Proceedings, 1991, 28, 40). 8.1.2. Folosirea spectrometriei de emisie optica cu plasma cuplata inductiv este permisă ca o alternativa la spectrometria de absorbţie atomică în flacara. B. DETERMINAREA STRONTIULUI SOLUBIL 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta metoda reglementează procedeul pentru extragerea şi determinarea strontiului solubil din pigmenti în forma de saruri sau lacuri. 2. PRINCIPIU. Pigmentul este extras cu soluţie acid clorhidric 0,07M în condiţii definite şi cantitatea de strontiu în extractant este determinata prin spectrometrie de absorbţie atomică. 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa aibă puritate analitica. 3.1. Etanol, absolut 3.2. Soluţie acid clorhidric 0,07M 3.3. Soluţie clorura de potasiu 8% (m/v): se dizolva 16 g clorura de potasiu în 200 ml soluţie acid clorhidric 0,07M (3.2) 3.4. Soluţii standard de strontiu 3.4.1. Soluţie standard de strontiu stoc, 1000 æg/ml în soluţie acid azotic 0,5M ("Spectrosol" sau echivalent). 3.4.2. Soluţie standard de strontiu, 100 æg/ml: se pipeteaza 10,0 ml soluţie standard de strontiu stoc (3.4.1) într-un balon cotat de 100 ml. Se aduce la semn cu soluţie acid clorhidric 0,07M (3.2) şi se amesteca. 4. APARATURA 4.1. Echipament uzual de laborator 4.2. Filtru cu membrana cu dimensiunea porilor de 0,45 æm 4.3. Spectrofotometru de absorbţie atomică echipat cu lampa cu catod tubular de strontiu. 5. PROCEDEU 5.1. Preparare proba Soluţia preparata la A.5.1.4. se foloseşte pentru a determina conţinutul de strontiu solubil. 5.1.1. Într-un balon cotat de 100 ml. se pipeteaza 5 ml soluţie clorura de potasiu (3.3) şi o porţiune de filtrat diluat (W(sr) ml) (A.5.1.4.) pentru a rezulta o concentraţie între 2 şi 5 æg de strontiu per mililitru (o porţiune de 25 ml ar fi un punct se început satisfăcător). Se aduce la semn cu soluţie acid clorhidric 0,07M (3.2) şi se omogenizeaza. 5.1.2. Se determina concentraţia de strontiu a soluţiei (5.1.1) prin spectrometrie de absorbţie atomică, în aceeaşi zi. 5.2. Condiţii pentru spectrometria de absorbţie atomică Flacara: oxid azotos/acetilena. Lungime de unda: 460,7 nm. Corecţie de fond: nu Stare combustibil: sarac; pentru o absorbanta maxima va fi necesară optimizarea inaltimii arzatorului şi a starilor combustibilului. 5.3. Etalonare 5.3.1. Într-o serie de baloane cotate de 100 ml se pipeteaza 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 şi 5,0 ml soluţie standard de strontiu (3.4.2). In fiecare balon se pipeteaza 5 ml soluţie clorura de potasiu (3.3); se aduce la semn cu soluţie acid clorhidric 0,07M (3.2) şi se omogenizeaza. Aceste soluţii conţin 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 şi respectiv 5,0 æg strontiu per mililitru. Similar se prepara o soluţie blanck "oarba" omitand soluţia standard de strontiu. 5.3.2. Se măsoară absorbanta soluţiei blanck "oarbe" (5.3.1) şi se foloseşte valoarea obţinută drept concentraţie de strontiu zero pentru curba de etalonare. Se măsoară absorbanta fiecărui standard de etalonare strontiu (5.3.1). Se traseaza curba de etalonare punând în relatie valorile absorbantei cu concentraţia de strontiu. 5.4. Determinare Se măsoară absorbanta soluţiei proba (5.1.1). De pe curba de etalonare se citeşte concentraţia de strontiu corespunzătoare valorii absorbantei obţinute pentru soluţia proba. 6. CALCUL Conţinutul de strontiu solubil % (m/m) al pigmentului, este dat de formula:
c x V
% strontiu solubil = ────────────
10 W(Sr) x m
m = masa în grame a probei pentru testare (A.5.1.1) c = concentraţia de strontiu în soluţia proba (5.1.1), în micrograme per mililitru, obţinută din curba de etalonare V = volumul de extractant în mililitrii (A.5.1.2). W(Sr) = volum de extract, în mililitrii, considerat la 5.1.1. 7. REPETABILITATE Pentru un conţinut de strontiu solubil de 0,6% (m/m), cea mai bine estimată repetabilitate (ISO 5725) pentru aceasta metoda este de 0,09%. 8. OBSERVATIE Folosirea spectrometriei de emisie optica cu plasma cuplata inductiv este permisă ca o alternativa la spectrometria de absorbţie atomică în flacara. ANEXA 34 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU ALCOOLUL BENZILIC IN PRODUSELE COSMETICE A. IDENTIFICARE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta metoda reglementează identificarea alcoolului benzilic în produsele cosmetice. 2. PRINCIPIU Alcoolul benzilic este identificat prin intermediul cromatografiei în strat subtire pe plăci cu silicagel. 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 3.1. Alcool benzilic 3.2. Cloroform 3.3. Etanol absolut 3.4. n-Pentan 3.5. Solvent de developare: dietileter 3.6. Soluţie standard de alcool benzilic: se cantaresc 0,1 g alcool benzilic (3.1) într-un balon cotat de 100 ml, se aduce la semn cu etanol (3.3) şi se omogenizeaza. 3.7. Plăci pentru cromatografie în strat subtire, din sticla, 100 x 200 mm sau 200 x 100 mm, acoperite cu un strat de silicagel 60 F(2 5 4) de 0,25 mm 3.8. Agent de vizualizare: acid 12-molibdofosforic, 10% (m/v) în etanol (3.3). 4. APARATURA 4.1. Echipament uzual de laborator 4.2. Tanc de cromatografiere, camera cu dublu compartiment, dimensiuni de gabarit de cca. 80 mm x 230 x 240 mm. 4.3. Hârtie pentru cromatografiere: Whatman sau echivalent. 4.4. Lampa de ultraviolet, lungime de unda 254 nm. 5. PROCEDEU 5.1. Preparare proba Se cântăreşte 1 g de produs de analizat într-un balon cotat de 100 ml. Se adauga 3 ml cloroform (3.2) şi se agita puternic pana produsul s-a dispersat. Se aduce la semn cu etanol (3.3) şi se agita puternic pentru a produce o soluţie clara sau aproape clara. 5.2. Cromatografie în strat subtire 5.2.1. Se satureaza tancul de cromatografiere (4.2) cu n-pentan (3.4) astfel: se captuseste cu hârtie pentru cromatografie (4.3) peretele camerei adiacent compartimentului din spate, asigurându-se ca marginea inferioară a hârtiei sa fie în compartiment. Se transfera 25 ml n-pentan (3.4) în compartimentul din spate prin turnarea acestui solvent peste suprafaţa expusă a hârtiei pentru cromatografie care captuseste tancul. Se repune imediat capacul şi se lasa vasul sa stea timp de 15 minute. 5.2.2. Se pun 10 æl de soluţie proba (5.1) şi 10 æl soluţie standard de alcool benzilic (3.6) în puncte adecvate pe linia de start a placii pentru cromatografie în strat subtire (3.7). Se lasa sa se usuce. 5.2.3. Se pipeteaza 10 ml dietileter (3.5) în compartimentul din fata al tancului şi imediat după aceea se pune placa (5.2.2) în acelaşi compartiment. Se repune repede capacul tancului, şi se developeaza placa pe o distanta de 150 mm. Se scoate placa din tancul de cromatografiere şi se lasa sa se usuce la temperatura camerei. 5.2.4. Se observa placa (5.2.3) în lumina ultravioleta şi se marchează poziţia spoturilor violete. Se pulverizeaza placa cu agent de vizualizare (3.8) şi apoi se incalzeste placa la 120°C timp de 15 minute. Alcoolul benzilic apare ca un spot albastru închis. 5.2.5. Se calculează valoarea Rf obţinută pentru soluţia standard de alcool benzilic. Un spot albastru cu aceiaşi valoare Rf obţinut din soluţia proba indica prezenta alcoolului benzilic. Limita de detecţie: 0,1 æg alcool benzilic. B. DETERMINARE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE. Aceasta metoda reglementează determinarea cantitativă a alcoolului benzilic în produsele cosmetice. 2. DEFINIŢIE Cantitatea de alcool benzilic determinata prin aceasta metoda este exprimat în procente masice (% m/m). 3. PRINCIPIU Proba este extrasa cu metanol şi cantitatea de alcool benzilic din extract este determinata prin cromatografie de lichid de înalta performanta (HPLC). 4. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica şi sa fie adecvati pentru HPLC. 4.1. Metanol 4.2. 4-Etoxifenol 4.3. Alcool benzilic 4.4. Faza mobila: metanol (4.1)/apa (45: 55; v/v). 4.5. Soluţie stoc alcool benzilic: se cântăreşte cu precizie cca. 0,1 g alcool benzilic (4.3) într-un balon cotat de 100 ml. Se aduce la semn cu metanol (4.1) şi se omogenizeaza. 4.6. Soluţie stoc standard intern: se cantaresc cu precizie circa 0,1 g de 4-etoxifenol (4.2) într-un balon cotat de 100 ml. Se aduce la semn cu metanol (4.1) şi se omogenizeaza. 4.7. Soluţii standard: într-o serie de baloane cotate de 25 ml se pipeteaza cantităţi de soluţie stoc alcool benzilic (4.5) şi soluţie stoc standard intern (4.6) conform tabelului de mai jos. Se aduce la semn cu metanol (4.1) şi se omogenizeaza.
┌────────┬────────────────────────────┬──────────────────────────┐
│Soluţie │Concentraţie alcool benzilic│Concentraţie 4-etoxifenol │
│standard├─────────────────┬──────────┼─────────────────┬────────┤
│ │ml (4.5) adăugaţi│ æg/ml(*) │ml (4.6) adăugaţi│æg/ml(*)│
├────────┼─────────────────┼──────────┼─────────────────┼────────┤
│ I │ 0,5 │ 20 │ 2,0 │ 80 │
│ II │ 1,0 │ 40 │ 2,0 │ 80 │
│ II │ 2,0 │ 80 │ 2,0 │ 80 │
│ IV │ 3,0 │ 120 │ 2,0 │ 80 │
│ V │ 5,0 │ 200 │ 2,0 │ 80 │
├────────┴─────────────────┴──────────┴─────────────────┴────────┤
│ (*) Aceste valori sunt date ca indicaţie şi corespund │
│concentraţiilor de soluţii standard preparate folosind soluţii │
│de alcool benzilic (4.5) şi de 4-etoxifenol (4.6) care conţin │
│exact 0,1% alcool benzilic (m/v) şi respectiv exact 0,1% │
│4-etoxifenol (m/v) │
└────────────────────────────────────────────────────────────────┘
5. APARATURA 5.1. Echipament uzual de laborator 5.2. Echipament pentru cromatografie de înalta performanta cu detector UV cu lungime de unda variabila şi bucla de injecţie 10 æl. 5.3. Coloana analitica: coloana de oţel inoxidabil 250 mm x 4,6 mm umpluta cu Spherisorb ODS 5 æm, sau echivalent. 5.4. Baie de apa 5.5. Baie ultrasonica 5.6. Centrifuga 5.7. Eprubete pentru centrifuga, capacitate 15 ml 6. PROCEDEU 6.1. Preparare proba 6.1.1. Se cântăreşte cu precizie cca. 0,1 g ("m" grame) de proba într-o eprubeta pentru centrifuga (5.7) şi se adauga 5 ml de metanol 84.1). 6.1.2. Se incalzeste timp de 10 minute într-o baie de apa (5.4) menţinută la 50°C, apoi se pune eprubeta într-o baie ultrasonica pana când proba este complet dispersata. 6.1.3. Se raceste, apoi se centrifugheaza la 3500 rot/min, timp de cinci minute. 6.1.4. Se transfera lichidul supernatant într-un balon cotat de 25 ml. 6.1.5. Se re-extrage proba cu încă 5 ml metanol (4.1). Se combina extractele într-un balon cotat de 25 ml. 6.1.6. Se pipeteaza 2,0 ml soluţie stoc standard intern (4.6) într-un balon cotat de 25 ml. Se aduce la semn cu metanol (4.1) şi se amesteca. Aceasta soluţie este folosită la etapa de determinare a analizei descrise la 6.4. 6.2. Cromatografiere 6.2.1. Se monteaza echipamentul pentru cromatografie de lichid de înalta performanta (5.2) în modul uzual. Se regleaza debitul fazei mobile (4.4) la 2,0 ml per minut. 6.2.2. Se seteaza lungimea de unda a detectorului UV la 210 nm. 6.3. Etalonare 6.3.1. Se injecteaza 10 æl din fiecare soluţie standard alcool benzilic (4.7) şi se măsoară suprafeţele vârfurilor pentru alcool benzilic şi respectiv 4-etoxifenol. 6.3.2. Pentru fiecare soluţie standard alcool benzilic (4.7) se calculează raportul suprafatelor vârfurilor alcoolului benzilic fata de 4-etoxifenol. Se traseaza curba de etalonare folosind aceste rapoarte pe ordonată şi concentraţiile corespondente de alcool benzilic în æg per mililitru pe abscisa. 6.4. Determinare 6.4.1. Se injecteaza 10 æl soluţie proba (6.1.6) şi se măsoară suprafeţele vârfurilor alcoolului benzilic şi respectiv 4-etoxifenolului. Se calculează raportul suprafatelor vârfurilor alcoolului benzilic fata de 4-etoxifenol. Se repeta acest proces cu porţiuni ulterioare de 10 æl soluţie proba pana se obţin valori suficiente. 6.4.2. De pe curba de etalonare (6.3.2) se citeşte concentraţia de alcool benzilic corespunzătoare raportului suprafatelor vârfurilor alcoolului benzilic fata de 4-etoxifenol. 7. CALCUL Se calculează conţinutul de alcool benzilic în proba, ca procent masic, folosind formula:
c
% (m/m) alcool benzilic = ───────
400 x m
m = masa în grame a probei luată în analiza (6.1.1) c = concentraţia de alcool benzilic în soluţia proba (6.1.6), în micrograme per mililitru, obţinută de pe curba de etalonare. 8. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de alcool benzilic de 1% (m/m), diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba, nu trebuie sa depăşească 0,1%. ANEXA 35 METODA DE IDENTIFICARE PENTRU ZIRCONIU SI METODA DE DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU ZIRCONIU, ALUMINIU SI CLOR DIN ANTIPERSPIRANTE NON-AEROSOLICE Metoda cuprinde cinci capitole: A. Identificarea zirconiului B. Determinarea zirconiului C. Determinarea aluminiului D. Determinarea clorului E. Calcularea raportului între atomii de aluminiu şi atomii de zirconiu, şi a raportului între atomii de aluminiu plus zirconiu şi atomii de clor. A. IDENTIFICAREA ZIRCONIULUI 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICAŢIE Metoda reglementează identificarea zirconiului în produsele cosmetice tip antiperspirant non-aerosol. Nu exista metode stabilite pentru identificarea complexului hidroxiclorura de aluminiu şi zirconiu [Al(x)Zr(OH)(y) Cl(z)●nH(2)O] 2. PRINCIPIU Zirconiul este identificat prin precipitatul caracteristic roşu-violet pe care îl formează cu alizarin roşu S în condiţii puternic acide. 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 3.1. Acid clorhidric, concentrat (d(2 5) = 1,18 g/ml) 3.2. alizarin roşu S soluţie (CI. 58005): soluţie apoasă 2% (m/v) de alizarin sulfonat de sodiu 4. APARATURA 4.1. Echipament uzual de laborator 5. PROCEDEU 5.1. Într-o eprubeta se adauga 2 ml apa la cca. 1 g de proba. Se astupa şi se agita. 5.2. Se adauga trei picaturi de soluţie alizarin roşu S (3.2) urmată de 2 ml acid clorhidric concentrat (3.1). Se astupa şi se agita. 5.3. Se lasa sa stea cca. 2 minute. 5.4. O soluţie supranatanta colorata roşu-violet şi precipitat indica prezenta zirconiului. B. DETERMINAREA ZIRCONIULUI 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta metoda reglementează determinarea zirconiului în complecsii hidroxiclorurii de aluminiu şi zirconiu pana la o concentraţie de 7,5% (m/m) zirconiu în antiperspirantii non-aerosolici. 2. PRINCIPIU Zirconiul este extras din produs în condiţii acide şi determinat prin spectrometrie de absorbţie atomică în flacara. 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 3.1. Acid clorhidric, concentrat (d(2 5) = 1,18 g/ml) 3.2. Soluţie acid clorhidric, 10% (v/v): într-un pahar se adauga 100 ml acid clorhidric concentrat (3.1) la 500 ml de apa, amesteacand continuu. Se aduce aceasta soluţie într-un balon cotat de un litru şi se adauga apa pana la semn. 3.3. Soluţie standard de zirconiu stoc, 1000 æg/ml în soluţie acid clorhidric 0,5 M ("Spectrosol" sau echivalent). 3.4. Reactiv clorura de aluminiu (hidratata) [AlCl(2) ● 6H(2)O]: se dizolva 22,6 g clorura de aluminiu hexahidratata în 250 ml soluţie acid clorhidric 10% (v/v) (3.2). 3.5. Reactiv clorura de amoniu: se dizolva 5,0 g clorura de amoniu în 250 ml soluţie acid clorhidric 10% (v/v) (3.2). 4. APARATURA 4.1. Echipament uzual de laborator 4.2. Agitator magnetic prevăzut cu încălzire sau plita electrica prevăzută cu agitator magnetic 4.3. Hârtie de filtru (Whatman nr. 41 sau echivalent) 4.4. Spectrofotometru de absorbţie atomică echipat cu lampa cu catod tubular de zirconiu. 5. PROCEDEU 5.1. Preparare proba 5.1.1. Se cântăreşte cu precizie cca. 1,0 g ("m" grame) de proba omogenă de produs într-un pahar de 150 ml. Se adauga 40 ml apa şi 10 ml acid clorhidric concentrat (3.1). 5.1.2. Se pune paharul pe agitatorul magnetic prevăzut cu încălzire (4.2). Se porneşte agitarea şi se incalzeste pana la fierbere. Pentru a preveni evaporarea rapida se pune peste pahar o sticla de ceas. Se fierbe cinci minute, se ia paharul de pe plita de încălzire şi se raceste la temperatura camerei. 5.1.3. Se filtreaza conţinutul paharului folosind hârtie de filtru (4.3), într-un balon cotat de 100 ml. Se clateste paharul cu doua portii a câte 10 ml apa şi se adauga apele de clatire după filtrare în balon. Se adauga apa pana la semn şi se omogenizeaza. Aceasta soluţie se foloseşte de asemenea pentru determinarea aluminiului (Partea C). 5.1.4. Într-un balon cotat de 50 ml se pipeteaza 20,00 ml din soluţia proba (5.3.1), 5,00 ml de reactiv clorura de aluminiu (3.4), şi 5,00 ml de reactiv clorura de amoniu (3.5). Se aduce la semn prin adăugarea unei soluţii de acid clorhidric 10% (v/v) (3.2) şi se omogenizeaza. 5.2. Condiţii pentru spectrometria de absorbţie atomică Flacara: oxid azotos/acetilena Lungime de unda: 360,1 nm Corecţie fond: nu Stare combustibil: bogat; pentru o absorbanta maxima, este necesară optimizarea inaltimii arzatorului şi starilor combustibilului 5.3. Etalonare 5.3.1. Într-o serie de baloane cotate de 50 ml se transfera cu pipeta 5,00, 10,00, 15,00, 20,00, 25,00 ml de soluţie standard de zirconiu stoc (3.3). In fiecare balon se pipeteaza 5,00 ml reactiv clorura de aluminiu (3.4) şi 5,00 ml reactiv clorura de amoniu (3.5). Se aduce la semn cu soluţie de acid clorhidric 10% (v/v) (3.2) şi se amesteca. Aceste soluţii conţin 100, 200, 300, 400 şi respectiv 500 æg de zirconiu per mililitru. In mod similar, se prepara o soluţie oarba omitand soluţia standard de zirconiu. 5.3.2. Se măsoară absorbanta soluţiei oarbe (5.3.1) şi se foloseşte valoarea obţinută drept concentraţie de zirconiu zero pentru curba de etalonare. Se măsoară absorbanta fiecărui standard de etalonare de zirconiu (5.3.1). Se traseaza curba de etalonare prin punerea în relatie a valorilor absorbantei cu concentraţia de zirconiu. 5.4. Determinare Se măsoară absorbanta soluţiei proba (5.1.4). De pe curba de etalonare se citeşte concentraţia de zirconiu corespunzătoare valorii absorbantei obţinute pentru soluţia proba. 6. CALCUL Folosind formula următoare, se calculează conţinutul de zirconiu din proba, în procente masice:
c
% (m/m) zirconiu = ──────
40 x m
în care: m = masa în grame a probei pentru testare (5.1.1) c = concentraţia de zirconiu în soluţia proba (5.1.4), în micrograme per mililitru, obţinută din curba de etalonare. 7. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de zirconiu de 3,00% (m/m), diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească 0,10% (m/m). 8. OBSERVATIE Folosirea spectrometriei de emisie optica cu plasma cuplata inductiv, este permisă ca o alternativa la spectrometria de absorbţie atomică în flacara. C. DETERMINAREA ALUMINIULUI 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Metoda reglementează determinarea aluminiului prezent în complecsii hidroxiclorurii de aluminiu şi zirconiu pana la o concentraţie a aluminiului în antiperspirantii non-aerosolici de 12% (m/m). 2. PRINCIPIU Aluminiul este extras din produs în condiţii acide şi determinat prin spectrometrie de absorbţie atomică în flacara. 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 3.1. Acid clorhidric, concentrat (d(2 5) = 1,18 g/ml) 3.2. Soluţie acid clorhidric, 1% (v/v): într-un pahar se adauga 10 ml acid clorhidric concentrat (3.1) la 500 ml de apa, amestecand continuu. Se transfera aceasta soluţie într-un balon cotat de un litru şi se adauga apa pana la semn. 3.3. Soluţie standard de aluminiu stoc, 1000 æg/ml în soluţie acid azotic 0,5 M ("Spectrosol" sau echivalent). 3.4. Reactiv clorura de potasiu: se dizolva 10,0 g clorura de potasiu în 250 ml soluţie acid clorhidric 1% (v/v) (3.2). 4. APARATURA 4.1. Echipament uzual de laborator 4.2. Spectrofotometru de absorbţie atomică echipat cu lampa cu catod tubular de aluminiu 5. PROCEDEU 5.1. Preparare proba Soluţia preparata la B.5.1.3 se foloseşte pentru determinarea conţinutului de aluminiu. 5.1.1. Într-un balon cotat de 100 ml se pipeteaza 5,00 ml din soluţia proba (B.5.3.1) şi 10,00 ml de reactiv clorura de potasiu (3.4). Se aduce la semn prin adăugarea unei soluţii 1% (v/v) acid clorhidric (3.2) şi se omogenizeaza. 5.2. Condiţii pentru spectrometria de absorbţie atomică Flacara: oxid azotos/acetilena Lungime de unda: 309,3 nm Corecţie de fond: nu Starea combustibilului: bogat; pentru o absorbanta maxima, este necesară optimizarea inaltimii arzatorului şi starilor combustibilului 5.3. Etalonare 5.3.1. Într-o serie de baloane cotate de 100 ml se pipeteaza 1,00, 2,00, 3,00, 4,00 şi 5,00 ml soluţie standard de aluminiu stoc (3.3). In fiecare balon se pipeteaza 10,00 ml reactiv clorura de potasiu (3.4). Se aduce la semn cu soluţie de acid clorhidric (3.2) 1% (v/v) şi se omogenizeaza. Aceste soluţii conţin 10, 20, 30, 40 şi respectiv 50 æg aluminiu per mililitru. In mod similar, se prepara o soluţie oarba omitand soluţia standard de aluminiu. 5.3.2. Se măsoară absorbanta soluţiei oarbe (5.3.1) şi se foloseşte valoarea obţinută drept concentraţie zero de aluminiu pentru curba de etalonare. Se măsoară absorbanta fiecărui standard de etalonare aluminiu (5.3.1). Se traseaza curba de etalonare prin punerea în relatie a valorilor absorbantei cu concentraţia de aluminiu. 5.4. Determinare Se măsoară absorbanta soluţiei proba (5.1.4). De pe curba de etalonare se citeşte concentraţia de aluminiu corespunzătoare valorii absorbantei obţinute pentru soluţia proba. 6. CALCUL Folosind formula următoare, se calculează conţinutul de aluminiu din proba:
c
% (m/m) aluminiu = ─────
5 x m
în care: m = masa în grame a probei luate în analiza (B.5.1.1) c = concentraţia de aluminiu în soluţia proba (5.1.4), în micrograme per mililitru, obţinută de pe curba de etalonare. 7. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de aluminiu de 3,50% (m/m), diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească 0,10% (m/m). 8. OBSERVAŢII Folosirea spectrometriei de emisie optica cu plasma cuplata inductiv, este permisă ca o alternativa la spectrometria de absorbţie atomică în flacara. D. DETERMINAREA CLORULUI 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Metoda reglementează determinarea clorului prezent ca ion de clorura în complecsii hidroxicloruri de aluminiu şi zirconiu în antiperspirantele non-aerosolice. 2. PRINCIPIU Ionul clorura din produs este determinat prin titrare potentiometrica cu soluţie de azotat de argint standard. 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. 3.1. Acid azotic, concentrat (d(2 5) = 1,42 g/ml) 3.2. Soluţie acid azotic, 5% (v/v): într-un pahar se adauga 25 ml acid azotic concentrat (3.1) la 250 ml de apa, amestecand continuu. Se aduce aceasta soluţie într-un balon cotat de un litru şi se adauga apa pana la semn. 3.3. Acetona 3.4. Azotat de argint, soluţie volumetrica 0,1M ("AnalaR" sau echivalent) 4. APARATURA 4.1. Echipament uzual de laborator 4.2. Agitator magnetic cu încălzire 4.3. Electrod de argint 4.4. Electrod de referinţa de calomel 4.5. pH-metru/milivoltmetru adecvat titrarii potentiometrice 5. PROCEDEU 5.1. Preparare proba 5.1.1. Într-un pahar de 250 ml se cantaresc cu precizie cca. 1,0 g ("m" grame) de proba omogenă de produs. Se adauga 80 ml apa şi 20 ml soluţie acid azotic 5% (v/v) (3.2). 5.1.2. Se pune paharul pe agitatorul magnetic cu încălzire (4.2). Se porneşte amestecarea şi se incalzeste pana la fierbere. Pentru a preveni uscarea rapida se pune peste pahar o sticla de ceas. Se fierbe cinci minute, se ia paharul de pe incalzitor şi se raceste la temperatura camerei. 5.1.3. Se adauga 10 ml acetona (3.3), se scufunda electrozii (4.3 şi 4.4) în soluţie şi se porneşte amestecarea. Se titreaza potentiometric cu soluţie de azotat de argint 0,1M (3.4) şi se traseaza o curba diferentiala pentru a determina punctul final ("V" ml). 6. CALCUL Folosind formula următoare, se calculează conţinutul de clor din proba, în procente masice:
0,3545 x V
% (m/m) clor = ──────────
m
în care: m = masa în grame a probei pentru testare (5.1.1) V = volumul de azotat de argint 0,1M, în mililitri, titrat la punctul final 7. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de clor de 4,00% (m/m), diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească 0,10% (m/m). E. CALCULAREA RAPORTULUI ATOMILOR DE ALUMINIU LA ATOMII DE ZIRCONIU, SI A ATOMILOR DE ALUMINIU PLUS ZIRCONIU LA ATOMII DE CLOR. 1. CALCULAREA RAPORTULUI ATOMILOR DE ALUMINIU LA ATOMII DE ZIRCONIU Pentru calcularea raportului Al:Zr se foloseşte formula:
Al % (m/m) x 91,22
raport Al:Zr = ──────────────────
Zr % (m/m) x 26,98
2. CALCULAREA RAPORTULUI ATOMILOR DE ALUMINIU PLUS ZIRCONIU LA ATOMII DE CLOR Pentru calcularea raportului (Al + Zr):Cl se foloseşte formula:
Al % (m/m) + Zr % (m/m)
────────── ──────────
26,98 91,22
raport (Al + Zr):Cl = ───────────────────────
Cl % (m/m)
──────────
35,45
ANEXA 36 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU HEXAMIDINA, DIBROMOHEXAMIDINA, DIBROMOPROPAMIDINA SI CLORHEXIDINA 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Acesta este metoda reglementată pentru determinarea cantitativă şi calitativă a: - hexamidinei şi sarurilor sale, inclusiv izetionatul şi 4-hidroxibenzoatul, - dibromohexamidinei şi sarurilor sale, inclusiv izetionatul, - dibromopropamidinei şi sarurilor sale, inclusiv izetionatul, - diacetatului, digluconatului şi dihidroclorurii de clorhexidina în produsele cosmetice 2. DEFINIŢIE Concentraţiile de hexamidina, dibromohexamidina, dibromopropamidina şi clorhexidina determinate prin aceasta metoda sunt exprimate în procente masice (% m/m). 3. PRINCIPIU Identificarea şi determinarea este realizată prin cromatografie de lichid de înalta performanta (HPLC), în faza inversa, cu pereche de ioni, urmată de detecţie spectrofotometrica în ultraviolet. Hexamidina, dibromohexamidina, dibromopropamidina şi clorhexidina sunt identificate prin timpii lor de retenţie în coloana cromatografica. 4. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica şi adecvati HPLC, unde este cazul. 4.1. Metanol 4.2. Acid 1-heptansulfonic, sare de sodiu, monohidratat 4.3. Acid acetic, glacial (d(2 5) = 1,05 g/ml) 4.4. Clorura de sodiu 4.5. Faze mobile: 4.5.1. Solvent I: acid 1-heptansulfonic soluţie 0,005M, sare de sodiu, monohidratat (4.2) în metanol (4.1), adus la un pH aparent de 3,5 cu acid acetic glacial (4.3). 4.5.2. Solvent II: acid 1-heptansulfonic soluţie 0,005M, sare de sodiu, monohidratat (4.2) în apa, adus la un pH de 3,5 cu acid acetic glacial (4.3). Observatie: Dacă este necesară îmbunătăţirea formei picurilor, fazele mobile pot fi modificate şi preparate după cum urmează: - solvent I: se dizolva 5,84 g clorura de sodiu (4.4) şi 1,1013 g acid 1-heptansulfonic, sare de sodiu, monohidratat (4.2) în 100 ml apa. Se adauga 900 ml metanol (4.1) şi se aduce la un pH aparent de 3,5 cu acid acetic glacial (4.3), - solvent II: se dizolva 5,84 g clorura de sodiu (4.4) şi 1,1013 g acid 1-heptansulfonic, sare de sodiu, monohidrat (4.2) într-un litru de apa şi se aduce la un pH de 3,5 cu acid acetic glacial (4.3). 4.6. Diizetionat de hexamidina [C(2 5)H(2 6)N(4)O(2) ● 2C(2)H(6)O(4)S] 4.7. Diizetionat de dibromohexamidina [C(2 5)H(2 6)Br(2)N(4)O(2) ● 2C(2)H(6)O(4)S] 4.8. Diizetionat de dibromopropamidina [C(1 7)H(1 8)Br(2)N(4)O(2) ● 2C(2)H(6)O(4)S] 4.9. Diacetat de clorhexidina [C(2 2)H(3 5)C(1 2)N(1 5) ● 2C(2)H(4)O(2)] 4.10. Soluţii de referinţa: se prepara soluţii 0,05% (m/v) din fiecare dintre cei patru conservand (4.6 pana la 4.9) în solvent I (4.5.1) 4.11. 3,4,4'-Triclorocarbanilida (triclocarban) 4.12. 4,4'-Dicloro-3-(trifluorometil) carbanilida (halocarban) 5. APARATURA 5.1. Echipament uzual de laborator 5.2. Cromatograf de lichid de înalta performanta cu detector UV cu lungime de unda variabila 5.3. Coloana analitica: oţel inoxidabil, lungime 30 cm, diametru interior 4 mm, umpluta cu æ-Bondapack C18, 10 æm, sau echivalent 5.4. Baie ultrasonica 6. IDENTIFICARE 6.1. Preparare proba Se cântăreşte cca. 0,5 g proba într-un balon cotat de 10 ml şi se aduce la semn cu solvent I (4.5.1). Se pune balonul pe o baie ultrasonica (5.4) timp de 10 minute. Se filtreaza sau se centrifugheaza soluţia. Se colectează filtratul sau supernatantul pentru cromatografie. 6.2. Cromatografiere 6.2.1. Gradient faza-mobila
┌──────────┬────────────────────────┬──────────────────────────┐
│Timp (min)│solvent I(% v/v) (4.5.1)│solvent II (% v/v) (4.5.2)│
├──────────┼────────────────────────┼──────────────────────────┤
│ 0 │ 50 │ 50 │
├──────────┼────────────────────────┼──────────────────────────┤
│ 15 │ 65 │ 35 │
├──────────┼────────────────────────┼──────────────────────────┤
│ 30 │ 65 │ 35 │
├──────────┼────────────────────────┼──────────────────────────┤
│ 45 │ 50 │ 50 │
└──────────┴────────────────────────┴──────────────────────────┘
6.2.2. Se regleaza debitul fazei mobile (6.2.1) la 1,5 ml/min şi temperatura coloanei la 35°. 6.2.3. Se fixează lungimea de unda a detectorului la 264 nm. 6.2.4. Se injecteaza 10 æl din fiecare dintre soluţiile de referinţa (4.10) şi se înregistrează cromatogramele lor. 6.2.5. Se injecteaza 10 æl din soluţia proba (6.1) şi se înregistrează cromatograma sa. 6.3. Se identifica dacă, hexamidina, dibromohexamidina, dibromopropamidina sau clorhexidina este prezenta prin compararea timpului (timpilor) de retenţie al picului (ai picurilor) înregistrat(e) în (6.2.5) cu cele obţinute din soluţiile de referinţa în 6.2.4. 7. DETERMINARE 7.1. Preparare soluţii standard. Se foloseşte drept standard intern unul dintre conservantii (4.6 pana la 4.9) care este absent din proba. Dacă aceasta nu este posibil, pot fi folosite ca standard intern, triclorcarbanul (4.11) sau halocarbanul (4.12). 7.1.1. O soluţie stoc 0,05% (m/v) în solvent I (4.5.1) de conservant identificat la 6.3. 7.1.2. O soluţie stoc 0,05% (m/v) în solvent I (4.5.1) de conservant ales drept standard intern. 7.1.3. Pentru fiecare conservant identificat, se prepara patru soluţii standard prin transferarea într-o serie de baloane cotate de 10 ml a unor cantităţi de soluţie stoc de conservant identificat (7.1.1) şi a unor cantităţi adecvate de soluţie stoc de standard intern (7.1.2) în conformitate cu tabelul de mai jos. Se aduce fiecare balon la semn cu solvent I (4.5.1) şi se amesteca.
─────────┬────────────────────────────┬───────────────────────────────────
Soluţie │Soluţie stoc standard intern│Soluţie stoc conservant identificat
standard ├────────────────────────────┼────────────────────┬──────────────
│ml (7.1.2) adăugaţi │ml (7. 1.1) adăugaţi│ æg/ml (*)
─────────┼────────────────────────────┼────────────────────┼──────────────
I │ 1,0 │ 0,5 │ 25
─────────┼────────────────────────────┼────────────────────┼──────────────
II │ 1,0 │ 1,0 │ 50
─────────┼────────────────────────────┼────────────────────┼──────────────
III │ 1,0 │ 1,5 │ 75
─────────┼────────────────────────────┼────────────────────┼──────────────
IV │ 1,0 │ 2,0 │ 100
─────────┴────────────────────────────┴────────────────────┴──────────────
-------------
(*) Aceste valori sunt date ca indicaţie şi corespund concentraţiilor de
conservanţi identificati în soluţii standard preparate folosind o soluţie
stoc care conţine exact 0,05% conservant identificat.
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────
7.2. Preparare proba 7.2.1. Se cântăreşte cu precizie cca. 0,5 g ("p" grame) proba într-un balon cotat de 10 ml, se adauga 1,0 ml soluţie standard intern (7.1.2) şi 6 ml solvent I (4.5.1) şi se omogenizeaza. 7.2.2. Se pune balonul pe o baie ultrasonica (5.4) pentru 10 minute. Se raceste. Se aduce la semn cu solvent I şi se omogenizeaza. Se centrifugheaza sau se filtreaza prin hârtie de filtru cutata, în funcţie de caz, se colectează pentru cromatografie supernatantul sau filtratul. 7.3. Cromatografiere 7.3.1. Se regleaza gradientul fazei mobile, debitul de curgere, temperatura coloanei şi lungimea de unda a detectorului echipamentului HPLC (5.2) la condiţiile cerute de etapa de identificare (6.2.1 pana la 6.2.3). 7.3.2. Se injecteaza 10 æl soluţie proba (7.2.2) şi se măsoară suprafeţele picurilor. Se repeta procesul cu noi porţiuni de 10 æl soluţie proba pana când se obţin rezultate consistente. Se calculează raportul dintre suprafaţa picului produsă de compusul de analizat şi suprafaţa picului produs de standardul intern. 7.4. Etalonare 7.4.1. Se injecteaza 10 æl din fiecare soluţie standard (7.1.3) şi se măsoară suprafeţele picurilor 7.4.2. Pentru fiecare soluţie standard (7.1.3), se calculează raportul dintre suprafaţa picului hexamidinei, dibromohexamidinei, dibromopropamidinei sau clorhexidinei şi suprafaţa picului standardului intern. Se traseaza o curba de etalonare folosind aceste rapoarte ca ordonată, iar ca abscisa concentraţiile corespondente ale conservantului identificat în soluţiile standard, în micrograme per mililitru. 7.4.3. De pe curba de etalonare (7.4.2) se citeşte concentraţia de conservant identificat, corespunzătoare raportului suprafatelor picurilor calculat la 7.3.2 8. CALCUL 8.1. Se calculează conţinutul de hexamidina, dibromohexamidina, dibromopropamidina sau clorhexidina în proba, ca procent masic, folosind următoarea formula:
c MW(1)
% (m/m) = ──────── x ─────
1000 x p MW(2)
în care: p = masa în grame a probei pentru testare (7.2.1); c = concentraţia conservantului în soluţia proba, în micrograme per mililitru, obţinută din curba de etalonare; MW(1) = masa moleculara a formei bazice a conservantului prezent; MW(2) = masa moleculara a sării corespunzătoare (vezi punctul 10). 9. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru o concentraţie de hexamidina, dibromohexamidina, dibromopropamidina sau clohexidina de 0,1% (m/m) diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească 0,0005%. 10. TABEL DE GREUTĂŢI MOLECULARE
──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
Hexamidina C(2 0)H(2 6)N(4)O(2) 354,45
Diizetionat de hexamidina C(2 0)H(2 6)N(4)O(2) c 2C(2)H(6)O(4)S 606,72
Di-p-hidroxibenzoat de
hexamidina C(2 0)H(2 6)N(4)O(2) c 2C(7)H(6)O(2) 630,71
Dibromohexamidina C(2 0)H(2 6)Br(2)N(4)0(2) 512,24
Diizetionat de
dibromohexamidina C(2 0)H(2 6)Br(2)N(4)0(2) c 2C(2)H(6)0(4)S 764,51
Dibromopropamidina C(1 7)H(1 8)Br(2)N(4)O(2) 470,18
Diizetionat de
dibromopropamidina C(1 7)H(1 8)Br(2)N(4)O(2) c 2C(2)H(6)0(4)S 722,43
Clorhexidina C(2 2)H(3 0)Cl(2)N(1 0) 505,45
Diacetat de clorhexidina C(2 2)H(3 0)Cl(2)N(1 0) c 2C(2)H(4)0(2) 625,56
Digluconat de clorhexidina C(2 2)H(3 0)Cl(2)N(1 0) c 2C(6)H(1 2)0(7) 897,76
Dihidroclorura de
clorhexidina C(2 2)H(3 0)Cl(2)N(1 0) c 2HCl 578,37
──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
ANEXA 37 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU ACIDUL BENZOIC, ACIDUL 4-HIDROXIBENZOIC, ACIDUL SORBIC, ACIDUL SALICILIC SI ACIDUL PROPIONIC 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Metoda reglementează identificarea şi determinarea acidului benzoic, acidului 4-hidroxibenzoic, acidului sorbic, acidului salicilic şi a acidului propionic în produsele cosmetice, în secţiuni separate sunt prezentate: A. identificarea acestor conservanţi; B. determinarea acidului 4-hidroxibenzoic, acidului salicilic, acidului sorbic şi acidului benzoic; C. determinarea acidului propionic. 2. DEFINIŢIE Cantităţile de acid benzoic, acid 4-hidroxibenzoic, acid sorbic, acid salicilic şi acid propionic determinate prin aceasta metoda sunt exprimate ca procente masice de acizi liberi. A. IDENTIFICARE 1. PRINCIPIU După extracţia acid/baza a conservantilor, extractul este analizat prin cromatografie în strat subtire (CCS) implicând derivatizarea probei "pe loc", în funcţie de rezultate, identificarea este confirmată prin cromatografie de lichid de înalta performanta (HPLC) sau în cazul acidului propionic prin cromatografie de gaze (CG). 2. REACTIVI 2.1. Generalitati Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. Apa folosită trebuie sa fie apa distilata, sau apa de puritate cel puţin echivalenta. 2.2. Acetona 2.3. Dietileter 2.4. Acetonitril 2.5. Toluen 2.6. n-Hexan 2.7. Parafina, lichidă 2.8. Acid clorhidric, 4M 2.9. Soluţie hidroxid de potasiu, 4M 2.10. Clorura de calciu, CaCl(2) ● 2H(2)O 2.11. Carbonat de litiu, Li(2)CO(3) 2.12. 2-bromo-2'-acetonaftona 2.13. Acid 4-hidroxibenzoic 2.14. Acid salicilic 2.15. Acid benzoic 2.16. Acid sorbic 2.17. Acid propionic 2.18. Soluţii de referinţa Se prepara soluţii 0,1% (m/v) (100mg/100ml) din fiecare dintre cei cinci conservanţi (2.13 - 2.17) în dietileter. 2.19. Reactiv de derivatizare - soluţie de 2-bromo-2'-acetonaftona (2.12) 0,5% (m/v) în acetonitril (2.4) (50mg/10ml). Aceasta soluţie trebuie preparata săptămânal şi depozitată în frigider. 2.20. Soluţie catalitica - soluţie de carbonat de litiu (2.11) 0,3% (m/v) în apa (300mg/100ml). Aceasta soluţie trebuie sa fie proaspăt preparata. 2.21. Solvent de developare Toluen (2.5)/acetona (2.2) (20:0,5, v/v) 2.22. Parafina lichidă (2.7)/n-hexan (2.6) (1:2, v/v). 3. APARATURA Echipament obişnuit de laborator. 3.1. Baie de apa, capabilă sa menţină temperatura la 60°C 3.2. Tanc de developare 3.3. Sursa de lumina UV, 254 şi 366 nm 3.4. Plăci pentru cromatografie în strat subtire CSS, Kieselgel 60, fără indicator de fluorescenta, 20 x 20 cm, grosime strat 0,25 mm cu zona de concentrare 2,5 x 20 cm (Merck 11845, sau echivalent). 3.5. Microseringa, 10 æl 3.6. Microseringa, 25 æl 3.7. Etuva, capabil sa menţină temperaturi pana la 105°C. 3.8. Eprubete de sticla cu dop rodat, 50 ml 3.9. Hârtie de filtru, diametru 90 mm, Schleicher & Schull, Weissband No. 5892 sau echivalent 3.10. Hârtie indicatoare de pH universala, pH 1-11 3.11. Fiole de probe, din sticla, 5 ml 3.12. Evaporator cu film rotativ (Rotavapor sau echivalent) 3.13. Plita electrica. 4. PROCEDEU 4.1. Preparare proba Într-o eprubeta de sticla cu dop rodat se cântăreşte cca. 1 g proba (3.8). Se adauga patru picaturi acid clorhidric 4M (2.8) şi 40 ml acetona (2.2). Pentru produşi puternic bazici cum ar fi sapunul de toaleta, trebuie adăugate 20 picaturi acid clorhidric 4M (2.8). Se verifica ca pH-ul sa fie aproximativ doi, folosind hârtie indicatoare (3.10). Se închide eprubeta şi se agita puternic timp de un minut. Dacă este necesară facilitarea extracţiei conservantilor în faza de acetona, se incalzeste uşor amestecul la cca. 60°C pentru topirea fazei grase. Se raceste soluţia la temperatura camerei şi se filtreaza prin hârtie de filtru (3.10) într-un flacon conic. Se transfera 20 ml de filtrat într-un flacon conic de 200 ml, se adauga 20 ml apa şi se amesteca. Se ajustează pH-ul amestecului la cca. 10 cu hidroxid de potasiu 4M (2.9), folosind hârtie indicatoare (3.10) pentru măsurarea acestuia. Se adauga 1 gram clorura de calciu (2.10) şi se agita puternic. Se filtreaza prin hârtie de filtru (3.9) într-o palnie de separare de 250 ml conţinând 75 ml dietileter (2.3) şi se agita puternic timp de un minut. Se lasa sa se separe şi se colectează stratul apos într-un flacon conic de 250 ml. Se indeparteaza stratul de eter. Folosind hârtie indicatoare (3.10) se ajustează pH-ul soluţiei apoase la cca. doi cu ajutorul acidului clorhidric 4M (2.8). Se adauga 10 ml dietileter (2.3), se astupa flaconul şi se agita puternic conţinutul timp de un minut. Se lasa sa se separe şi se transfera stratul eteric într-un evaporator cu film rotativ (3.12). Se indeparteaza stratul apos. Se evapora stratul de eter pana aproape de uscare şi se redizolva reziduul în 1 ml dietileter (2.3). Se transfera soluţia într-o fiola de proba (3.11). 4.2. Cromatografiere în strat subtire. Pentru fiecare dintre referintele şi probele ce vor fi cromatografiate, se spotuleaza cu o seringa (3.5) cca. 3 æl soluţie carbonat de litiu (2.2) la distanţe egale fata de linia de start în zona de concentrare a placii C.S.S. (3.4) şi se usucă într-un curent de aer rece. Se transfera placa C.S.S. pe o plita electrica (3.13), incalzita la 40°C, pentru a menţine spoturile cat mai mici cu putinţa. Cu o microseringa (3.5) se spotuleaza 10 æl din fiecare dintre soluţiile de referinţa (2.18) şi soluţia proba (4.1) pe linia de start a placii, exact pe punctele unde a fost aplicată soluţia de carbonat de litiu. La sfârşit se spotuleaza cca. 15 æl reactiv de derivatizare (2.19) (soluţie 2-bromo-2'-acetonaftona), din nou exact pe punctele unde au fost aplicate soluţiile de referinţa/proba şi soluţia de carbonat de litiu. Se incalzeste placa cromatografica într-o etuva (3.7) la 80°C timp de 45 minute. După răcire, se elueaza placa într-un tanc (3.2) care a fost echilibrat timp de 15 minute (fără a fi fost captusit cu hârtie de filtru), folosind ca eluent amestecul de solventi 2.21 (toluen/acetona), pana ce frontul solventului a migrat pe o distanta de 15 cm. (Poate dura 80 minute). Se usucă placa într-un curent de aer rece şi se examinează spoturile obţinute în lumina UV (3.3). Pentru a imbunatatii fluorescenta spoturilor slabe, placa C.S.S. poate fi cufundata în amestec parafina lichidă/n-hexan (2.22). 5. IDENTIFICARE. Se calculează Rf pentru fiecare spot. Se compara Rf şi comportarea la radiaţie UV obţinută pentru proba cu cea obţinută pentru soluţiile de referinţa. Se trage o concluzie preliminară privind prezenta şi identitatea prezentei conservantilor prezenţi. Se realizează cromatografia de lichide de înalta performanta (HPLC) descrisă în capitolul B, sau, când apare ca prezent acidul propionic, cromatografia de gaze (CG) descrisă în capitolul C. Se compara timpii de retenţie obţinuţi cu cei ai soluţiilor de referinţa. Se combina rezultatele din CSS şi HPLC sau CG şi se face identificarea finala a conservantilor prezenţi în proba pe baza rezultatelor combinate. B. DETERMINAREA CANTITATIVĂ A ACIDULUI BENZOIC, ACIDULUI 4-HIDROXIBENZOIC, ACIDULUI SORBIC SI ACIDULUI SALICILIC 1. PRINCIPIU După acidifiere, proba este extrasa cu un amestec de etanol şi apa. După filtrare, conservantii sunt determinaţi prin cromatografie de lichide de înalta performanta (HPLC). 2. REACTIVI 2.1. Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica, şi adecvati HPLC. Apa folosită trebuie sa fie apa distilata, sau apa de cel puţin puritate echivalenta. 2.2. Etanol, absolut 2.3. Acid 4-hidroxibenzoic 2.4. Acid salicilic 2.5. Acid benzoic 2.6. Acid sorbic 2.7. Acetat de sodiu [CH(3)COONa ● 3H(2)O] 2.8. Acid acetic, d(4)^2 [] = 1,05 g/ml 2.9. Acetonitril 2.10. Acid sulfuric, 2M 2.11. Soluţie hidroxid de potasiu, 0,2M 2.12. Acid 2-metoxibenzoic 2.13. Amestec etanol/apa Se amesteca doua volume de etanol (2.2) şi un volum de apa (2:1) 2.14. Soluţie standard intern Se prepara o soluţie conţinând cca. 1 g acid 2 metoxibenzoic (2.12) în 500 ml amestec etanol/apa (2.13) 2.15. Faza mobila pentru HPLC 2.15.1. Tampon acetat: la 1 litru apa se adauga 6,35 g acetat de sodiu (2.7) şi 20 ml acid acetic (2.8) şi se amesteca. 2.15.2. Se prepara faza mobila prin amestecarea a noua volume de tampon acetat (2.15.1) şi un volum de acetonitril (2.9). 2.16. Soluţie stoc de conservant Într-un balon cotat de 50 ml se cantaresc cu precizie cca. 0,05 g acid 4-hidroxibenzoic (2.3), 0,2 g acid salicilic (2.4), 0,2 g acid benzoic (2.5) şi 0,05 grame acid sorbic şi se aduce la semn cu amestec etanol/apa (2.13). Aceasta soluţie se depozitează în frigider. Soluţia este stabilă pentru o saptamana. 2.17. Soluţii de conservanţi standard Într-o serie de baloane cotate de 20 ml se transfera 8,00, 4,00, 2,00, 1,00 şi respectiv 0,5 ml soluţie stoc (2.16). In fiecare balon cotat se adauga 10,0 ml soluţie standard intern (2.14) şi 0,5 ml acid sulfuric 2M (2.10). Se aduce la semn cu amestec etanol/apa (2.13). Aceste soluţii trebuie sa fie proaspăt preparate. 3. APARATURA Echipament uzual de laborator, si: 3.1. Baie de apa, setata la 60°C 3.2. Cromatograf de lichide de înalta performanta HPLC cu detector UV cu lungime de unda variabila şi ciclu de injecţie de 10æl. 3.3. Coloana analitica de oţel inoxidabil, lungime 12,5 pana la 25 cm, diametru interior 4,6 mm, umpluta cu Nucleosil 5C18, sau echivalent 3.4. Hârtie de filtru, diametru: 90 mm, Schleicher şi Schull, Weissband No 5892, sau echivalent. 3.5. Eprubete de sticla cu dop rodat, 50 ml. 3.6. Fiole de proba, din sticla, 5 ml 3.7. Bucatele de portelan pentru fierbere, carborund, dimensiuni de la 2 la 4 mm, sau echivalent. 4. PROCEDEU 4.1. Preparare proba 4.1.1. Preparare proba fără adaos de standard intern Într-o eprubeta de sticla de 50 ml cu dop rodat (3.5) se cântăreşte 1 g proba. Cu pipeta se pun în eprubeta 1,00 ml acid sulfuric 2M (2.10) şi 40,0 ml amestec etanol/apa (2.13). Se adauga cca. 1 g bucatele de portelan pentru fierbere (3.7), se închide eprubeta şi se agita puternic pentru cel puţin un minut pana la obţinerea unei suspensii omogene. Pentru a facilita extracţia conservantilor în faza de etanol, se pune eprubeta pentru exact cinci minute într-o baie de apa (3.1) menţinută la 60°C. Se raceste imediat eprubeta într-un curent de apa rece şi se păstrează extractul la 5°C pentru o ora. Se filtreaza extractul prin hârtie de filtru (3.4). Se transfera cca. 2 ml extract într-o fiola de proba (3.6). Se păstrează extractul la 5°C şi se realizează determinarea HPLC într-un interval de 24 de ore de la preparare. 4.1.2. Prepararea probei cu adaos de standard intern Într-o eprubeta de sticla de 50 ml cu dop rodat (3.5) se cântăreşte cu precizie la a treia zecimala 1 § 0,1 g ("a" grame) de proba. Se adauga cu pipeta 1,00 ml acid sulfuric 2M (2.10) şi 30,0 ml amestec etanol/apa (2.13). Se adauga cca. 1 gram bucatele de portelan pentru fierbere (3.7) şi 10,00 ml soluţie standard intern (2.14). Se închide eprubeta şi se agita puternic cel puţin un minut pana la obţinerea unei suspensii omogene. Pentru a facilita extracţia conservantilor în faza de etanol, se pune eprubeta pentru exact cinci minute într-o baie de apa (3.1) menţinută la 60°C. Se raceste imediat eprubeta într-un curent de apa rece şi se tine extractul la 5°C pentru o ora. Se filtreaza extractul prin hârtie de filtru (3.4). Se transfera cca. 2 ml extract într-o fiola de proba (3.6). Se depozitează extractul la 5°C şi se realizează determinarea HPLC într-un interval de 24 de ore de la preparare. 4.2. Cromatografiere de lichide de înalta performanta (HPLC) Faza mobila: acetonitril/tampon acetat (2.15) Se regleaza debitul fazei mobile prin coloana la 2,0 § 0,5 æl/min. Se seteaza lungimea de unda a detectorului la 240 nm. 4.2.1. Etalonare Se injecteaza porţiuni de 10 æl din fiecare soluţie de conservant standard (2.17) în cromatograful de lichide (3.2). Pentru fiecare soluţie se determina rapoartele dintre inaltimile picurilor conservantilor investigati şi înălţimea picului standardului intern, obţinute din cromatograme. Se traseaza un grafic pentru fiecare conservant punând în relatie raportul inaltimii picului cu concentraţia fiecărei soluţii standard. Asiguraţi-va ca în procedeul de etalonare, pentru soluţiile standard, se obţine un răspuns linear. 4.2.2. Determinare Se injecteaza 10 æl extract de proba (4.1.1) în cromatograful de lichide (3.2) şi se înregistrează cromatograma. Se injecteaza 10 æl soluţie de conservant standard (2.17) şi se înregistrează cromatograma. Se compara cromatogramele obţinute. Dacă în cromatograma extractului de proba (4.1.1) nu apare prezent nici un pic având aproximativ acelaşi timp de retenţie ca acidul 2-metoxibenzoic (standardul intern recomandat), se injecteaza 10 æl extract de proba cu adaos de standard intern (4.1.2) în cromatograful de lichide şi se înregistrează cromatograma. Dacă se observa în cromatograma extractului de proba (4.1.1) un pic ce interfereaza, având acelaşi timp de retenţie ca acidul 2-metoxibenzoic, trebuie selectat un alt standard intern adecvat. (Dacă unul dintre conservantii investigati este absent din cromatograma, acest conservant poate fi folosit drept standard intern). Asiguraţi-va ca cromatogramele obţinute pentru o soluţie standard şi soluţia proba sa îndeplinească următoarele cerinţe: - separarea picului celei mai prost separate perechi trebuie sa fie de cel puţin 0,90 (pentru definirea separarii picului, vezi figura 1) Figura 1 Separarea picului Dacă nu se realizează separarea dorita, sau trebuie folosită o coloana mai eficienta, sau trebuie ajustata compoziţia fazei mobile pana la îndeplinirea cerintei. - factorul de asimetrie A(s) al tuturor picurilor obţinute trebuie sa fie cuprins într-un interval de la 0,9 pana la 1,5. (pentru definirea factorului de asimetrie A(s), vezi figura 2). Pentru a înregistra cromatograma pentru determinarea factorului de asimetrie se recomanda o viteza de înregistrare a graficului de cel puţin 2 cm/minut. Figura 2 Factor de asimetrie a picului - trebuie sa se obţină o linie de baza continua. 5. CALCUL Se folosesc rapoartele dintre inaltimile picurilor conservantilor investigati la înălţimea picului acidului 2-metoxibenzoic (standard intern) şi graficul de etalonare pentru a calcula concentraţia conservantilor acizi în soluţia proba. Se calculează conţinutul de acid benzoic, acid 4-hidroxibenzoic, acid sorbic sau acid salicilic în proba, ca procent masic (x(i)) folosind formula:
100 x 20 b b
x(i)% (m/m) = ────────── = ───────
10^-6 x a 500 x a
în care: a = masa (g) a probei pentru testare (4.1.2.) b = concentraţia (æg/ml) de conservant în extractul de proba (4.1.2.) obţinută din graficul de etalonare. 6. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de acid 4-hidroxibenzoic de 0,40%, diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,035%. Pentru un conţinut de acid benzoic de 0,50%, diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceiaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,050%. Pentru un conţinut de acid salicilic de 0,50% diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceiaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,045%. Pentru un conţinut de acid sorbic de 0,60% diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceiaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,035%. 7. OBSERVAŢII 7.1. Rezultatele unui test dur efectuat metodei indica următoarele: cantitatea de acid sulfuric adăugată pentru extragerea acizilor din proba este critica, şi limitele pentru cantitatea de proba luată în lucru trebuie sa fie menţinute în granitele prescrise. 7.2. Dacă se doreşte, poate fi folosită o coloana de siguranţa adecvată. C. DETERMINAREA ACIDULUI PROPIONIC 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta metoda reglementează determinarea acidului propionic, de concentraţie maxima 2% (m/m), în produsele cosmetice. 2. DEFINIŢIE Concentraţia acidului propionic masurata prin aceasta metoda este exprimată ca procent masic (% m/m) de produs. 3. PRINCIPIU După extragerea acidului propionic din produs, determinarea se realizează cu ajutorul cromatografiei de gaz cu folosirea acidului 2-metilpropionic ca standard intern. 4. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica; trebuie sa se folosească apa distilata sau apa de calitate echivalenta. 4.1. Etanol 96% (v/v) 4.2. Acid propionic 4.3. Acid 2-metilpropionic 4.4. Acid ortofosforic, 10% (m/v) 4.5. Soluţie acid propionic Într-un balon cotat de 50 ml se cântăreşte cu precizie cca. 1,00 g ("p" grame) acid propionic şi se aduce la semn cu etanol (4.1) 4.6. Soluţie standard intern Într-un balon cotat de 50 ml se cântăreşte cu precizie cca. 1,00 g ("e" grame) acid 2-metilpropionic şi se aduce la semn cu etanol (4.1) 5. APARATURA 5.1. Echipament uzual de laborator si: 5.2. Cromatograf de gaze cu detector cu ionizare în flacara 5.3. Eprubeta de sticla cu dop rodat (20 x 150 mm) 5.4. Baie de apa la 60°C 5.5. Seringa de sticla de 10 ml cu membrana de filtrare (diametrul porilor: 0,45 æm) 6. PROCEDEU 6.1. Preparare proba 6.1.1. Preparare proba fără standard intern Într-o eprubeta de sticla (5.3) se cântăreşte cca. 1 g proba. Se adauga 0,5 ml acid fosforic (4.4) şi 9,5 ml etanol (4.1). Se închide eprubeta şi se agita bine. Dacă este necesar se pune eprubeta într-o baie de apa la 60°C (5.4) pentru cinci minute, pentru dizolvarea completa a fazei grase. Se raceste rapid în curent de apa. Se filtreaza cota parte din soluţie printr-o membrana de filtrare (5.5). Se cromatografiaza filtratul în aceiaşi zi. 6.1.2. Preparare proba cu standard intern Într-o eprubeta de sticla se cântăreşte cu precizie la a treia zecimala 1 g § 0,1 ("a" grame) proba. Se adauga 0,5 ml acid fosforic (4.4), 0,5 ml soluţie standard intern (4.6) şi 9 ml etanol (4.1) Se închide eprubeta şi se agita bine. Dacă este necesar se pune eprubeta într-o baie de apa la 60°C (5.4) pentru cinci minute, pentru dizolvarea completa a fazei grase. Se raceste rapid în curent de apa. Se cromatografiaza filtratul în aceiaşi zi. 6.2. Condiţii pentru cromatografia de gaze. Se recomanda următoarele condiţii de operare:
─────────────────────────────────────────────────────────────────
Coloana
Tip Oţel inoxidabil
Lungime 2m
Diametru 1/8"
Umplutura 10% SP(TM) 1000 (sau echivalent) + 1% H(3)PO(4) pe
Chromosorb WAW 100 pana la 120 mesh
Temperatura
Injector 200°C
Coloana 120°C
Detector 200°C
Gaz purtător azot
Debit de curgere 25ml/min
─────────────────────────────────────────────────────────────────
6.3. Cromatogafiere 6.3.1. Etalonare Într-o serie de baloane cotate de 20 ml se pipeteaza 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, respectiv 4,00 ml soluţie acid propionic (4,5). In fiecare balon cotat se pipeteaza 1,00 ml soluţie standard intern (4.6); se aduce la semn cu etanol (4.1) şi se amesteca. Soluţiile preparate în acest mod conţin "e" mg/ml acid 2-metilpropionic ca standard intern (adică, 1 mg/ml dacă e = 1000) şi p/4, p/2, p, 2p, 4p mg/ml acid propionic (adică 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 4,00 mg/ml dacă p = 1000). Se injecteaza 1 æl din fiecare dintre aceste soluţii şi se obţine curba de etalonare prin trasarea pe axa X a raportului masic acid propionic/acid 2-metilpropionic iar pe axa Y a raportului suprafeţelor picurilor corespondente. Se efectuează trei injectii din fiecare soluţie şi se calculează raportul mediu al suprafeţelor picurilor. 6.3.2. Determinare Se injecteaza 10 æl filtrat de proba (6.1.1). Se compara cromatograma cu cea a soluţiilor standard (6.3.1). Dacă un pic are aproximativ acelaşi timp de retenţie ca acidul 2-metilpropionic, se schimba standardul intern. Dacă nu este observata nici o interferenta, se injecteaza 10 æl filtrat de proba 6.1.2 şi se măsoară suprafeţele picurilor acidului propionic şi al standardului intern. Se efectuează trei injectii din fiecare soluţie şi se calculează raportul mediu al suprafeţelor picurilor. 7. CALCUL 7.1. Din curba de etalonare obţinută la 6.3.1, se obţine raportul masic (K) corespunzător raportului suprafeţelor picurilor calculat la 6.3.2. 7.2. Din raportul masic astfel obţinut se calculează conţinutul de acid propionic al probei (x) ca procent masic, folosind următoarea formula:
0,5 x 100 x e e
x% (m/m) = K ───────────── = K ───
50 x a a
în care: K = raportul calculat la 7.1. e = masa în grame a standardului intern cântărit la 4.6. a = masa în grame a probei cantarita la 6.1.2. Rezultatele se rotunjesc la o zecimala. 8. REPETABILITATE (ISO 5725) Pentru un conţinut de acid propionic 2% (m/m) diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceiaşi proba nu trebuie sa depăşească 0,12%. ANEXA 38 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU HIDROCHINONA, MONOMETILETER HIDROCHINONA, MONOETILETER HIDROCHINONA SI MONOBENZILETER HIDROCHINONA IN PRODUSELE COSMETICE A. IDENTIFICARE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Metoda reglementează detectarea şi identificarea hidrochinonei, monometileter hidrochinonei, monoetileter hidrochinonei şi monobenzileter hidrochinonei (monobenzonei) în produsele cosmetice pentru albirea pielii. 2. PRINCIPIU Hidrochinona şi eterii săi sunt identificati prin cromatografie în strat subtire (CSS). 3. REACTIVI Toţi reactivii trebuie sa fie puritate analitica. 3.1. Etanol, 96% (v/v) 3.2. Cloroform 3.3. Dietileter 3.4. Solvent de developare Cloroform/dietileter, 66:33 (v/v) 3.5. Amoniac, 25% (m/m) [d(4)^2 [] = 0,91 g/ml] 3.6. Acid ascorbic 3.7. Hidrochinona 3.8. Monometileter hidrochinona 3.9. Monoetileter hidrochinona 3.10. Monobenzileter hidrochinona (monobenzona) 3.11. Soluţii de referinţa Următoarele soluţii de referinţa trebuie proaspăt preparate, şi sunt stabile doar o zi: 3.11.1. Într-o eprubeta gradata de 10 ml se cantaresc 0,05 g hidrochinona (3.7). Se adauga 0,250 g acid ascorbic (3.6) şi 5 ml etanol (3.1). Se adauga amoniac (3.5) pana când pH-ul devine 10 şi se aduce la semn cu etanol (3.1). 3.11.2. Într-o eprubeta gradata de 10 ml se cantaresc 0,05 g monometileter hidrochinona (3.8). Se adauga 0,250 g acid ascorbic (3.6) şi 5 ml etanol (3.1). Se adauga amoniac (3.5) pana când pH-ul devine 10 şi se aduce la semn cu etanol (3.1). 3.11.3. Într-o eprubeta gradata de 10 ml se cantaresc 0,05 g monoetileter hidrochinona (3.9). Se adauga 0,250 g acid ascorbic (3.6) şi 5 ml etanol (3.1). Se adauga amoniac (3.5) pana când pH-ul devine 10 şi se aduce la semn cu etanol (3.1). 3.11.4. Într-o eprubeta gradata de 10 ml se cantaresc 0,05 g monoebenzileter hidrochinona (3.10). Se adauga 0,250 g acid ascorbic (3.6) şi 5 ml etanol (3.1). Se adauga amoniac (3.5) pana când pH-ul devine 10 şi se aduce la semn cu etanol (3.1). 3.12. Azotat de argint 3.13. Acid 12-molibdorfosforic 3.14. Fericianura de potasiu hexahidrata 3.15. Clorura ferica hexahidrata 3.16. Reactivi de pulverizare 3.16.1. La o soluţie apoasă 5% (m/v) azotat de argint (3.1.2), se adauga amoniac (3.5) pana la dizolvarea precipitatului care se formează. Atenţie: In timp soluţia devine exploziv-instabila, deci trebuie aruncata după folosire. 3.16.2. Soluţie 10% (m/v) acid 12-molibdorfosforic (3.13) în etanol (3.1). 3.16.3. Se prepara o soluţie apoasă 1% (m/v) de fericianura de potasiu (3.14) şi o soluţie apoasă 2% (m/v) de clorura ferica (3.15). Se amesteca părţi egale din ambele soluţii chiar înainte de folosire. 4. APARATURA. Echipament uzual de laborator si: 4.1. Echipament uzual pentru cromatografie în strat subtire CSS 4.2. Plăci pentru cromatografie în strat subtire CSS, gata preparate: silicagel GHR/UV(2 5 4); 20 x 20 cm (Machery, Nagel sau echivalent). Grosime strat: 0,25 mm. 4.3. Baie ultrasonica 4.4. Centrifuga 4.5. Lampa UV, 254 nm. 5. PROCEDEU 5.1. Preparare proba Într-o eprubeta gradata se cantaresc 3 g proba. Se adauga 0,250 g acid ascorbic (3.6) şi 5 ml etanol (3.1). Se regleaza pH-ul soluţiei la 10, folosind amoniac (3.5). Se aduce la semn cu etanol. (3.1). Se închide eprubeta cu un dop şi se omogenizeaza pe o baie ultrasonica timp de 10 minute. Se filtreaza prin hârtie de filtru sau se centrifugheaza la 3000 rot/min. 5.2. Cromatografiere în strat subtire 5.2.1. Se satureaza un tanc cromatografie cu solvent de developare (3.4) 5.2.2. Se spotuleaza pe o placa 2 æl soluţii de referinţa (3.11) şi 2 æl soluţie proba (5.1). Se developeaza în intuneric la temperatura ambianta pana când frontul de solvent a migrat 15 cm fata de start. 5.2.3. Se indeparteaza placa şi se lasa sa se usuce la temperatura camerei. 5.3. Detecţie 5.3.1. Se observa placa în lumina UV la 254 nm, şi se marchează poziţia spoturilor. 5.3.2. Se pulverizeaza cu: - reactiv azotat de argint (3.16.1) sau - reactiv acid 12-molidofosforic (3.16.3); se incalzeste la cca. 120°C, sau - soluţie fericianura de potasiu şi soluţie clorura ferica (3.16.3). 6. IDENTIFICARE Se calculează valoarea Rf pentru fiecare spot. Se compara spoturile obţinute pentru soluţia proba cu cele pentru soluţiile de referinţa din punct de vedere al: valorilor Rf; culorilor spoturilor la radiaţie UV; şi culorilor spoturilor după vizualizarea cu reactiv pulverizat. Se realizează cromatografierea de lichide de înalta performanta HPLC conform descrierii din capitolul următor (B), şi se compara timpii de retenţie obţinuţi pentru picul (picurile) probei cu cei ai soluţiilor de referinţa. Se combina rezultatele obţinute prin CSS şi HPLC pentru a identifica prezenta hidrochinonei si/sau a eterilor săi. 7. OBSERVAŢII In condiţiile descrise au fost observate următoarele valori Rf:
─────────────────────────────────────
hidrochinona 0,32
monometileter hidrochinona 0,53
monoetileter hidrochinona 0,55
monobenzileter hidrochinona 0,58
─────────────────────────────────────
B. DETERMINARE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta metoda reglementează procedeul pentru determinarea hidrochinonei, monometileter hidrochinonei, monoetileter hidrochinonei, monobenzileter hidrochinonei în produsele cosmetice pentru albirea pielii. 2. PRINCIPIU Proba este extrasa cu un amestec de apa/metanol în condiţii de încălzire uşoară pentru topirea oricărui material gras. Determinarea analitilor în soluţia rezultată este realizată prin cromatografie de lichide cu faza inversa cu detecţie UV. 3. REACTIVI 3.1. Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica. Apa folosită trebuie sa fie apa distilata sau apa de puritate cel puţin echivalenta. 3.2. Metanol 3.3. Hidrochinona 3.4. Monometieter hidrochinona 3.5. Monoetileter hidrochinona 3.6. Monobenzileter hidrochinona (monobenzona) 3.7. Tetrahidrofuran, puritate HPLC 3.8. Amestec apa/metanol 1:1 (v/v). Se amesteca un volum de apa şi un volum de metanol (3.2) 3.9. Faza mobila: amestec tetrahidrofuran/apa 45: 55 (v/v). Se amesteca 45 volume tetrahidrofuran (3.7) şi 55 volume apa. 3.10. Soluţie de referinţa Într-un balon cotat de 50 ml se cantaresc 0,06 g hidrochinona (3.4), 0,08 g monometileter hidrochinona (3.4), 0,10 g monoetileter hidrochinona (3.5) şi 0,12 g monobenzileter hidrochinona (3.6). Se dizolva şi se aduce la semn cu metanol (3.2). Se prepara soluţia de referinţa prin diluarea a 10,00 ml din aceasta soluţie la 50,00 ml cu amestec apa/metanol (3.8). Aceste soluţii trebuie sa fie proaspăt preparate. 4. APARATURA Echipament normal de laborator si: 4.1. Baie de apa, capabilă de menţinerea temperaturii la 60°C. 4.2. Cromatograf de lichide de înalta performanta HPLC cu detector UV cu lungime de unda variabila şi ciclu de injecţie de 10 æl. 4.3. Coloana analitica: Coloana cromatografica de oţel inoxidabil, lungime 250 mm, diametru interior 4,6 mm, umpluta cu fenil Zorbax (fenetilsilan legat chimic pe Zorbax SIL, la capete cu trimetilclorsilan), dimensiune de particule 6æm, sau echivalent. Nu se foloseşte o coloana de siguranţa, cu excepţia siguranţei de fenil, sau echivalent. 4.4. Hârtie de filtru, diametru 90 mm, Schleicher şi Schull, Weissband nr. 5892, sau echivalent. 5. PROCEDEU 5.1. Preparare proba Într-un balon cotat de 50 ml se cantaresc cu precizie la a treia zecimala 1 § 0,1 g ("a" grame) proba. Se disperseaza proba în 25 ml amestec apa/metanol (3.8). Se închide balonul şi se agita puternic pana la obţinerea unei suspensii omogene. Se agita cel puţin un minut. Se pune balonul într-o baie de apa (4.1) şi se menţine la 60°C pentru îmbunătăţirea extracţiei. Se raceste balonul şi se aduce la semn cu apa/metanol (3.8). Se filtreaza extractul folosind hârtie de filtru (4.4). Se realizează determinarea HPLC într-un interval de cel mult 24 ore de la pregătirea extractului. 5.2. Cromatografiere de lichide de înalta performanta (HPLC) 5.2.1. Se regleaza debitul de curgere al fazei mobile (3.9) la 1,0 ml/min şi se seteaza lungimea de unda a detectorului la 295 nm. 5.2.2. Se injecteaza 10 æl soluţie proba obţinută conform descrierii de la punctul 5.1, şi se înregistrează cromatograma. Se măsoară suprafeţele picurilor. Se realizează etalonarea conform descrierii din 5.2.3. Se compara cromatogramele obţinute pentru proba şi soluţiile de referinţa. Se folosesc suprafeţele picurilor şi factorii de răspuns (RF) calculaţi la 5.2.3. pentru a calcula concentraţia analitilor în soluţia proba. 5.2.3. Etalonare Se injecteaza 10 æl soluţie de referinţa (3.10) şi se înregistrează cromatograma. Se injecteaza de mai multe ori pana când este obţinută o suprafaţa a picului constanta. Se determina factorul de răspuns RF(i):
p(i)
RF(i) = ────
c(i)
în care: p(i) = suprafaţa picului pentru hidrochinona, monometileter hidrochinona, monoetileter hidrochinona sau monobenzileter hidrochinona, si c(i) = concentraţia (g/50 ml) în soluţia de referinţa (3.10) a hidrochinonei, monometileter hidrochinonei, monoetileter hidrochinonei sau monobenzileter hidrochinonei Asiguraţi-va ca cromatogramele obţinute pentru o soluţie standard şi soluţia proba sa îndeplinească următoarele cerinţe: - separarea picului celei mai prost separate perechi trebuie sa fie de cel puţin 0,90 (pentru definiţia separarii picului, vezi figura 1) Figura 1 Separarea picului Dacă nu se realizează separarea cerută, sau trebuie folosită o coloana mai eficienta sau trebuie ajustata compoziţia fazei mobile pana la îndeplinirea cerintei. - factorul de asimetrie A(s) al tuturor picurilor obţinute trebuie sa fie cuprins într-un interval de la 0,9 pana la 1,5. (pentru definirea factorului de asimetrie A(s,) vezi figura 2). Pentru a înregistra cromatograma pentru determinarea factorului de asimetrie se recomanda o viteza de înregistrare a graficului hârtiei de cel puţin 2 cm/minut. Figura 2 Factor de asimetrie a picului - trebuie sa se obţină o linie de baza continua. 6. CALCUL Se folosesc suprafeţele picurilor analitilor pentru a calcula concentraţia (concentraţiile) analitului (analitilor) în proba. Se calculeza concentraţia analitului în proba, ca procent masic (x(i)), folosind următoarea formula:
b(i) x 100
x(i)% (m/m) = ──────────
RF(i) x a
în care: a = masa probei în grame, si b(i) = suprafaţa picului analitului "i" în proba 7. REPETABILITATE (ISO 5725) 7.1. Pentru un conţinut de hidrochinona de 2,0%, diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,13%. 7.2. Pentru un conţinut de monometileter hidrochinona de 1,0%, diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,1%. 7.3. Pentru un conţinut de monoetileter hidrochinona de 1,0%, diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,11%. 7.4. Pentru un conţinut de monobenzileter hidrochinona de 1,0%, diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate în paralel pe aceeaşi proba nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,11%. 8. REPRODUCTIBILITATE (ISO 5725) 8.1. Pentru un conţinut de hidrochinona de 2,0% diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate pe aceeaşi proba dar în condiţii diferite (laboratoare diferite, operatori diferiţi, aparatura diferita si/sau moment diferit) nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,37%. 8.2. Pentru un conţinut de monometileter hidrochinona de 1,0% diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate pe aceeaşi proba dar în condiţii diferite (laboratoare diferite, operatori diferiţi, aparatura diferita si/sau moment diferit) nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,21%. 8.3. Pentru un conţinut de monoetileter hidrochinona de 1,0% diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate pe aceeaşi proba dar în condiţii diferite (laboratoare diferite, operatori diferiţi, aparatura diferita si/sau moment diferit) nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,19%. 8.4. Pentru un conţinut de monobenzileter hidrochinona de 1,0% diferenţa dintre rezultatele a doua determinări efectuate pe aceeaşi proba dar în condiţii diferite (laboratoare diferite, operatori diferiţi, aparatura diferita si/sau moment diferit) nu trebuie sa depăşească o valoare absolută de 0,11%. 9. OBSERVAŢII 9.1. Când se intalneste un conţinut de hidrochinona considerabil mai mare decât 2% şi este necesară o estimare precisa a conţinutului, extractul proba (5.1) trebuie sa fie diluat la o concentraţie similară cu cea care ar fi obţinută dintr-o proba conţinând 2% hidrochinona, şi determinarea repetată. (Pentru unele instrumente absorbanta poate depăşi limitele de detectare pentru concentraţii înalte de hidrochinona). 9.2. Interferente Metoda descrisă mai sus permite determinarea hidrochinonei şi a eterilor săi într-un singur ciclu izocratic. Folosirea coloanei de fenil asigura o retenţie suficienta pentru hidrochinona, care nu poate fi garantată când este folosită o coloana C18 cu faza mobila descrisă. Oricum, aceasta metoda este predispusa la interferente din cauza unui număr de parabeni (derivaţi parabenzenici). In aceste cazuri determinarea trebuie repetată cu un sistem diferit faza mobila/faza stationara. Metode adecvate pot fi găsite în lucrările de referinţa 1 şi 2, şi anume: Coloana: Zorbax ODS, 4,6 mm x 25 mm, sau echivalent: temperatura: 36°C debit: 1,5 ml/min faza mobila, pentru: hidrochinona: metanol/apa 5/95 (V/V) monometileter hidrochinona: metanol/apa 30/70 (V/V) monobenzileter hidrochinona: metanol/apa 80/20 (V/V)*1) Coloana: Spherisorb S5-ODS, sau echivalent: faza mobila: apa/metanol 90/10 (V/V) debit: 1,5 ml/min Aceste condiţii sunt adecvate pentru hidrochinona*2).------------ *1) M. Herpol-Borremans et M.-O. Masse, Identification et dosage de l'hydroquinone et de şes ethers methylique et benzylique dans les produits cosmetiques pour blanchir la peau. Int. J. Cosmet. Sci. 8-203-214 (1986). *2) J. Firth and I. Rix, Determination of hydroquinone în skin toning creams, Analyst (1986), 111, p. 129. ANEXA 39 METODA DE IDENTIFICARE SI DETERMINARE CANTITATIVĂ PENTRU 2-FENOXIETANOL, 1-FENOXIPROPAN-2-OL, SI 4-HIDROXIBENZOAT DE: METIL, ETIL, PROPIL, BUTIL SI BENZIL A. IDENTIFICARE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICARE Aceasta metoda reglementează identificarea şi determinarea 2-fenoxietanolului, 1-fenoxipropan-2-olului, metil 4-hidroxibenzoatului, etil 4-hidroxibenzoatului, propil 4-hidroxibenzoatului, butil 4-hidroxibenzoatului şi benzil 4-hidroxibenzoatului din produsele cosmetice. 2. PRINCIPIU Conservantii sunt extrasi din probele pentru testare acidulate cu acetona. După filtrare, soluţia de acetona este amestecata cu apa si, într-un mediu alcalin, acizii grasi precipita sub forma sarurilor lor de calciu. Amestecul alcalin acetona/apa este extras cu dietileter pentru a îndepărta substanţele lipofile. După acidulare conservantii sunt extrasi cu dietileter. O porţiune din extractul dietileteric este pipetat pe o placa cromatografica cu silicagel pentru analiza cromatografica în strat subtire. După developarea placii, cromatograma obţinută este examinata în lumina UV şi vizualizata prin utilizarea reactivului Millon. 3. REACTIVI 3.1. Generalitati Toţi reactivii utilizaţi vor fi de puritate analitica. Apa va fi apa distilata sau apa de cel puţin aceeaşi puritate. 3.2. Acetona 3.3. Dietileter 3.4. n-Pentan 3.5. Metanol 3.6. Acid acetic, glacial 3.7. Soluţie acid clorhidric, c (HCl) = 4 mol/l 3.8. Soluţie hidroxid de potasiu, c (KOH) = 4 mol/l 3.9. Clorura de calciu dihidratata [CaCl(2) ● 2H(2)O] 3.10. Reactiv de detectare: reactiv Millon Reactivul Millon (Azotat de mercur (II)) este o soluţie gata preparata, care este disponibilă pentru comercializare (Fluka 69820) 3.11. 2-Fenoxietanol 3.12. 1-Fenoxipropan-2-ol 3.13. Metil 4-hidroxibenzoat (metilparaben) 3.14. Etil 4-hidroxibenzoat (etilparaben) 3.15. n-Propil 4-hidroxibenzoat (propilparaben) 3.16. n-Butil 4-hidroxibenzoat (butilparaben) 3.17. Benzii 4-hidroxibenzoat (benzilparaben) 3.18. Soluţii de referinţa Se prepara câteva soluţii 0,1% (m/v) din fiecare din substanţele de referinţa 3.11, 3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.16, 3.17 în metanol. 3.19. Solvent de developare (migrare) Se amesteca 88 volume n-pentan (3.4.) cu 12 volume acid acetic glacial (3.6.) 4. APARATURA Echipament obişnuit de laborator, si: 4.1. Baie de apa, capabilă de menţinerea unei temperaturi de 60°C 4.2. Cuva de developare (necaptusit cu hârtie de filtru) 4.3. Sursa de lumina UV, 254 nm 4.4. Plăci pentru analiza cromatografica în strat subtire CSS, 20 cm x 20 cm gata preparate cu 0,25 mm silicagel 60 F(2 5 4), cu zona concentrare (Merck No. 11798, Dermstadt, sau echivalent) 4.5. Etuva, capabilă de menţinerea unei temperaturi pana la 105°C 4.6. Uscator cu aer fierbinte pentru par 4.7. Role pentru vopsit imbracate în material textil (lâna), de lungime aproximativ 10 cm şi diametru exterior aproximativ 3,5 cm. Grosimea stratului de material textil va fi de 2 pana la 3 mm. Dacă este necesar, lâna se ajustează (se netezeste prin tăiere). Vezi nota de la 5.2. 4.8. Tuburi de sticla de 50 ml, cu dop rodat 4.9. Plita cu încălzire electrica, cu regulator termostatic de temperatura. Fixarea temperaturii: aprox. 80°C. Plita va fi acoperită cu o placa de aluminiu de 20 x 20 cm şi o grosime de aprox. 6 mm, pentru a obţine o distribuţie uniforma de temperatura. 5. PROCEDEU 5.1. Prepararea probei Într-o eprubeta de sticla cu dop rodat de 50 ml se cântăreşte cca. 1 g de proba (4.8). Se adauga patru picaturi soluţie acid clorhidric (3.7.) şi 40 ml de acetona. Pentru produsele cosmetice cu caracter puternic bazic, cum ar fi sapunul de toaleta, se vor adauga 20 de picaturi soluţie acid clorhidric. Se închide eprubeta de sticla, se incalzeste lent amestecul pana la cca. 60°C pentru a uşura extragerea conservantilor în faza de acetona şi se agita puternic timp de un minut. Se măsoară pH-ul soluţiei cu hârtie indicatoare de pH şi se corectează pH-ul soluţiei < = 3 cu soluţie acid clorhidric. Se agita din nou, puternic, timp de un minut. Se raceste soluţia la temperatura camerei şi se filtreaza prin hârtie de filtru într-un vas conic din sticla. Se transfera 20 ml din filtrat într-un vas conic de 200 ml, se adauga 60 ml apa şi se omogenizeaza. Se corectează pH-ul amestecului la aprox. 10 cu hidroxid de potasiu (3.8.), folosind hârtie indicatoare de pH. Se adauga 1 g clorura de calciu cristalizatata cu 2 molecule de apa (3.9.) şi se agita puternic. Se filtreaza soluţia prin hârtie de filtru într-o palnie de separare de 250 ml conţinând 75 ml dietileter şi se agita puternic timp de un minut. Se lasa ca fazele sa se separe şi se colectează stratul apos într-un vas conic de 200 ml. Se regleaza pH-ul soluţiei la aprox. 2, cu soluţie de acid clorhidric, folosind hârtie indicatoare de pH. Ulterior, se adauga 10 ml dietileter şi se agita puternic timp de un minut. Se lasa ca fazele sa se separe şi se transfera cca. 2 ml din stratul dietileteric într-o fiola de păstrare a probei de 5 ml. 5.2. Cromotografiere în strat subtire (CSS) Se pune o placa CSS (4.4) pe placa de aluminiu incalzita (4.9.). Se pipeteaza 10 æl din fiecare dintre soluţiile de referinţa (3.18.) şi 100 æl de soluţie de proba (5.1.) pe linia de început a zonei concentrare a placii CSS. Dacă se doreşte, se poate folosi un curent de aer care va facilita evaporarea solventului. Se indeparteaza placa CSS de pe plita şi se lasa sa se raceasca la temperatura camerei. Se transvazeaza 100 ml solvent de developare (3.19.) într-o cuva de developare (4.2.). Se pune imediat placa CSS în cuva în care solventul este sub punctul de saturatie, se developeaza la temperatura camerei pana când frontul de solvent a migrat aprox. 15 cm fata de linia de baza. Se indeparteaza placa din cuva de developare şi se usucă într-un curent de aer fierbinte cu ajutorul unui uscator cu aer fierbinte pentru par. Se examinează placa în lumina UV (4.3.) şi se marchează poziţia spoturilor. Se incalzeste placa timp de 30 minute într-o etuva (4.5.) la 100°C pentru a îndepărta excesul de acid acetic. Se vizualizeaza conservantii pe cromatograma cu ajutorul reactivului Millon, prin inmuierea în reactiv a rolelor pentru vopsire şi rularea lor peste placa CSS pana la inmuierea uniforma. Nota: ----- Ca alternativa, spoturile pot fi vizualizate în lumina UV prin aplicarea cu grija a unei picaturi din reactivul Millon pe fiecare spot marcat sub lumina UV. Esterii acidului 4-hidroxibenzoic apar ca spoturi roşii, 2-fenoxietanolul şi 1-fenoxipropan-2-olul apar ca spoturi galbene. De remarcat ca acidul 4-hidroxibenzoic însuşi, care poate fi prezent în proba pentru testare drept conservant sau ca produs de descompunere al derivatilor hidroxiparabenzoatici (parabeni), va aparea de asemenea ca un spot roşu. (vezi 7.3. şi 4.4). 6. IDENTIFICARE Se calculează valoarea Rf pentru fiecare spot. Se compara spoturile obţinute pentru soluţia proba cu acelea ale soluţiilor de referinţa, ţinând cont de valorile Rf, de comportamentul lor sub radiatiile ultraviolete şi de culoarea lor după vizualizare. Se trag concluziile preliminare asupra identităţii conservantilor. Dacă se constata prezenta derivatilor parabenici, trebuie efectuat procedeul de cromatografiere de lichide de înalta performanta HPLC, descris la capitolul B. Se combina rezultatele obţinute prin CSS şi HPLC pentru a confirma prezenta a 2-fenoxietanolului, a 1-fenoxipropan-2-olului şi a derivatilor parabenici. 7. OBSERVAŢII 7.1. Din cauza toxicitatii reactivului Millon, acest reactiv se aplica cel mai bine prin una dintre procedeele descrise. Nu este recomandată pulverizarea. 7.2. Alţi compuşi conţinând grupări hidroxil pot de asemenea colora reactivul Millon. Un tabel de culori şi de valori Rf obţinute pentru un număr de conservanţi folosind procedeul CSS se poate găsi in: N. de Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A. Pranato-Soetardhi şi A. Schouten (1987): Determination of preservatives în cosmetic products I: Thin-layer chromatographic procedure for the identification of preservatives în cosmetic products (J. Chromatography 410, 395-411). 7.3. Valorile Rf prezentate în următorul tabel servesc ca indicaţie a valorilor care pot fi obţinute.
──────────────────────────────────────
Compus hRf Culoare
──────────────────────────────────────
acid 4-hidroxibenzoic 11 roşu
metilparaben 12 roşu
etilparaben 17 roşu
propilparaben 21 roşu
butilparaben 26 roşu
benzilparaben 16 roşu
2-fenoxietanol 29 galben
1 -fenoxipropan-2-ol 50 galben
──────────────────────────────────────
7.4. Nu se obţine nici o separare pentru acidul 4-hidroxibenzoic şi metilparaben, sau pentru benzilparaben şi etilparaben. Identificarea acestor compuşi trebuie confirmată prin realizarea metodei HPLC descrisă în capitolul B şi compararea timpilor de retenţie obţinuţi pentru proba cu cei ai standardelor. B. DETERMINARE 1. SCOP SI DOMENIU DE APLICAŢIE Metoda stabileşte determinarea 2-fenoxietanolului, 1-fenoxipropan-2-olului, metil 4-hidroxibenzoatului, etil 4-hidroxibenzoatului, propil 4-hidroxibenzoatului, butil 4-hidroxibenzoatului şi benzil 4-hidroxibenzoatului din produsele cosmetice. 2. DEFINIŢIE Cantităţile de conservanţi determinate prin aceasta metoda sunt exprimate ca procente de masa. 3. PRINCIPIU Proba pentru testare este acidulata prin adăugarea de acid sulfuric şi apoi transformata în suspensie suspendată într-un amestec de etanol şi apa. După încălzirea uşoară a amestecului pentru topirea fazei lipidice, pentru a determina extracţia cantitativă, amestecul este filtrat. Conservantii din filtrat sunt determinaţi cu ajutorul metodei HPLC cu faza inversa utilizând ca standard intern izopropil 4-hidroxibenzoat. 4. REACTIVI 4.1. Generalitati Toţi reactivii trebuie sa fie de puritate analitica şi compatibili cu HPLC. Apa va fi apa distilata, sau apa de calitate cel puţin egala 4.2. Etanol, absolut. 4.3. 2-Fenoxietanol 4.4. 1-Fenoxipropan-2-ol. 4.5. Metil 4-hidroxibenzoat (metilparaben) 4.6. Etil 4-hidroxibenzoat (etilparaben) 4.7. n-Propil 4-hidroxibenzoat (propilparaben) 4.8. Izopropil 4-hidroxibenzoat (izopropilparaben) 4.9. n-Butil 4-hidroxibenzoat (butilparaben) 4.10. Benzii 4-hidroxibenzoat (benzilparaben) 4.11. Tetrahidrofuran 4.12. Metanol 4.13. Acetonitril 4.14. Soluţie acid sulfuric c [H(2)SO(5)] = 2 mol/l 4.15. Amestec etanol/apa Se amesteca noua volume de etanol (4.2) şi un volum de apa. 4.16. Soluţie standard intern Se cântăreşte cu precizie 0,25 g izopropilparaben (4.8), se transfera într-un balon cotat de 500 ml, se dizolva şi se aduce la semn cu amestec etanol/apa (4.15). 4.17. Faza mobila: amestec tetrahidrofuran/apa/metanol/acetonitril. Se amesteca 5 volume tetrahidrofuran, 60 volume de apa, 10 volume de metanol şi 25 volume de acetonitril. 4.18. Soluţie stoc de conservant Într-un balon cotat de volum 100 ml se cantaresc cu precizie de trei zecimale aproximativ 0,2 g 2-fenoxietanol, 0,2 g 1-fenoxipropan-2-ol, 0,05 g metilparaben, 0,05 g etilparaben, 0,05 g propilparaben, 0,05 g butilparaben şi 0,025 g benzilparaben, se dizolva şi se aduce la semn cu amestec etanol/apa. Pastrata în frigider soluţia este stabilă timp de o saptamana. 4.19. Soluţii standard de conservant Din soluţia stoc (4.18) se transfera în cinci baloane cotate de 50 ml, 20,00 ml, 10,00 ml, 5,00 ml, 2,00 ml şi respectiv 1,00 ml. In fiecare balon, se adauga 10,00 ml soluţie standard intern (4.16) şi 1,0 ml soluţie acid sulfuric (4.14) şi se aduce la semn cu amestec etanol/apa. Aceste soluţii trebuie sa fie proaspăt preparate. 5. APARATURA Echipament normal de laborator, si: 5.1. Baie de apa, capabilă de menţinerea temperaturii 60°C § 1°C. 5.2. Cromatograf de lichide de înalta performanta cu detector UV, lungime de unda 280 nm. 5.3. Coloana analitica: Oţel inoxidabil, 25 cm x 4,6 mm diametru interior (sau 12,5 cm x 4,6 mm diametru interior), umpluta cu Nucleosil 5C18, sau echivalent (vezi 10.1). 5.4. Eprubete de sticla cu dop rodat de 100 ml. 5.5. Cioburi fine de portelan pentru fierbere, carborund, de dimensiuni 2 mm pana la 4 mm, sau echivalent. 6. PROCEDEU 6.1. Prepararea probei pentru testare 6.1.1. Prepararea probei pentru testare fără adaos de standard intern Într-o eprubeta de sticla cu dop rodat de 100 ml se cântăreşte cca. 1,0 g proba. Se adauga cu pipeta în eprubeta 1,0 ml soluţie acid sulfuric (4.14) şi 50,0 ml amestec etanol/apa (4.15). Se adauga 1 g cioburi fine de portelan (sau de carborund) pentru fierbere (5.5), se închide eprubeta şi se agita puternic pana la obţinerea unei suspensii omogene. Se agita cel puţin un minut. Se introduce eprubeta timp de cinci minute într-o baie de apa (5.1) menţinută la 60°C § 1°C pentru a facilita extracţia conservantilor în faza de etanol. Eprubeta se raceste imediat într-un curent de apa rece şi se depozitează extractul în frigider timp de o ora. Se filtreaza extractul folosind hârtie de filtru. Se transfera cca. 2 ml filtrat într-o fiola de probe de 5 ml. Se depozitează extractele în frigider şi se efectuează cromatografierea de lichide de înalta performanta HPLC într-un interval de 24 ore. 6.1.2. Prepararea probei pentru testare incluzând adaosul de soluţie standard intern Într-o eprubeta de sticla cu dop rodat de 100 ml se cântăreşte cu precizie la a treia zecimala 1,0 g § 0,1 g de proba. Se pipeteaza în eprubeta 1,0 ml soluţie acid sulfuric şi 40,0 ml amestec etanol/apa. Se adauga aproximativ 1 g de cioburi fine de portelan pentru fierbere (5.5.) şi exact 10,00 ml de soluţie standard intern. Se închide eprubeta şi se agita puternic pana la obţinerea unei soluţii omogene. Se agita timp de cel puţin un minut. Se introduce eprubeta pentru cinci minute într-o baie de apa (5.1) menţinută la temperatura de 60°C § 1°C pentru a facilita extracţia conservantilor în faza de etanol. Se raceste imediat eprubeta într-un curent de apa rece şi se depozitează extractul în frigider pentru o ora. Se filtreaza extractul folosind hârtie de filtru. Se pipeteaza cca. 2 ml filtrat într-o fiola de proba de 5 ml (soluţie de testare). Se depozitează în frigider şi se efectuează cromatografierea de lichide de înalta performanta HPLC în interval de 24 ore. 6.2. Cromatografiere de lichide de înalta performanta (HPLC) 6.2.1. Condiţii pentru cromatografiere - Faza mobila: amestec tetrahidrofuran/apa/metanol/acetonitril (4.17); - Debit: 1,5 ml/minut - Lungime de unda a detectiei: 280 nm. 6.2.2. Etalonare Se injecteaza 10 æl din fiecare dintre soluţiile standard de conservant (4.19). Din cromatogramele obţinute se determina rapoartele picurilor soluţiilor standard de conservant şi înălţimea picului pentru standardul intern. Se traseaza o curba pentru fiecare conservant punând în relatie aceste rapoarte cu concentraţiile soluţiilor standard. 6.2.3. Determinare Se injecteaza 10 æl soluţie proba fără standard intern (6.1.1) în cromatograf şi se înregistrează cromatograma. Se injecteaza 10 æl din una dintre soluţiile standard de conservanţi (4.19) şi se înregistrează cromatograma. Se compara cromatogramele obţinute. Dacă, în cromatograma extractului probei pentru testare (6.1.1), nu apare nici un pick având aproximativ acelaşi timp de retenţie ca isopropilparabenul (standardul intern recomandat), se continua prin injectarea a 10 æl din proba pentru testare cu soluţie standard intern (6.1.2). Se înregistrează cromatograma şi se măsoară inaltimile pickurilor. Dacă se observa un pick ce interfera în cromatograma probei pentru testare având aproximativ acelaşi timp de retenţie ca izopropilparabenul, trebuie selectata alta soluţie standard intern. Dacă unul din conservantii aflaţi în examinare este absent în cromatograma probei pentru testare, acest conservant poate fi utilizat ca o alternativa de standard intern. Se calculează rapoartele dintre inaltimile pickurilor conservantilor investigati funcţie de înălţimea pickului soluţiei standard intern. Se urmăreşte ca pentru soluţiile standard folosite în procedura de etalonare sa se obţină un răspuns linear. Se asigura dacă cromatogramele obţinute pentru soluţia standard şi soluţia probei pentru testare respecta următoarele cerinţe: - separarea pickului în cazul perechii cel mai puţin separate este de cel puţin 0,90 (pentru definiţia separarii pickului, vezi figura 1) Figura 1 Separarea picului Dacă nu se realizează separarea cerută, trebuie folosită o coloana mai eficienta sau trebuie corectată compoziţia fazei mobile pana se atinge separarea cerută. - factorul de asimetrie A(s) al tuturor pickurilor obţinute trebuie sa fie cuprins într-un interval de la 0,9 pana la 1,5 (pentru definirea factorului de asimetrie A(s), vezi figura 2). Pentru a înregistra cromatograma în vederea determinării factorului de asimetrie se recomanda o viteza de înregistrare a graficului de cel puţin 2 cm/minut. Figura 2 Factor de asimetrie a picului - Trebuie sa se obţină o linie de baza continua. 7. CALCUL Pentru a calcula concentraţia conservantilor în proba pentru testare se folosesc curba de etalonare (6.2.2.) şi rapoartele inaltimii pickurilor conservantilor examinaţi cu înălţimea pickului standardului intern. Se calculează conţinutul de 2-fenoxietanol, 1-fenoxipropan-2-ol, metil 4-hidroxibenzoat, etil 4-hidroxibenzoat, propil 4-hidroxibenzoat, butil 4-hidroxibenzoat şi benzil 4-hidroxibenzoat, ca procent de greutate (% m/m), folosind formula următoare:
b(i)
% W(i) (m/m) = ───────
200 x a
în care: b(i) = concentraţia (æg/ml) conservantului "i" în proba pentru testare asa cum este citită din curba de etalonare; si a = masa (g) probei pentru testare 8. REPETABILITATE (ISO 5725) Vezi observaţiile 10.5. 9. REPRODUCTIBILITATE (ISO 5725) Vezi observaţiile 10.5. 10. OBSERVAŢII 10.1. Faza stationara Comportamentul în privinţa retentiilor soluţiilor în determinarile HPLC este puternic dependent de tipul, calitatea şi evoluţia fazei staţionare. Din rezultatele obţinute pentru soluţiile standard (vezi observaţii 6.2.3.) se poate concluziona dacă o coloana poate fi folosită pentru separarea conservantilor examinaţi, în plus fata de materialul propus pentru umplutura coloanei, s-a descoperit ca sunt, adecvate de asemenea şi Hypersil ODS şi Zorbax ODS. Alternativ, compoziţia fazei mobile recomandate poate fi imbunatatita în vederea obţinerii separarii cerute. 10.2. Lungime de unda de detecţie Un test dur asupra metodei descrise, a arătat ca o mica schimbare a lungimii de unda de detecţie poate avea un efect major asupra rezultatelor determinării. De aceea, acest parametru trebuie controlat cu atenţie pe durata analizelor. 10.3. Interferente In condiţiile descrise pentru aceasta metoda, pot fi de asemenea eluati mulţi alţi componenţi, cum ar fi conservantii şi aditivii cosmetici. Timpii de retenţie ai unui mare număr de conservanţi menţionaţi în ORDINUL MSF nr. 1004/2000 sunt listati in: "N. de Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A. Pranato-Soetardi şi A. Schouten, (1989): Determination of preservatives în cosmetic products II. High-performance liquid chromatographic identification. (J. Chromatography 469, 317-398)". 10.4. Pentru protejarea coloanelor analitice poate fi folosită o coloana de siguranţa adecvată. 10.5. Metoda a fost cercetata într-un test de colaborare la care au participat noua laboratoare. Au fost analizate trei probe pentru testare. La fiecare dintre cele trei probe, pentru analitii continuţi, valorile medii ale concentraţiei, exprimate în % m/m (m), repetabilitatile (r) şi reproductibilitatile (R) sunt date în tabelul următor:
────────────┬─┬───────┬───────┬───────┬────────┬────────┬────────┬────────
Mostra │ │-feno │ Metil-│Etil- │Propil │Butil │Benzil │
│ │xieta │paraben│paraben│paraben │paraben │paraben │
│ │nol │ │ │ │ │ │
│ │-feno │ │ │ │ │ │
│ │ xi │ │ │ │ │ │
│ │pro │ │ │ │ │ │
│ │pan │ │ │ │ │ │
────────────┼─┼───────┼───────┼───────┼────────┼────────┼────────┼────────
Crema │m│ 1,124 │ │ 0,250 │ 0,0628 │ 0,031 │ 0,0906 │
vitaminizata│r│ 0,016 │ │ 0,018 │ 0,0035 │ 0,0028 │ 0,0044 │
│R│ 0,176 │ │ 0,030 │ 0,0068 │ 0,0111 │ 0,0034 │
────────────┼─┼───────┼───────┼───────┼────────┼────────┼────────┼────────
Crema de zi │m│ 1,196 │ │ 0,266 │ 0,076 │ │ │
│r│ 0,040 │ │ 0,003 │ 0,002 │ │ │
│R│ 0,147 │ │ 0,022 │ 0,004 │ │ │
────────────┼─┼───────┼───────┼───────┼────────┼────────┼────────┼────────
Crema de │m│ │ 0,806 │ │ │ 0,180 │ 0,148 │ 0,152
masaj │r│ │ 0,067 │ │ │ 0,034 │ 0,013 │ 0,015
│R│ │ 0,112 │ │ │ 0,078 │ 0,012 │ 0,016
────────────┴─┴───────┴───────┴───────┴────────┴────────┴────────┴────────
-------- 
